Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Injektionsvolumen sicher und genau in das linksventrikuläre Myokard des Kaninchenherzens zu verabreichen. Und um dies zu erreichen, nutzen Sie die perkutane Kontrast-Echokardiographie-Anleitung. Dies wird erreicht, indem zuerst das Tier betäubt und dann die Brust für den Eingriff vorbereitet wird.

Nachdem Sie das Kaninchen auf eine Wärmedecke gelegt und überprüft haben, ob ein EKG-Signal korrekt angezeigt wird, verwenden Sie ein klinisches Ultraschallsystem, um ein geeignetes akustisches Fenster zu erhalten und das Bild in einem weiten Sichtfeld zu optimieren. Dann, nachdem Sie die Spritze mit markierten Zellen beladen haben, die mit einem geeigneten Kontrastmittel gemischt sind, und unter Ultraschallkontrolle, richten Sie die Nadel vorsichtig gegenüber dem Schallkopf aus und positionieren Sie sie nahe an der Haut des linken Hemithorax, bevor Sie die Nadel langsam in die Zielregion des Myokards vorschieben. Schließlich wird das Injektor sicher abgegeben, wie die transmurale Hyperechogenität an der Injektionsstelle im echokardiographischen Bild zeigt.

Letztendlich wird die Ex-vivo-Bestätigung der erfolgreichen Verabreichung des Injektats durch das Vorhandensein von Farbstoff im Myokard demonstriert, während die immunhistochemische Querschnittsanalyse von Myokardgewebeschnitten verwendet wird, um die erfolgreiche Abgabe eines Zellmarkers und eines Farbstoffs in das Zielmyokard zu zeigen. Der Zweck dieses Videos ist es, zu demonstrieren, wie diese Technik sicher und genau durchgeführt werden kann, für unsere Möglichkeiten, am heutigen Kaninchen mit einem klinischen Echokardiographie-System. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die minimale und grundlegende Natur des Geräts und die Möglichkeit, eine echokardiographische Kontrastmittelführung für eine präzise Visualisierung der Zielinjektionsstellen zu verwenden, wodurch das Risiko einer versehentlichen Abgabe zwischen den Kammern auf ein Minimum reduziert wird.

Bevor Sie mit der intramyokardialen Injektion fortfahren, injizieren Sie zunächst eine Kombination aus Ketamin und Medetomidin, um das Tier zu betäuben. Wie gezeigt, bleibt das Kaninchen ruhig, wenn der Kopf mit einer OP-Decke bedeckt ist. Sobald das Tier betäubt ist, verwenden Sie einen Haarschneider, um die Haare von der Haut des Brustkorbs zu entfernen, beginnend unterhalb des Halses und dann in die subxiphoide Region.

Rasieren Sie zusätzliche Regionen von einem bis drei Zentimetern der Innenseite der rechten Vordergliedmaße sowie der medialen Tibiaregionen der rechten und linken Hintergliedmaßen. Tragen Sie dann ein geeignetes leitendes Gel auf die Elektroden auf und positionieren Sie diese in den rasierten Bereichen der Gliedmaßen. Befestigen Sie die Elektroden mit chirurgischem Klebeband, um einen Kontaktverlust beim Bewegen des Tieres während des Eingriffs zu verhindern.

Legen Sie das Tier anschließend auf eine Wärmedecke, überprüfen Sie, ob ein korrektes EKG-Signal auf dem Bildschirm des Systems angezeigt wird, halten Sie das Tier in einer Dekubitus-Rückenlage und lassen Sie das Tier spontan atmen, während Sie während des gesamten Eingriffs Sauerstoff über eine Gesichtsmaske verabreichen. Reinigen und desinfizieren Sie die rasierte Haut der Brust gründlich mit einer Lösung auf Chlorhexidinbasis. Um einen guten Hautkontakt mit dem Schallkopf aufrechtzuerhalten, Artefakte zu reduzieren und die allgemeine Bildqualität zu verbessern, tragen Sie eine ausreichende Menge Ultraschallgel auf den Schallkopf auf.

Platzieren Sie dann den Schallkopf manuell am vierten bis sechsten Interkostalraum zwei bis drei Zentimeter von der rechten parasternalen Linie entfernt und in einem Einfallswinkel des Ultraschallstrahls von etwa 90 Grad relativ zur Brustwand. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtungsmarkierung des Schallkopfs nach vorne zeigt, um die Ausrichtung mit der Nadel in den nachfolgenden Schritten zu erleichtern. Sie sollten eine parasternale Kurzachsenansicht des Herzens auf Höhe der Papillenmuskulatur erhalten.

Und es ist wichtig, ein weites Sichtfeld zu haben, indem man die Tiefe mit der entsprechenden Steuerung im System erhöht. Passen Sie bei Bedarf die Position des Schallkopfs relativ zum Interkostalraum sowie seinen anteroposterioren und dorsoventralen Winkel an, um das Bild zu optimieren, und identifizieren Sie dann in dieser Ansicht die rechtsventrikalische, RV, linksventrikalische, LV, interventrikuläre Septum, IVS, hintere Wand, PW sowie antero- und posteromediale papilläre Muskeln. Achten Sie in dieser Ansicht besonders auf ein symmetrisches Bild sowie auf eine angemessene Unterscheidung von endokardialen und epikardialen Verzerrungen und passen Sie sie gegebenenfalls durch Bildoptimierungssteuerungen wie z. B. Gain-Steuerung an.

Sobald die korrekte echokardiographische Ansicht erhalten ist, behalten Sie diese Position für den Rest des Eingriffs bei, während ein zweiter Bediener die intramyokardiale Injektion durchführt. Verwenden Sie dazu eine vorgeladene Spritze mit aufgesetzter Nadel, die in der Nähe der Haut des linken Hemithorax in einer symmetrischen Spiegelposition in Bezug auf den Schallkopf platziert wird. Richten Sie dann die Nadel manuell in einem Winkel von ca. 90 Grad an der Ausrichtungsmarkierung des Schallkopfs aus und schieben Sie die Nadel langsam durch die Haut in die Brusthöhle

Das perkutane Einführen der Nadel in dieser Position und Ausrichtung ermöglicht die Visualisierung der Nadel in der Ebene des Ultraschallstrahls, wodurch eine Echtzeitüberwachung und, falls erforderlich, eine Anpassung der Position der Nadel relativ zur Zielregion des Myokards ermöglicht wird, wie hier gezeigt. Beachten Sie in diesem Bild das Vorhandensein der Nadel in der linken Ventrikelkammer, dargestellt durch die Pfeilspitzen. Diese kann leicht neu positioniert werden, indem die Nadel sanft zurückgezogen und an die gewünschte Stelle neu positioniert wird.

Mit der Spitze an der Zielstelle geben Sie das Injektat langsam über einen Zeitraum von 20 bis 30 Sekunden ab, während Sie die Nadel langsam und sanft zurückziehen, um das Ausmaß des behandelten Myokards zu erhöhen. Nehmen Sie bei Bedarf subtile Änderungen des Einfallswinkels der Nadel vor, um die Injektionen an vier intramyokardialen Injektionsstellen abzuschließen. Eine im intraventrikulären Septum und drei in der linken ventrikulären freien Wand und liefern ein Volumen von 250 Mikrolitern Injektat pro Injektionsstelle.

Überwachen Sie nach Abschluss des Eingriffs weiterhin die echokardiographischen Scans des biseriellen Fensters des Kaninchens sowie die EKG-Aufzeichnungen, um sicherzustellen, dass keine Komplikationen infolge des Eingriffs aufgetreten sind, bis das Tier nach der Narkose vollständig wach ist. Die Verwendung einer 24-Stunden-Holter-EKG-Überwachung ist ratsam, um die Auswirkungen von intramyokardialen Injektionen auf den Herzrhythmus zu bestimmen. Unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls wurde, nachdem die intramyokardiale Positionierung der Nadelspitze durch Echokardiographie bestätigt und die Injektion eingeleitet wurde, eine transmurale Hyperechogenität während der Abgabe von Tusche an die Zielregion in dieser parasternalen Kurzachsenansicht, weiße Pfeilspitzen, beobachtet.

Kurz nach der Injektion wurde auch eine Hyperechogenität beobachtet, wie in dieser parasternalen Längsachsenansicht des Herzens zu sehen ist, wo ein echohelles Bild an den weißen Pfeilspitzen des interventrikulären Septums deutlich zu sehen ist. Als unmittelbar auf die intramyokardiale Injektion die Euthanasie folgte, waren Ablagerungen von Tusche bei der äußeren Untersuchung des Herzens deutlich sichtbar, wie in diesem Bild gezeigt. Schwarze Pfeilspitzen.

In ähnlicher Weise zeigten Herzgewebeschnitte auf der Ebene der Papillenmuskulatur transmurale Ablagerungen von Tusche in der freien Wand der linken ventrigen, schwarzen Pfeilspitzen, was eine effiziente und effektive Abgabe von Injektion in das Myokard zeigt. Auf demselben Bild war auch eine Ablagerung von Tusche am interventrikulären Septum zu sehen. Weißer Pfeil.

Obwohl der Eingriff im Allgemeinen gut vertragen wurde, war es sehr häufig, sowohl während als auch kurz nach dem Eingriff eine vorübergehende Beschleunigung oder Verlangsamung der Herzfrequenz zu beobachten, die mit isolierten vorzeitigen ventrikulären Kontraktionen, PVC, verbunden war. Tatsächlich zeigte die Überwachung mit einem 24-Stunden-Holter-EKG bei Tieren, die eine intramyokardiale Injektion mit Tusche erhielten, dass Arrhythmien sehr häufig waren und dass ihre relative Häufigkeit durch den zugrunde liegenden physiologischen Status des Tieres beeinflusst werden könnte. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für isoliertes PVC, die am häufigsten beobachtete Arrhythmie, die während der Holter-Überwachung entdeckt wurde.

Ein Vergleich zwischen einer Gruppe von Kaninchen mit normalem Phänotyp und einer Gruppe von Kaninchen, die acht Wochen lang intravenös Doxorubicin oder DOX, ein kardiotoxisches Krebsmedikament, erhielten. Vor der intramyokardialen Injektion mit Tusche zeigte sich, dass isolierte PVCs in der DOX-Gruppe signifikant häufiger auftraten. Andere Arrhythmien, die durch die Holter-EKG-Überwachung in beiden Gruppen festgestellt wurden, waren PVC-Couplets, PVC-Tripletts und nicht anhaltende ventrikuläre Tachykardie.

Während die mittlere Herzfrequenz in der Normal- und der DOX-Gruppe vergleichbar war, zeigte die Standardabweichung der normalen zu normalen Intervalle (R-zu-R-Intervalle) oder SDNN, ein Maß für die nichtlineare Dynamik in Bezug auf den Gesundheitszustand des Herzens, eine deutliche Verringerung in der mit Doxorubicin behandelten Gruppe. Vor dem Eingriff wurde die erfolgreiche Transfektion von verstärkten grün fluoreszierenden Proteinen, eGFP-positiv markierten Zellen, durch eine Fluoreszenzmikroskopie unter in vitro Zellkulturbedingungen bestätigt. Nach der intramyokardialen Injektion, auf die unmittelbar die Euthanasie folgte, wurde die erfolgreiche Verabreichung von eGFP-positiv markierten Zellen in das Myokard durch immunhistochemische Analyse von Herzgewebeschnitten nachgewiesen.

Wie in diesem Bild zu sehen ist, waren also reichlich markierte Zellen im Myokard vorhanden. Schwarze Pfeilspitzen, durchsetzt mit Tuscheablagerungen. Ablagerungen von Tusche und reichlich vorhandenen eGFP-positiven Zellen, weißen Pfeilspitzen, waren immer noch vorhanden, als die Euthanasie um 24 Stunden nach der intramyokardialen Injektion verzögert wurde.

Bemerkenswert ist, dass zu diesem Zeitpunkt eine akute Entzündungsreaktion beobachtet wurde, bei der Neutrophile das Myokard infiltrierten, rote Pfeile, was auf eine akute zelluläre Abstoßungsreaktion auf die transplantierten xenogenen Zellen hindeutet. Eine akute Entzündung wurde auch 24 Stunden nach intramyokardialer Injektion mit Tusche allein beobachtet. In diesem Fall waren jedoch die vorherrschenden Zellen, die das Myokard infiltrierten, Makrophagen.

Weiße Pfeilspitzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine perkutane intramyokardiale Injektion durchgeführt wird, die durch eine Kontrastechokardiographie in einem Kaninchenherz geleitet wird. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie innerhalb von 25 Minuten nach der Stasis durchgeführt werden.