Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

Das übergeordnete Ziel dieses durch Hitzeschock induzierten Proteinexpressionssystems ist es, die anti-apoptotische Aktivität von Proteinen in zwei potenziell funktionell antagonistischen Proteinen in Insektenzellen zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu den Funktionen und Aktivitäten von Kandidatenproteinen in der Biotechnologie und Proteomik zu beantworten, wie z. B. ihre anti-apoptotischen Aktivitäten und Proteininteraktionen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Zeitpunkt der Genexpression durch die Induktion eines Hitzeschocks gesteuert wird.

Diese Methode kann also einen Einblick in den funktionellen Status von Proteinen geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Proteinexpression von Säugetieren. Die in diesem Protokoll verwendeten Insektenzellen Spodoptera frugiperda oder Sf9 werden in Zellkulturmedium in 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturflaschen bei 28 Grad Celsius gezüchtet.

Schütteln Sie den Zellkulturkolben, um die Zellen vom Kolben zu lösen. Überprüfen Sie dann unter einem Lichtmikroskop, ob etwa 80 % der Zellen abgelöst sind. 50 % der Zellsuspension werden in einen neuen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben überführt und die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur anheften lassen.

Ersetzen Sie das Medium nach 15 Minuten durch fünf Milliliter frisches Nährmedium und züchten Sie es in einem Inkubator bei 28 Grad Celsius. Je nach Zellwachstum passieren die Zellen alle zwei bis drei Tage. Vor der Ernte der Sf9-Zellen ist es wichtig, die Zellen unter dem Lichtmikroskop zu überprüfen, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination durch Bakterien oder andere Mikroorganismen gibt.

Um die Sf9-Zellen zu ernten, schütteln Sie den Kulturkolben, um die Zellen zu lösen, und geben Sie dann die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie mit einer P10-Pipette 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämazytometer und zählen Sie die Zellzahl unter dem Lichtmikroskop. Dreimal 10 bis fünfte Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.

Ersetzen Sie das Medium nach 15 Minuten durch 0,5 Milliliter Beschichtungsmedium. Bereiten Sie den Zelltransfektionsregenten vor. Für jede Transfektion werden acht Mikroliter des Zelltransfektionsreagenzes mit 100 Mikrolitern serumfreiem Zellkulturmedium verdünnt und eine Sekunde lang mit einem Vortex vermischt

In dieser Studie werden drei verschiedene Trunkierungen des bakuloviralen Gens, des Inhibitors von Apoptose 3 oder IAP3, unter der Kontrolle des Drosophila-Hitzeschock-70-Promotors, des IAP3 in voller Länge, einer Trunkierung ohne die RING-Domäne und einer Trunkierung ohne die BIR-Domäne exprimiert. Geben Sie zwei Mikrogramm jeder Plasmid-DNA in 100 Mikroliter serumfreies Zellkulturmedium und mischen Sie es durch Vortexen für eine Sekunde. Bereiten Sie auch eine Positivkontrolle vor.

Kombinieren Sie die verdünnte Plasmid-DNA und das verdünnte Zelltransfektionsreagenz und mischen Sie durch Vortexen. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie mit einer P1000-Pipette 210 Mikroliter jeder DNA-Transfektionsreagenzmischung tropfenweise auf die Zellen.

Inkubieren Sie fünf Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach fünf Stunden das Beschichtungsmedium durch 0,5 Milliliter Zellkulturmedium und verschließen Sie dann die 24-Well-Platte mit Klebeband. Inkubieren Sie bei 28 Grad.

Am folgenden Tag wird ein Hitzeschock durchgeführt, um die Proteinexpression zu induzieren, indem die Platte 30 Minuten lang in einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad schwimmt. Stellen Sie die 24-Well-Platte nach 30 Minuten wieder in den 28-Grad-Inkubator ein. Die Proteinexpression wird anschließend durch Western Blot bestätigt, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um die geninduzierte Zellapoptose zu untersuchen, bereiten Sie zunächst Sf9-Zellen vor, wie bereits gezeigt. Als nächstes transfizieren Sie die Zellen auf die gleiche Weise wie zuvor, schließen jedoch ein Mikrogramm eines Plasmids ein, das ein Apoptose-Induktor-Gen enthält, in jede Transfektionsreaktion. Inkubieren Sie fünf Stunden lang bei 28 Grad Celsius, tauschen Sie das Medium aus und inkubieren Sie 16 Stunden lang.

Hitzeschock der transfizierten Zellen bei 42 Grad Celsius für 30 Minuten. Inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 28 Grad Celsius, bevor Sie den Zellviabilitätstest durchführen. Für die chemisch induzierte Zellapoptose wird eins mal 10 der sechs Sf9-Zellen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte platte.

15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen und dann das Medium durch einen Milliliter Beschichtungsmedium ersetzen. Transfizieren Sie die Zellen mit vier Mikrogramm jeder Plasmid-DNA. Ersetzen Sie nach fünf Stunden das Beschichtungsmedium durch einen Milliliter Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Zellen 16 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.

Dann Hitzeschock bei 42 Grad Celsius für 30 Minuten. Inkubieren Sie die Zellen nach dem Hitzeschock fünf Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Behandeln Sie dann die transfizierten Zellen mit Actinomycin D, um die Apoptose zu induzieren.

Inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 28 Grad Celsius, bevor Sie den Zellviabilitätstest durchführen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die behandelten Zellen waschen. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung, fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und lassen Sie es eine Minute lang einwirken.

Waschen Sie die Zellen auf diese Weise dreimal mit PBS. Resuspendieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einem Milliliter PBS mit 04 % Trypanblau und färben Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen.

Übertragen Sie 10 Mikroliter der mit Trypanblau gefärbten Zellsuspension in ein Hämazytometer und zählen Sie die lebensfähigen intakten Zellen unter einem Lichtmikroskop. Führen Sie abschließend eine statistische Analyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Die volle Länge und zwei Trunkierungen von IAP3 aus Lymantria xylina MNPV wurden in Sf9-Zellen überexprimiert, und ein Western Blot wurde an Zelllysaten durchgeführt, um die Proteinexpression zu bestätigen.

Das anti-apoptotische Protein Ac-P35 wurde als Positivkontrolle eingeschlossen. Alle Proteine konnten in transfizierten Zellen entweder eine Stunde oder fünf Stunden nach dem Hitzeschock nachgewiesen werden, mit einer höheren Expression nach fünf Stunden. Dieses System kann angepasst werden, um die anti-apoptotische Aktivität zu bewerten.

Für die geninduzierte Zellapoptose wurde der Apoptose-Induktor Drosophila Reaper mit Zielgen-Plasmidkonstrukten in Sf9-Zellen co-transfiziert, die anschließend mit einem Hitzeschock geschockt wurden, um die Genexpression zu aktivieren. Im Vergleich zum Vektor Drosophila Reaper zeigte die Positivkontrolle eine hohe anti-apoptotische Aktivität von bis zu 80% der Viabilitätsrate. Die anderen Konstrukte zeigten unterschiedliche Effekte auf die anti-apoptotische Aktivität.

Für die chemisch induzierte Zellapoptose wurde nur ein Konstrukt in Sf9-Zellen transfiziert, und Actinomycin D wurde fünf Stunden nach dem Hitzeschock hinzugefügt. Im Vergleich zur Positivkontrolle bzw. der Negativkontrolle zeigten die anderen Konstrukte unterschiedliche Effekte auf die anti-apoptotische Aktivität. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Betriebsregeln der Zellkultur in laminarer Strömung zu befolgen und den Status der Zellen sorgfältig zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z. B. die Co-Immunpräzipitation, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob es eine Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen gibt, die in den Insektenzellen koexprimiert werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern im Bereich der Biotechnologie den Weg, um die Funktionen von Proteinen in tierischen oder Mikroorganismen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses System verwenden können, um fremde Proteine zu exprimieren oder potenziell funktionell antagonistische Proteine in Insektenzellen zu bewerten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einigen Chemikalien, wie Actinomycin D, extrem gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.