Name: Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Erfahren Sie die subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten retinalen Pigmentepithelzellen zur Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Zellintegration mittels optischer Kohärenztomographie.

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Karolinska-Institut, die Kronprinzessin Margareta Stiftung für Sehgeschädigte, Edwin Jordan Foundation für ophthalmologische Forschung, die schwedische Eye Foundation, der König Gustav V Foundation, der ARMEC Lindeberg Stiftung und die Stiftung Cronqvist.

Das folgende Protokoll folgt die Tierbetreuung Richtlinien des Karolinska Instituet. Alle Tierversuche mit Neuseeland Albino Kaninchen (Table of Materials) von der regionalen Tier Ethikkommission (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) genehmigt worden (zulassen: Dnr 56/15). Die Verwendung von hESC (Dnr 2011/745-31/3) und die Übertragung und Bearbeitung von hESC-RPE (Dnr 2013/813-31/2) steht auch im Einklang mit den schwedischen Gesetzen und Vorschriften des Karolinska Institutet und genehmigt wurde, von der regionalen menschliche Ethik Komitee ( Regionala Etikprövningsnämnden ich Stockholm).
1. subretinale Injektion von Natrium Jodat (NaIO3) in einem Tiermodell mit großen Augen
<ol><li>Tiere durch intramuskuläre Verabreichung in den Oberschenkel mit einer Mischung aus 35 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung mit einer 30 G Spritze zu betäuben, und Schülerinnen und Schüler mit topischen Augentropfen mit einer Mischung aus Cyclopentolate und 2,5 % Phenylephrin 0,75 % dehnen. Richtige Anesthetization wird bestätigt, wenn das Tier nicht auf eine harte Prise seine hintere Bein reagiert.</li>
	<li>Legen Sie die Kaninchen unter dem Operationsmikroskop mit dem Kopf nach dem Chirurgen (Abbildung 1A). Verwenden Sie einen Deckel-Retraktor, um Augenlider und Nictitans Membran mit einem sterilen Tuch zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu entfernen. Verwendung ausgewogen Salzlösung (BSS), Trockenheit während Narkose in beiden Augen zu verhindern.</li>
	<li>
Für Mikrochirurgie, Verwendung einer 2-Port (oder optional 3-Port) 25 G Transvitreal pars Plana Technik mit nicht geschlossenen Trokare für das Einfügen von mikrochirurgischen Instrumenten (Abbildung 1 b). Multifunktions-Vitrektomie-Maschine verfügt über Anschlüsse, eine Infusion Kanüle, Endoillumination, Vitrector und Endolaser zu verbinden. Für subretinalen Injektionen ist nur die Endoillumination obligatorisch, wodurch eine 2-Port-Einstellung ausreichend. Legen Sie die Endoillumation durch den oberen linken Trokar und verwenden Sie den oberen rechten Trokar für die subretinale Injektionskanüle.
	<ol>
<li>Verwenden Sie für eine 3-Port-Konfiguration den unteren zeitlichen Trokar für die BSS-Infusion-Kanüle. Wenn optionale Instrumente (z. B. eine Vitrector) werden verwendet, fügen Sie sie durch den oberen rechten Trokar.</li>
		<li>Legen Sie die oberen 2 Trokare 1-2 mm aus dem Limbus mit krallenbewehrten Pinzette zu greifen und die Bindehaut über die Einstichstelle zu verdrängen.</li>
		<li>Stellen Sie sicher der Trokare sind eingefügte Transsclerally in einem parallelen Winkel von 30-45° Limbus, und fahren Sie bis zur Mitte der Spitze der den Trokar. Dann drehen Sie den Trokar 90° und voraus in das Auge, mit dem Ziel am hinteren Pol des Auges. Dieses Verfahren wird postoperative Leckage aus der Sclerotomies vermeiden und auch verringern das Risiko von Endophthalmitis (z. B. bakterielle Infektion im Auge). Siehe auch Abbildung 2 b für Trokar Positionen.</li>
		<li>Setzen Sie einen einmaligen Gebrauch flache Kontaktlinsen auf der Hornhaut, die Netzhaut, mit synthetischen Tränen als Kontaktgel zwischen Auge und Kontaktlinse (Abbildung 1A) zu visualisieren.</li>
		<li>Ziehen Sie 500 µL NaIO3 in eine 1 mL Spritze verbunden mit einem Verlängerungsrohr (betrieben von der Assistentin) und 38 G Polytip Kanüle (betrieben durch den Chirurgen).</li>
		<li>Fügen Sie der Endoillumination Sonde durch den oberen linken Trokar und die Injektionskanüle durch den oberen rechten Trokar ein und fördern Sie die Kanüle durch den gläsernen Raum in Richtung der Netzhaut, mit dem Ziel, für den Bereich direkt unterhalb des Sehnervenkopfes.</li>
		<li>Lassen Sie die Spitze der Kanüle, die Netzhaut langsam zu berühren, bis eine fokale Aufhellung sichtbar ist. Die Injektion selbst dringt die Netzhaut, zulassend subretinalen Lieferung. Lassen Sie sich nicht die Kanüle die Netzhaut zu durchdringen, da dies zu Blutungen führen kann.</li>
		<li>Injizieren Sie 50 µL NaIO3 subretinally über einen Zeitraum von 5 s. Da gibt es eine natürliche Spaltung Ebene zwischen der Netzhaut und der darunter liegenden Aderhaut, sollte eine deutlich sichtbare halbtransparenten Lungenblase allmählich während der Injektion bilden.</li>
		<li>Während der Injektion langsam zurückziehen der Nadelöhrs, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze innerhalb der Lungenblase Rückfluß zu minimieren eingehalten wird.</li>
		<li>Nach dem Entfernen der Kanüle Endoillumation und Injektion der Trokare mit krallenbewehrten Pinzette zu entfernen, und üben Sie leichten Druck für 30 s, um die selbstdichtenden Naht-weniger Sclerotomies mit der Spitze oder der stumpfen Ende der Zange.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Postoperativ geben Sie 10 mL Kochsalzlösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern. Geben Sie keine postoperative topische Steroide oder Antibiotika. Für Analgetika 0,5 mL Buprenorphin 0,3 mg/ml subkutan nach der Operation, als auch am Tag nach der Operation geben.</li>
	<li>Nach der Verwendung waschen alle Instrumente durch Eintauchen für ein paar Sekunden zunächst in 70 % igem Ethanol, zweitens in 45 % Ethanol, und schließlich in destilliertem Wasser. Richtig mit einem Papiertuch abtrocknen.</li>
	<li>Besuchen Sie Tiere, bis sie wieder genügend Bewusstsein und Sie sie alle einzelnen Tangotanzen legen. Auf Wunsch (z.B.Immunohistochemistry Zwecken) einschläfern von Tieren durch intravenöse Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Warten Sie 7 Tage mit der Transplantation von hESC-RPE-Zellen fortfahren.</li>
</ol>2. subretinalen Transplantationen von hESC-RPE-Zellen im behandelten Tiere
<ol><li>Verwalten Sie 2 mg (100 µL) der intravitrealen Triamcinolon bei narkotisierten Tieren mit einer 30 g Injektionsnadel 1-2 mm aus dem Limbus im unteren temporalen Quadranten 1 Woche vor der Transplantation hESC-RPE und neu verwalten sie alle 3 Monate. Achten Sie darauf die Spitze in Richtung der hinteren Pol des Auges, einen Objektiv-Touch zu vermeiden.</li>
	<li>Kultur eine hESC-RPE Monolage wie zuvor1beschrieben.</li>
	<li>Zelle Differenzierung Media (siehe Tabelle der Materialien) von einer 24-Well konfluierende hESC-RPE monomolekularen Film zu entfernen und waschen jeweils gut mit 500 µL PBS ohne Ca2 + und Mg2 +. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal, für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen.</li>
	<li>Überstand verwerfen, 500 µL von Trypsin pro Bohrloch hinzufügen und 12 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Die Platte kippen und vorsichtig Trypsin (Zellen sollte die Platte befestigt bleiben). Zellen in 800 µL frische 37 ° C vorgewärmte Differenzierung Medien durch sanfte pipettieren, oder sogar kratzen, wenn nötig, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, zu sammeln. Hinweis: Verwenden einer 40 µm-Sieb Zelle Zelle Klumpen eingehalten.</li>
	<li>Anzahl der Zellen in einer Hemocytometer-Kammer mit 0,2 % Trypan blau, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>5 mL Differenzierung Medien und Zentrifuge Zellen bei Raumtemperatur, 300 X g für 5 min zugeben.</li>
	<li>Überstand verwerfen und Pellet in frisch Filter sterilisiert PBS (durch eine 25 mm-Spritze-Filter geleitet), eine Endkonzentration von 1.000 Zellen/µL aufzuwirbeln.</li>
	<li>Aliquot der vorherigen Zellsuspension in 600 µL Aliquots und halten Sie auf dem Eis bis und während der Operation.</li>
	<li>Betäuben Sie Tiere durch intramuskuläre Verabreichung in den Oberschenkel mit einer Mischung aus 35 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung mit einer 30 G Spritze. Erweitern Sie Schülerinnen und Schüler mit topischen Augentropfen mit Amix von 0,75 % Cyclopentolate und 2,5 % Phenylephrin. Richtige Anesthetization wird bestätigt, wenn das Tier nicht auf eine harte Prise in seine hintere Bein reagiert.</li>
	<li>Legen Sie die Kaninchen mit dem Kopf nach dem Chirurgen. Verwenden Sie einen Deckel-Retraktor, um Augenlider und Nictitans Membran mit einem sterilen Tuch zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu entfernen. Verwenden Sie BSS Trockenheit während Narkose in beiden Augen zu verhindern.</li>
	<li>
Für Mikrochirurgie, Verwendung einer 2-Port (oder optional 3-Port) 25 G Transvitreal pars Plana Technik mit Trokare platziert in den gleichen Positionen wie in Schritt 1.3 und Abbildung 2beschrieben. Wenn die vorherigen Sclerotomies sichtbar sind, führen Trokar einführen angrenzend, aber nicht durch diese, zur Minimierung des Risikos von postoperativen Leckage.
	<ol>
<li>Setzen Sie einen einmaligen Gebrauch flache Kontaktlinsen auf der Hornhaut, die Netzhaut, mit synthetischen Tränen als Kontaktgel zwischen Auge und Kontaktlinse (Abbildung 1A) zu visualisieren.</li>
		<li>Injizieren Sie nach der richtigen Spitze Positionierung (siehe Schritte 1.3.5 und 1.3.6) 50 µL einer sanft gemischt hESC-RPE-Suspension (50.000 Zellen) subretinally. Ziel für die Mitte des Bereichs NaIO3 vorbehandelt zeichnet sich durch einen charakteristischen "metallic" Endo-Beleuchtung-Reflex. Die neurosensorische Netzhaut sollte trennen leicht schaffen eine deutlich sichtbar auf. Bündig die Nadel mit sterilen H2O dazwischen Kaninchen/nach verwenden, um die Nadel verstopfen durch Zelle zu vermeiden Klumpen. Änderung der Nadel bei Verstopfung wird bemerkt.</li>
		<li>Während der Injektion langsam zurückziehen der Nadelöhrs, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze innerhalb der Lungenblase Rückfluß zu minimieren eingehalten wird.</li>
		<li>Nach dem Entfernen der Kanüle Endoillumation und Injektion der Trokare mit krallenbewehrten Pinzette zu entfernen, und üben Sie leichten Druck für 30 s, um die selbstdichtenden Naht-weniger Sclerotomies mit der Spitze oder der stumpfen Ende der Zange.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Postoperativ geben Sie 10 mL Kochsalzlösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern. Geben Sie keine postoperative topische Steroide oder Antibiotika. Für Analgetika 0,5 mL Buprenorphin 0,3 mg/ml subkutan nach der Operation, als auch am Tag nach der Operation geben.</li>
	<li>Nach der Verwendung waschen alle Instrumente durch Eintauchen für ein paar Sekunden, zunächst in 70 % igem Ethanol, zweitens in 45 % Ethanol, und schließlich in destilliertem Wasser. Richtig mit einem Papiertuch abtrocknen.</li>
	<li>Besuchen Sie Tiere, bis sie wieder genügend Bewusstsein und Sie sie alle einzelnen Tangotanzen legen. Bei Bedarf (z.B. für Zwecke der Immunhistochemie) einschläfern von Tieren durch intravenöse Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital.</li>
</ol>3. in Vivo Retinal und subretinalen Imaging
<ol><li>
Spectral-Domain optische Kohärenz Tomographie (SD-OCT) Gerät mit der mitgelieferten Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), Cross-sectional b-Scans von den behandelten Tieren, laut Angaben des Herstellers zu erhalten. Um Bild Unschärfe zu vermeiden, achten Sie darauf, die Hornhaut feucht zu halten, durch alle 30-60 s mit topischen Kochsalzlösung spülen.
	<ol>
<li>Legen Sie den narkotisierten und Pupille Tiere (siehe Schritte 1.1 und 2.10) in eine verstellbare Halterung, einen ungehinderten Weg von der Lichtquelle Instrument der Kaninchen Netzhaut zu erhalten.</li>
		<li>Erhalten Sie mindestens 3 OCT Scans mit gleichzeitiger Infrarot-konfokalen scanning Laser Ophthalmoskopie (IR-cSLO) Reflexion Referenzbilder repräsentiert die oberen, mittleren und untere Teil der Injektionsbereich.</li>
		<li>De-Gesicht Fundus Bilder mit cSLO blau, grün, Infrarot- und mehrfarbigen laser Reflexion (d.h. mehrere gleichzeitige Laser-Farben), bzw. zu erhalten.</li>
		<li>Aufnahmen Sie blaues Licht Autofluoreszenz (BAF) Verwendung der Blaulicht-Laser-Fähigkeit des Gerätes SD-OCT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren keine konkurrierenden Interessen oder widersprüchliche Interessen.

In diesem Protokoll wird die Generation eines großen Augen Modells der GA und den präklinischen Einsatz für die Bewertung der hESC-RPE Integration in Vivo beschrieben.
Für die Übersetzung der regenerative Therapien für GA und damit verbundenen Krankheiten in die Klinik-7ist es wichtig, Entwicklung und Optimierung von Methoden, die die klinischen Methoden für Transplantation und Imaging treu zu erfassen. Das Kaninchen ist in dieser Hinsicht attraktiv: Es hat ein...

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen präklinischen Modell der geografischen Atrophie (GA), die die Auswertung der Integration von transplantierten hESC-RPE in den subretinalen Raum ermöglicht. Die hier ausführlich beschriebenen Methoden wurden in 3 neueren Publikationen verwendet, die die Produktion einer angereicherten, rein und funktionale Bevölkerung von RPE-Zellen aus hESC1sowie die Schaffung der äußeren Netzhaut Schaden und ein GA-ähnlichen Phänotyp zeigen induziert durch die subretinale Injektion von physiologischen Salzlösungen (d.h., BSS und PBS) oder NaIO3 im Kaninchen Auge2,3. Wir zeigten weiter, dass subretinalen Aussetzung Transplantationen von hESC-RPE umfangreiche funktionale Monolagen mit Photorezeptor Rettung Kapazität2 bilden.
Mehrere Vorteile begleiten den Einsatz von Kaninchenauge zur Erzeugung von einem GA-Modell der Krankheit. Erstens, die Größe der Kaninchenauge, die 70 % das Volumen eines Erwachsenen menschlichen Auges, können klinisch bedeutsamen Transplantation mit einer Zelldichte, die viel niedriger als in kleinen Nagetier Augen (1.000 Zellen/µL vs. 50.000 Zellen/µL)4 routinemäßig eingesetzt , 5. Zweitens Chirurgie bei Nagetieren ist in der Regel Transscleral durch die Aderhaut, die Kompromisse der retinalen-Schranke und potenziell löst eine Entzündungsreaktion und eine mögliche Ablehnung-6. Beide Faktoren können zu Ölpauseverfahren und Verklumpung der transplantierten Zellen und einer insgesamt schlechten Integration der transplantierten Zellen in einem gestörten native Netzhautgewebe zusammen führen. Die großen Augen Kaninchen-Modell ermöglicht jedoch eine Operationstechnik mit Instrumentierung identisch mit einer klinischen Umgebung durchführen. Drittens ermöglicht eine große-Augen-Modell auch mit hoher Auflösung in Vivo imaging und Überwachung der transplantierten Zellen und der darüberliegenden Netzhaut durch Zeit1,2,3. So beschreiben wir eine klinisch relevante und kosteneffiziente präklinische Modell, die eine attraktive Alternative zu Nagetiere für jedermann mit einem Interesse in der Forschung der normalen und krankhaften Netzhaut und subretinalen Raum sein sollte.

<table><tbody><tr><td>NutriStem hESC XF Differenzierung Medium &ndash; bFGF und &ndash; TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca2+ und Mg2+</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 40 &mu; m Nylon</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>Nadel 30 G 0.5' &rsquo;; 0,3 mm x 13 mm</td><td>BD Mikrolanze</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Spritzenvorsatzfilter</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypanblau</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>Verwendung bei 0,2 %</td></tr><tr><td>NaIO3</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol, 100 mg/ml</td><td>Intervet, Boxmeer</td><td>511519</td><td>Anwendung 35 mg/kg Ketamin</td></tr><tr><td>Rompun vet, 20 mg/ml</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>Anwendung 5 mg/kg Xylazin</td></tr><tr><td>Triescence, 40 mg/ml</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>412915</td><td>2 mg intraviterielle</td></tr><tr><td>Cyklopentolat-phenylephrin, 0,75 % + 2,5 %</td> <td>APL</td><td>321968</td><td>1 Tropfen in jedes Auge geben</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Laboratoires Th&eacute; a</td><td>597562</td><td></td></tr><tr><td>Topische Kochsalzlösung</td><td>Apotea AB</td><td>7053249369080</td><td></td></tr><tr><td>Allfatal vet. 100 mg/mL</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>Verwenden Sie 100 mg/mL Pentobarbital</td></tr><tr><td>Verlängerungstube (Hammer)</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G Polytip subretinale Kanüle</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>Einweg-Flachlinse</td><td>Volk</td><td></td><td></td>#VWFD10</tr><tr><td>Barraquer Colibri Deckelretraktor</td><td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>Trokare ohne Ventil</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>Krallenzange</td><td>Bausch & Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS Vitrektomiegerät</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Accurus 25+ Gauge Vitrektomie TotalL Plus Pak</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT Gerät</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+OCT</td><td>Verwenden Sie Heidelberg Eye Explorer Version 1.9.10.0</td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Hämozytometer</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>Neuseeländische Albino-Kaninchen</td><td>Lidk&ouml; pings Kaninchenfarm, Schweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hESC-RPE-Zellen</td><td></td><td></td><td>Siehe Referenznummer 1</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>0,5 mL Buprenorphin subkutan verwenden</td></tr></tbody></table>

subretinale transplantation von humanen embryonalen stammzellen abgeleitet retinalen pigment epithelzellen zu einem großen augen geographische atrophie

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geografischen Atrophie (GA), die späte Phase der trockene altersbedingte Makuladegeneration zeichnet sich durch Verlust der retinalen Pigment (RPE) Epithelschicht, führt zu einer nachfolgenden Degeneration des lebenswichtigen retinalen Strukturen (z.B. Photorezeptoren) verursacht schwere Sehbehinderung. Ebenso ist RPE-Verlust und Abnahme der Sehschärfe in langfristigen Folgen oben gesehen von Patienten mit fortgeschrittenen Feuchte altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die intravitreale Anti-vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) Behandlung. Daher ist es auf der einen Seite grundlegende effizient RPE-Zellen aus einer unbegrenzten Quelle abgeleitet, die als Ersatz-Therapie dienen könnte. Auf der anderen Seite, es ist wichtig, das Verhalten und die Integration der abgeleiteten Zellen in einem Modell der Krankheit mit chirurgischen bewerten und bildgebende Verfahren wie nah wie möglich an die beim Menschen angewendet. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll basierend auf unseren bisherigen Veröffentlichungen, die die Generation der präklinischen Modell GA beschreibt mit Albino Kaninchenauge für Bewertung der menschlichen embryonalen Stammzellen retinalen Pigment Epithelzellen (hESC-RPE) abgeleitet in eine klinisch relevante Einstellung. Differenzierte hESC-RPE werden verpflanzt in naiven Augen oder mit NaIO3-GA-Like Netzhautdegeneration mit einer 25 G Transvitreal Pars Plana Technik induziert. Bewertung der degenerierten und transplantierten Gebieten erfolgt durch multimodale hochauflösende nichtinvasive Echtzeit-Bildgebung.

Vertreter in Vivo Bilder von BAF, IR-cSLO und SD-OCT der normalen Albino Kaninchen Netzhaut sind in Abbildung 2dargestellt. Beachten Sie die verschiedenen Schichten der Netzhaut mit ihrer markanten Ebenen der Lichtreflexion von der SD-OCT Instrument erfasst.
In Abbildungen 1A und 1 b Abbildung, wird das Setup erstellen subretinalen...

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein großäugiges Tiermodell für geographische Atrophie zu erstellen, um humane embryonale Pigmentepithelzellen in das Auge zu transplantieren und die Integration von Spenderzellen mittels optischer Kohärenztomographie zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, wie z.B. die stammzellbasierte Behandlung degenerativer Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser chirurgischen Einstellung ist die unbegrenzte Quelle gesunder Zellen und die chirurgische Umgebung für die subretinale Injektion, die viele Ähnlichkeiten mit einem Verfahren aufweist, das für den Patienten bestimmt ist.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der altersbedingten Makuladegeneration durch die Zurschaustellung von retinalen Pigmentepithelzellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnen werden. Unsere Tiertechnikerin, Monica Aronsson, hält das Kaninchen in Position, so dass wir die Netzhaut mit der optischen Kohärenztomographie sichtbar machen und abbilden können. Nachdem Sie ein Kaninchen gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, legen Sie das Kaninchen mit dem Kopf zum Chirurgen unter das Operationsmikroskop.Verwenden Sie dann einen Lidretraktor, um die Augenlider zu entfernen, und ein steriles Tuch, um die Nictitans-Membran zu entfernen. Für die Mikrochirurgie verwenden Sie eine transvitreale Pars-Plana-Technik mit zwei oder drei Anschlüssen mit 25 Gauge und Trokaren ohne Ventil für das Einführen von mikrochirurgischen Instrumenten. Das Multifunktions-Vitrektomiegerät verfügt über Anschlüsse zum Anschluss einer Infusionskanaula, einer Endoillumination, eines Vitrektors und eines Endolasers.Bei subretinalen Injektionen ist nur die Endoillumination zwingend erforderlich, was ein Zwei-Port-Setup ausreichend macht. Verwenden Sie eine Gerinnselzange, um die Bindehaut zu greifen und zu verschieben, und überstreichen Sie die Einstichstelle. Führen Sie einen der beiden oberen Trokare transskleral ein, ein bis zwei Millimeter vom Limbus entfernt, in einem parallelen Winkel von dreißig bis fünfundvierzig Grad Limbus.Fahren Sie fort, den Trokar in der Mitte der Spitze einzuführen. Drehen Sie dann den Trokar um neunzig Grad und schieben Sie ihn in das Auge, wobei Sie auf den hinteren Pol zielen. Dies verhindert das postoperative Austreten dieser Sklerotomie und verringert auch das Risiko einer Endophthalmitis.Wiederholen Sie dies mit dem zweiten oberen Trokar. Beim Einführen des Trokars ist es wichtig, ein bis zwei Millimeter vom Limbus entfernt zu sein, um den Einschub zu tunneln und auf den hinteren Pol zu zielen, um das Risiko von Infektionen, Glaskörperblutungen, Netzhautablösung und unserer Linsenberührung zu minimieren. Tragen Sie synthetische Tränen als Vertragsgel auf die Hornhaut auf und positionieren Sie dann eine flache Einweg-Kontaktlinse auf der Hornhaut, um die Netzhaut sichtbar zu machen.Geben Sie als Nächstes fünfhundert Mikroliter Natriumjodat in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einem Verlängerungsschlauch verbunden ist, der von einem Assistenten bedient wird, und einer 38-Gauge-Kanüle mit mehreren Spitzen, die vom Chirurgen bedient wird. Führen Sie die Endoilluminationssonde durch den oberen linken Trokar ein. Führen Sie dann die Injektionskanüle durch den oberen rechten Trokar ein und schieben Sie die Kanüle durch den Glaskörperraum in Richtung Netzhaut, wobei Sie auf den Bereich direkt unter dem Sehnervenkopf abzielen.Lassen Sie die Spitze der Kanüle langsam die Netzhaut berühren, bis eine fokale Aufhellung sichtbar ist. Lassen Sie die Kanüle nicht in die Netzhaut eindringen, da dies zu Blutungen führen kann. Stechen Sie nun mit der Nadel in die Netzhaut ein und injizieren Sie fünfzig Mikroliter Natriumjodat subretinal über einen Zeitraum von fünf Sekunden.Da sich zwischen der Netzhaut und der darunterliegenden Aderhaut eine natürliche Spaltebene befindet, sollte sich während der Injektion nach und nach eine deutlich sichtbare halbtransparente Blase bilden. Ziehen Sie die Nadel während der Injektion langsam zurück, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze in der Blase bleibt, um den Reflux zu minimieren. Nach der Entfernung der Endoillumination und der Injektionskapula die Trokare mit einer Gerinnselzange entfernen.Verwenden Sie dann die Spitze oder das stumpfe Ende der Pinzette, um dreißig Sekunden lang leichten Druck auf die weich verschließende, nahtlose Sklerotomie auszuüben. Kümmern Sie sich während der Genesung um das Tier gemäß dem Textprotokoll und warten Sie sieben Tage auf die Transplantation. Sieben Tage nach der Injektion von Natriumjodat und nach Verabreichung von intravitrealem Triamcinolon entfernen Sie gemäß dem Textprotokoll das Zelldifferenzierungsmedium aus einer vierundzwanzig gut konfluenten hESC-RPE-Monoschicht und verwenden Sie fünfhundert Mikroliter PBS ohne Kalzium und Magnesium, um jede Vertiefung zu waschen.Nachdem Sie die Zellen trypsinisiert haben, kippen Sie die Platte und entfernen Sie vorsichtig das Trypsin, damit die Zellen an der Platte haften bleiben. Sammeln Sie die Zellen in achthundert Mikrolitern frischem, siebenunddreißig Grad Celsius vorgewärmtem Differenzierungsmedium, indem Sie sie vorsichtig pipettieren oder bei Bedarf sogar abkratzen, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mit null Komma zwei Prozent Trypanblau in einer Hämozytometerkammer gemäß den Anweisungen des Herstellers.Geben Sie dann fünf Milliliter Differenzierungsmedium in die Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zellen bei dreihundert Mal g, bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in frisch gefiltertem, sterilisiertem PBS bei einer Endkonzentration von eintausend Zellen pro Mikroliter. Aliquotieren Sie die vorherige Zellsuspension in sechshundert Mikroliter Aliquote und halten Sie sie bis und während der Operation auf Eis.Nachdem Sie das Kaninchen betäubt und die Pupillen gemäß dem Textprotokoll erweitert haben, platzieren Sie das Kaninchen mit dem Kopf in Richtung des Chirurgen. Verwenden Sie den Lidretraktor, um die Augenlider zu entfernen, und ein steriles Tuch, um die Niktitans-Membran zu entfernen. Verwenden Sie für die Mikrochirurgie eine transvitreale Pars-Plana-Technik mit zwei oder drei Anschlüssen mit 25 Anschlüssen, bei der Trokare in den gleichen Positionen platziert werden, wie weiter oben in diesem Video gezeigt.Wenn die vorangegangenen Sklerotomien sichtbar sind, führen Sie die Trokareinführung direkt angrenzend, aber nicht durch diese Einstichstellen durch, um das Risiko einer postoperativen Leckage zu minimieren. Tragen Sie wie zuvor synthetische Tränen auf das Auge auf und legen Sie eine flache Einweg-Kontaktlinse über die Lösung auf die Hornhaut, um die Netzhaut sichtbar zu machen. Nachdem Sie die Spitze richtig positioniert und auf die Mitte des mit Natriumjodat vorbehandelten Bereichs gerichtet haben, der sich durch einen charakteristischen metallischen Endoilluminationsreflex auszeichnet, injizieren Sie subretin fünfzig Mikroliter einer sanft gemischten hESC-RPE-Suspension.Die neurosensorische Netzhaut sollte sich leicht trennen und eine deutlich sichtbare Blase bilden. Ziehen Sie die Nadel während der Injektion langsam zurück, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze in der Blase bleibt, um den Reflux zu minimieren. Nach dem Entfernen der Endoillumination und der Injektionskapula entfernen Sie die Trokare mit einer Gerinnselzange und üben mit dem stumpfen Ende der Pinzette wie zuvor dreißig Sekunden lang leichten Druck aus.Verwenden Sie eine optische Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich mit der zugehörigen Software, um B-Schnittbilder der behandelten Tiere gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erhalten. Platzieren Sie das anästhesierte und pupillenerweiterte Tier in einer verstellbaren Halterung, um einen ungehinderten Weg von der Lichtquelle des Instruments zur Netzhaut des Kaninchens zu erhalten. Um Bildunschärfen zu vermeiden, halten Sie die Hornhaut feucht, indem Sie sie alle dreißig bis sechzig Sekunden mit topischer Kochsalzlösung spülen.Erhalten Sie mindestens drei OCT-Scans mit gleichzeitiger konfokaler Infrarot-Scanning-Laser-Ophthalmoskopie oder konfokalen SLO-Reflexionsreferenzbildern, die den oberen, zentralen und unteren Teil des injizierten Bereichs darstellen. Erhalten Sie mehrere gleichzeitige Laserfarben von En-Face-Fundusbildern mit konfokaler SLO-Reflexion in Blau, Grün, Infrarot und mehrfarbig. Nehmen Sie Autofluoreszenzbilder mit blauem Licht mit der Blaulicht-Laserfunktion des SD-OCT-Geräts auf.Repräsentative in vivo Bilder von BAF, IR-cSLO und SD-OCT einer normalen Netzhaut eines Albino-Kaninchens sind hier zu sehen. Eine Vergrößerung des SD-OCT-Bildes veranschaulicht die verschiedenen Netzhautschichten mit ihren unterschiedlichen Lichtreflexionsgraden, die vom SD-OCT-Instrument erfasst werden. Wie in diesem SD-OCT-Bild zu sehen ist, das drei Monate nach der Injektion von fünfzig Mikrolitern einer millimolaren Natriumjodatlösung aufgenommen wurde, entsteht eine Blase, die sich auflöste und die äußere Netzhaut progressiv degenerierte.Es kann eine Ausdünnung der äußersten neuroretinalen Schichten im SD-OCT und in den Hypo-BAF-Bereichen beobachtet werden, die dem RPE-Verlust entspricht und somit einen GA-ähnlichen Phänotyp bildet. Nach der Identifizierung des Schädigungsbereichs wurden fünfzigtausend hESC-RPE-Zellen zur Transplantation erneut injiziert, wodurch eine zweite Blase entstand, die sich auflöste. Es liegen leichte bis mittelschwere Hyper-BAF-Areale mit einem fokal erhöhten Hyper-BAF an der Grenze zum Schädigungsbereich vor, was auf chronischen Stress des nativen RPE hinweist.Zum Vergleich ist die Blase dargestellt, die der Injektion von hESC-RPE's in nicht vorbehandelte Augen entspricht und Flecken pigmentierter Zellen im MC-Bild und gut erhaltene Netzhautstrukturen im SD-OCT-Scan zeigt. Die Beherrschung dieser hübschen klinischen Methode zur subretinalen Injektion wird die klinische Transplantation der zellbasierten Behandlung von Erkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration erleichtern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man subretinale Injektionen in einem Lebenstypmodell einrichtet, wie man aus menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnene Zellen für subretinale Injektionen vorbereitet und wie man die Integration von Spenderzellen mit optischer Kohärenztomographie visualisiert.

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