Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein großäugiges Tiermodell für geographische Atrophie zu erstellen, um humane embryonale Pigmentepithelzellen in das Auge zu transplantieren und die Integration von Spenderzellen mittels optischer Kohärenztomographie zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, wie z.B. die stammzellbasierte Behandlung degenerativer Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser chirurgischen Einstellung ist die unbegrenzte Quelle gesunder Zellen und die chirurgische Umgebung für die subretinale Injektion, die viele Ähnlichkeiten mit einem Verfahren aufweist, das für den Patienten bestimmt ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der altersbedingten Makuladegeneration durch die Zurschaustellung von retinalen Pigmentepithelzellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnen werden. Unsere Tiertechnikerin, Monica Aronsson, hält das Kaninchen in Position, so dass wir die Netzhaut mit der optischen Kohärenztomographie sichtbar machen und abbilden können. Nachdem Sie ein Kaninchen gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, legen Sie das Kaninchen mit dem Kopf zum Chirurgen unter das Operationsmikroskop

Verwenden Sie dann einen Lidretraktor, um die Augenlider zu entfernen, und ein steriles Tuch, um die Nictitans-Membran zu entfernen. Für die Mikrochirurgie verwenden Sie eine transvitreale Pars-Plana-Technik mit zwei oder drei Anschlüssen mit 25 Gauge und Trokaren ohne Ventil für das Einführen von mikrochirurgischen Instrumenten. Das Multifunktions-Vitrektomiegerät verfügt über Anschlüsse zum Anschluss einer Infusionskanaula, einer Endoillumination, eines Vitrektors und eines Endolasers.

Bei subretinalen Injektionen ist nur die Endoillumination zwingend erforderlich, was ein Zwei-Port-Setup ausreichend macht. Verwenden Sie eine Gerinnselzange, um die Bindehaut zu greifen und zu verschieben, und überstreichen Sie die Einstichstelle. Führen Sie einen der beiden oberen Trokare transskleral ein, ein bis zwei Millimeter vom Limbus entfernt, in einem parallelen Winkel von dreißig bis fünfundvierzig Grad Limbus.

Fahren Sie fort, den Trokar in der Mitte der Spitze einzuführen. Drehen Sie dann den Trokar um neunzig Grad und schieben Sie ihn in das Auge, wobei Sie auf den hinteren Pol zielen. Dies verhindert das postoperative Austreten dieser Sklerotomie und verringert auch das Risiko einer Endophthalmitis.

Wiederholen Sie dies mit dem zweiten oberen Trokar. Beim Einführen des Trokars ist es wichtig, ein bis zwei Millimeter vom Limbus entfernt zu sein, um den Einschub zu tunneln und auf den hinteren Pol zu zielen, um das Risiko von Infektionen, Glaskörperblutungen, Netzhautablösung und unserer Linsenberührung zu minimieren. Tragen Sie synthetische Tränen als Vertragsgel auf die Hornhaut auf und positionieren Sie dann eine flache Einweg-Kontaktlinse auf der Hornhaut, um die Netzhaut sichtbar zu machen.

Geben Sie als Nächstes fünfhundert Mikroliter Natriumjodat in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einem Verlängerungsschlauch verbunden ist, der von einem Assistenten bedient wird, und einer 38-Gauge-Kanüle mit mehreren Spitzen, die vom Chirurgen bedient wird. Führen Sie die Endoilluminationssonde durch den oberen linken Trokar ein. Führen Sie dann die Injektionskanüle durch den oberen rechten Trokar ein und schieben Sie die Kanüle durch den Glaskörperraum in Richtung Netzhaut, wobei Sie auf den Bereich direkt unter dem Sehnervenkopf abzielen.

Lassen Sie die Spitze der Kanüle langsam die Netzhaut berühren, bis eine fokale Aufhellung sichtbar ist. Lassen Sie die Kanüle nicht in die Netzhaut eindringen, da dies zu Blutungen führen kann. Stechen Sie nun mit der Nadel in die Netzhaut ein und injizieren Sie fünfzig Mikroliter Natriumjodat subretinal über einen Zeitraum von fünf Sekunden.

Da sich zwischen der Netzhaut und der darunterliegenden Aderhaut eine natürliche Spaltebene befindet, sollte sich während der Injektion nach und nach eine deutlich sichtbare halbtransparente Blase bilden. Ziehen Sie die Nadel während der Injektion langsam zurück, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze in der Blase bleibt, um den Reflux zu minimieren. Nach der Entfernung der Endoillumination und der Injektionskapula die Trokare mit einer Gerinnselzange entfernen.

Verwenden Sie dann die Spitze oder das stumpfe Ende der Pinzette, um dreißig Sekunden lang leichten Druck auf die weich verschließende, nahtlose Sklerotomie auszuüben. Kümmern Sie sich während der Genesung um das Tier gemäß dem Textprotokoll und warten Sie sieben Tage auf die Transplantation. Sieben Tage nach der Injektion von Natriumjodat und nach Verabreichung von intravitrealem Triamcinolon entfernen Sie gemäß dem Textprotokoll das Zelldifferenzierungsmedium aus einer vierundzwanzig gut konfluenten hESC-RPE-Monoschicht und verwenden Sie fünfhundert Mikroliter PBS ohne Kalzium und Magnesium, um jede Vertiefung zu waschen.

Nachdem Sie die Zellen trypsinisiert haben, kippen Sie die Platte und entfernen Sie vorsichtig das Trypsin, damit die Zellen an der Platte haften bleiben. Sammeln Sie die Zellen in achthundert Mikrolitern frischem, siebenunddreißig Grad Celsius vorgewärmtem Differenzierungsmedium, indem Sie sie vorsichtig pipettieren oder bei Bedarf sogar abkratzen, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mit null Komma zwei Prozent Trypanblau in einer Hämozytometerkammer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Geben Sie dann fünf Milliliter Differenzierungsmedium in die Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zellen bei dreihundert Mal g, bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in frisch gefiltertem, sterilisiertem PBS bei einer Endkonzentration von eintausend Zellen pro Mikroliter. Aliquotieren Sie die vorherige Zellsuspension in sechshundert Mikroliter Aliquote und halten Sie sie bis und während der Operation auf Eis.

Nachdem Sie das Kaninchen betäubt und die Pupillen gemäß dem Textprotokoll erweitert haben, platzieren Sie das Kaninchen mit dem Kopf in Richtung des Chirurgen. Verwenden Sie den Lidretraktor, um die Augenlider zu entfernen, und ein steriles Tuch, um die Niktitans-Membran zu entfernen. Verwenden Sie für die Mikrochirurgie eine transvitreale Pars-Plana-Technik mit zwei oder drei Anschlüssen mit 25 Anschlüssen, bei der Trokare in den gleichen Positionen platziert werden, wie weiter oben in diesem Video gezeigt.

Wenn die vorangegangenen Sklerotomien sichtbar sind, führen Sie die Trokareinführung direkt angrenzend, aber nicht durch diese Einstichstellen durch, um das Risiko einer postoperativen Leckage zu minimieren. Tragen Sie wie zuvor synthetische Tränen auf das Auge auf und legen Sie eine flache Einweg-Kontaktlinse über die Lösung auf die Hornhaut, um die Netzhaut sichtbar zu machen. Nachdem Sie die Spitze richtig positioniert und auf die Mitte des mit Natriumjodat vorbehandelten Bereichs gerichtet haben, der sich durch einen charakteristischen metallischen Endoilluminationsreflex auszeichnet, injizieren Sie subretin fünfzig Mikroliter einer sanft gemischten hESC-RPE-Suspension.

Die neurosensorische Netzhaut sollte sich leicht trennen und eine deutlich sichtbare Blase bilden. Ziehen Sie die Nadel während der Injektion langsam zurück, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze in der Blase bleibt, um den Reflux zu minimieren. Nach dem Entfernen der Endoillumination und der Injektionskapula entfernen Sie die Trokare mit einer Gerinnselzange und üben mit dem stumpfen Ende der Pinzette wie zuvor dreißig Sekunden lang leichten Druck aus.

Verwenden Sie eine optische Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich mit der zugehörigen Software, um B-Schnittbilder der behandelten Tiere gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erhalten. Platzieren Sie das anästhesierte und pupillenerweiterte Tier in einer verstellbaren Halterung, um einen ungehinderten Weg von der Lichtquelle des Instruments zur Netzhaut des Kaninchens zu erhalten. Um Bildunschärfen zu vermeiden, halten Sie die Hornhaut feucht, indem Sie sie alle dreißig bis sechzig Sekunden mit topischer Kochsalzlösung spülen.

Erhalten Sie mindestens drei OCT-Scans mit gleichzeitiger konfokaler Infrarot-Scanning-Laser-Ophthalmoskopie oder konfokalen SLO-Reflexionsreferenzbildern, die den oberen, zentralen und unteren Teil des injizierten Bereichs darstellen. Erhalten Sie mehrere gleichzeitige Laserfarben von En-Face-Fundusbildern mit konfokaler SLO-Reflexion in Blau, Grün, Infrarot und mehrfarbig. Nehmen Sie Autofluoreszenzbilder mit blauem Licht mit der Blaulicht-Laserfunktion des SD-OCT-Geräts auf.

Repräsentative in vivo Bilder von BAF, IR-cSLO und SD-OCT einer normalen Netzhaut eines Albino-Kaninchens sind hier zu sehen. Eine Vergrößerung des SD-OCT-Bildes veranschaulicht die verschiedenen Netzhautschichten mit ihren unterschiedlichen Lichtreflexionsgraden, die vom SD-OCT-Instrument erfasst werden. Wie in diesem SD-OCT-Bild zu sehen ist, das drei Monate nach der Injektion von fünfzig Mikrolitern einer millimolaren Natriumjodatlösung aufgenommen wurde, entsteht eine Blase, die sich auflöste und die äußere Netzhaut progressiv degenerierte.

Es kann eine Ausdünnung der äußersten neuroretinalen Schichten im SD-OCT und in den Hypo-BAF-Bereichen beobachtet werden, die dem RPE-Verlust entspricht und somit einen GA-ähnlichen Phänotyp bildet. Nach der Identifizierung des Schädigungsbereichs wurden fünfzigtausend hESC-RPE-Zellen zur Transplantation erneut injiziert, wodurch eine zweite Blase entstand, die sich auflöste. Es liegen leichte bis mittelschwere Hyper-BAF-Areale mit einem fokal erhöhten Hyper-BAF an der Grenze zum Schädigungsbereich vor, was auf chronischen Stress des nativen RPE hinweist.

Zum Vergleich ist die Blase dargestellt, die der Injektion von hESC-RPE's in nicht vorbehandelte Augen entspricht und Flecken pigmentierter Zellen im MC-Bild und gut erhaltene Netzhautstrukturen im SD-OCT-Scan zeigt. Die Beherrschung dieser hübschen klinischen Methode zur subretinalen Injektion wird die klinische Transplantation der zellbasierten Behandlung von Erkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration erleichtern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man subretinale Injektionen in einem Lebenstypmodell einrichtet, wie man aus menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnene Zellen für subretinale Injektionen vorbereitet und wie man die Integration von Spenderzellen mit optischer Kohärenztomographie visualisiert.