Name: Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantois zur In-vitro- Analyse der Viruswenig Anlage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Präparation und Explantatkultur muriner Allantois zur Analyse der Allantoisanheftung in vitro. Diese Methode modelliert den ersten Schritt der Plazentabildung und ermöglicht Studien zur frühen Embryonalentwicklung.

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Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (, A.G.) unterstützt.

Maus-Zucht von der Regierung Unterfranken genehmigt wurde, und alle Analysen wurden unter strikter Einhaltung aller deutschen und Europäischen Union geltenden Gesetzen und Vorschriften rund um Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
(1) Beschichtung der Mikrotiter-Platten mit α4β1 Integrin für Ex Utero Allantois Explant Kultur
<ol><li>Bereiten Sie die lyophilisierten murinen α4β1 Integrin bei 200 µg/mL in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Um eine Endkonzentration von 10 µg/mL im vorgewärmten (37 ° C) PBS verdünnen. Pipette 20 µL/Well der verdünnten α4β1 Integrin-Lösung in die erforderliche Anzahl von Brunnen von einer Mikrotiterplatte (1 Allantois/Na). Hinweis: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, wenn die Vertiefungen der Mikrotiterplatte Beschichtung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mikrotiter-Platten für 60 min bei 37 ° C werden, indem sie in einem befeuchteten Gewebekultur Inkubator.</li>
	<li>Aspirieren Sie sorgfältig den Überstand mit einer Pipette. Verwenden Sie sanfte Saugwirkung und Neigung der Platte zu vermeiden, berühren die Näpfchenboden mit der Pipettenspitze. Waschen Sie Brunnen zweimal durch Zugabe von 50 µL vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium wie Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Entscheidender Schritt: Block frei Bindungsstellen durch Zugabe von 50 µL/Well von 0,1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) / DMEM und ≥ 30 min bei 37 ° C inkubieren, indem man die Mikrotiter-Platten in einem Inkubator befeuchtete Gewebekultur. Hinweis: Allantois Explantaten können verschiedene Oberflächen in Anwesenheit von Serum zuordnen. Es ist daher unerlässlich, unspezifischen Bindungsstellen blockieren, nach der Beschichtung die Brunnen mit Integrin und vor dem Hinzufügen der seziert Allantois für explant Kultur im Serum-haltigen Medium (siehe Punkt 4.4).</li>
	<li>Halten Sie die beschichteten Vertiefungen in der blockierenden Lösung bei 37 ° C bis in Schritt 4.4 benötigt.</li>
</ol>(2) Gebärmutter Dissektion von schwangere Maus bei Dpc 8
Hinweis: Einkochen Sie falsch-Positive Schwangerschaftsrate Gewicht Gewinn Diskriminierung15.
<ol><li>Die Maus durch zervikale Dislokation zu opfern. Desinfizieren Sie das Fell im Bauchbereich durch Besprühen mit 70 % (V/V) Ethanol. Hinweis: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Mäusen. Euthanasie durch zervikale Dislokation ohne Betäubung verhindert chemische Verschmutzung der Allantois, die Allantois Anlage stören kann.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bauchhaut, indem man einen kleinen Schnitt an der Mittellinie mit einer Schere. Verwenden Sie behandschuhte Fingern, um die Haut oberhalb und unterhalb der Schnitt zu halten, und ziehen Sie die Haut auseinander in Richtung Brust und Ende der Maus.</li>
	<li>Greifen Sie das Bauchfell mit Zange. Mit der anderen Hand einen v-förmigen Einschnitt von anterior in Richtung Posterior mit einer Schere und bewegen Sie das Gewebe entfernt, um die Bauchhöhle aussetzen. Verwenden Sie die Zange um den Darm zur Seite schieben, um Zugriff auf die Gebärmutter.</li>
	<li>Suchen Sie die uterine zwei Hörner. Halten Sie den Gebärmutterhals (kaudalen Segment) mit Zange und schneiden Sie die Bänder mit einer feinen Schere. Lösen Sie dann beide uterinen Hörner durch Durchtrennung der Eileiter mit einer Schere.</li>
	<li>Verwenden Sie Zange, die Gebärmutter in eine sterile 10 cm Schüssel mit sterilen, übertragen Raumtemperatur (RT) PBS. Entfernen Sie Fettgewebe, Gefäße und Nerven rund um die Gebärmutter Hörner mit feinen Pinzette/Schere (Abbildung 1A) oder.</li>
</ol>(3) Embryo Dissektion
Hinweis: Führen Sie folgende Schritte unter einem Stereomikroskop mit einem 8:1 Zoombereich ausgestattet.
<ol><li>Trennen Sie die Embryonen durch Schneiden zwischen der Implantation Websites mit einer Schere. Greifen Sie die muskuläre Gebärmutterschleimhaut der Gebärmutter Knospen mit Zange und ziehen sie auseinander um die Dezidua (Abbildung 1 b) verfügbar zu machen.</li>
	<li>Mit Pinzette, übertragen Sie die Gebärmutter Knospen in eine neue 10 cm Schale mit sterilen, RT PBS.</li>
	<li>Befestigen Sie die Dezidua um den Embryo mit den Spitzen der Zange.</li>
	<li>Machen Sie einen Einschnitt auf der Anti-Mesometrial der Decidua mit feinen Pinzette (Abbildung 1), und ziehen Sie der Decidua mit Zange um den Embryo (Abbildung 1) verfügbar zu machen ab. Hinweis: Der Mesometrial Pol von der Decidua ist stark durchblutet und kann an der Basis breiter als der Anti-Mesometrial Teil, der enthält des Embryos und blasser erscheint.</li>
	<li>Zerlegen Sie den Embryo mit Zange (Abb. 1E, F).</li>
	<li>Mit einem Mikro-Löffel, transfer des Embryos zu einem Tropfen von sterilen PBS in einer sterilen 3,5 cm Schüssel enthalten.</li>
	<li>Transfer des Embryos zu einem frischen Tropfen von PBS in der gleichen 3,5 cm Schüssel mit einem Mikro-Löffel und sezieren die Embryos aus dem Dottersack mit Pinzette (Abbildung 1, H).</li>
	<li>Optional, bei Bedarf (z.B.für die Genotypisierung durch Polymerase-Kettenreaktion) übertragen der Dottersack in ein steriles Röhrchen durch Absaugen mit ~ 5 µL PBS in einer großen Öffnung 200 µL Pipettenspitze. Shop bei-20 ° C. Hinweis: Mütterlichen Gewebe (d.h. der parietalen Dottersack einschließlich Reicherts Membran und die Ectoplacental Kegel), die die Dottersack Zubereitung verunreinigen kann kann zu fehlerhaften Genotypisierung Ergebnissen führen. Entfernung von diesen Geweben ist am einfachsten vor dem Embryo Dissektion aus dem Dottersack.</li>
</ol>4. Allantois Dissektion und Ex Utero Kultur auf immobilisierte α4β1 Integrin
<ol><li>Schneiden Sie die Allantois aus der basalen Insertionsstelle am hinteren Ende des Embryos mit feinen Pinzette (Abbildung 1 H).</li>
	<li>Optional, wenn Entwicklungsstörungen Inszenierung erforderlich ist, zählen Sie die Somiten Paare des Embryos durch Sichtkontrolle unter Verwendung eines Mikroskops mit Phase Kontrast-Optik und eine 5 × 10 × Ziel ausgestattet. Hinweis: Der Embryo kann mit der Pinzette Somiten zählen zu erleichtern erweitert werden. Chorioallantoic Anlage und Fusion auftreten zwischen E 8.0 und 9.0 E in Embryonen mit ≥ 6 Somiten Paaren. Drehen beginnt beim Embryo mit 6-8 Somiten Paaren.</li>
	<li>Pipette 40 µL/Well des DMEM mit 10 % (V/V) fötalen Rinderserum, L-Glutamin und Antibiotika in der erforderlichen Anzahl von vorbeschichteten Mikrotiter Platte Brunnen (siehe Abschnitt 1) ergänzt.</li>
	<li>Sammeln Sie die schwimmenden Allantois durch Absaugen mit ~ 5 µL PBS in einer großen Öffnung von einer Pipettenspitze 200 µL. 1 Allantois/gut zu übertragen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Allantoides indem man die Mikrotiter-Platten in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) für z.B.6, 12 und 24 h. Zur Vermeidung von Interferenzen mit Allantois Anlage bewegen Sie Mikrotiter-Platten zwischen diesen Zeitpunkten nicht.</li>
	<li>Zu jedem Zeitpunkt der Gäste Allantois Anlage (z.B., keine Anlage/floating Allantois teilweise oder vollständig angehängte Allantois; voll Ausbreitung Allantois) unter Verwendung eines Mikroskops mit Phase Kontrast oder Differential Interferenz-Kontrast-Optik ausgestattet und ein 5 × oder 10 × Ziel (Abbildung 2). Hinweis: Repräsentative Beispiele für frisch isolierte und vollständig angehängte Allantoides sind in Abbildung 2gezeigt. Ex Utero, misst der distalen Spitze Allantoides vom Wildtyp C57BL/6J Mäusen isoliert innerhalb von 4-6 Stunden (Dies wird bezeichnet als partielle Befestigung der Allantois) und vollständige Befestigung des gesamten Allantois erfolgt innerhalb von ~ 12 h von Kultur. Von 18-24 Uhr hat der modellabhängigen abgeflacht und übernahm eine Kreisform (voll Allantois Spread bezeichnet) mit einem CD31-positiven vaskulären Plexus9,16.</li>
</ol>5. Bestätigung Färbung der explantierten Allantois für die Endothelzellen Markers CD31
<ol><li>Aspirieren Sie das Kulturmedium voll Ausbreitung Explantaten und beheben Sie die Zellen durch Zugabe von 40 µL/Well von 4 % (w/V) Paraformaldehyd/PBS zu. Hinweis: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille zu Haut- und Augenkontakt vermeiden.</li>
	<li>10 min bei RT inkubieren Sie, dann aspirieren Sie überstand. Waschen Sie dreimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS, und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Permeabilize der Zellen und unspezifischen Bindungsstellen durch Zugabe von 40 µL/Well von 0,1 % (V/V) Triton X-100/0.1% (w/V) BSA/10% (V/V) normalem Ziegenserum mit PBS-Puffer für 30 min bei RT. Wash zweimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS zu blockieren und entfernen das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung. Hinweis: Das Protokoll kann über Nacht an dieser Stelle angehalten werden.</li>
	<li>Beflecken Sie Zellen durch Zugabe von 20 µL/Well des primären Anti-CD31 Antikörper 01:50 in 0,1 % (w/V) BSA/PBS verdünnt über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie dreimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS, und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Gebundenen primären Antikörper durch Zugabe von 20 µL/Well Eindringmittel beschriftet sekundäre Ziege Antikörper Anti-Ratte verdünnt 1: 200 in 0,1 % (w/V) BSA/PBS für 1 h bei RT. Protect Mikrotiter-Platten aus Licht indem einwickeln in Alufolie oder in einer dunklen Kammer zu erkennen. Waschen Sie dreimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS, und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Betten Sie Zellen durch Zugabe von 20 µL/Well Eindeckmedium ein. Inkubieren ~ 1 h bei RT bis das Eindeckmittel erstarrt ist. Bewahren Sie Mikrotiter-Platten bei RT oder bei 4 ° C, vor Licht geschützt auf.</li>
	<li>Bild der vaskulären Plexus der Allantois explants unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer 5 × oder 10 × Ziel und geeignete Fluoreszenz-Filter ausgestattet. Hinweis: Repräsentative Bilder der CD31-positiven vaskulären Plexus der voll Ausbreitung Allantois sind in Abbildung 3gezeigt. Andere Marker für den vaskulären Plexus, z. B. Antikörper gegen Flk-1, Flt, Tie-1 oder Tie-2 kann als gut16verwendet werden.</li>
</ol>

<ol><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
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<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
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<li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li>
<li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allantois+and+chorion%2C+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion%2C+have+hematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li>
<li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17671451">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In Anwesenheit von Serum, das ist eine reiche Quelle von pro-Kleber extrazelluläre Matrix Moleküle wie Fibronektin, werden Allantois Explantaten leicht verschiedenen Kunststoff, Glas oder Filter Oberflächen9,16beimessen. Deshalb wenn der durchgeführten Test speziell die Auswirkung einer genetischen Veränderung zu untersuchen soll oder eine andere Behandlung auf Allantois Bindung an α4β1 immobilisiert, kritische, unspezifischen Bindungsstellen (z. B.mit R...

Die Plazenta ist unverzichtbar für embryonale Wachstum und Entwicklung in der Gebärmutter. Es bildet die Schnittstelle für Sauerstoff, Metaboliten und Nährstoffaustausch zwischen fetalen und mütterlichen Kreislauf, und auch Funktionen als endokrine und immunologische Organ. Jede endogene oder exogene Beleidigung, die plazentaren Entwicklung beeinträchtigt führen zu intrauterine Wachstumsverzögerung, fetale Verlust oder Komplikationen während der Schwangerschaft, bei Mäusen und Menschen1. Während die Zahl der gezielten Maus Mutationen, abnorme plazentar Physiologie verursachen, weiter erhöht2, 219 Genotypen, die derzeit auf der Website der Maus Genom Informatik (MGI) aufgeführt (http://www.informatics.jax.org/vocab/ Mp_ontology / MP:0010038), viele von diesen Phänotypen sind nicht gut verstanden, aus einem mechanistischen Sicht. Neben der genetischen Veränderungen, niedermolekulare Medikamente, monoklonale Antikörper, Toxine beeinträchtigen Krankheitserreger, überschüssige Stoffwechselprodukte oder verschiedene Umweltfaktoren Plazenta-Entwicklung und Funktion3,4,5 , 6 , 7. doch einfach in-vitro- Tests, dass Modell wichtige Schritte in der Entwicklung der Plazenta knapp sind.
Murine plazentar Entwicklung im frühen Midgestation beginnt, wenn die Allantois (developmental Vorläufer der Nabelschnur) vom hinteren Ende des Embryos als eine Knospe entsteht, die in Richtung der Chorion8wächst. Chorioadhesive Zellen in der äußeren Schicht der Viruswenig Knospe vermitteln die Befestigung und Verbreitung der Allantois auf der Oberfläche des Chorion (chorioallantoic "Fusion"). Das Chorion faltet sich anschließend in Zotten in die das Gefäßsystem der Allantois wächst, das Labyrinth, die innere Schicht der Plazenta zu bilden, wo Nährstoffe und Sauerstoff zwischen eng nebeneinander angeordnete mütterlichen Blut Sinusoide und embryonale Gefäße9 ausgetauscht werden ,10.
Die Befestigung der Allantois an das Chorion ist der erste und entscheidende Schritt in Labyrinth Bildung und Mängel in diesem Prozess gehören zu den häufigsten Ursachen von embryonalen Tödlichkeit in midgestation1. Obwohl eine Reihe von Maus-Mutanten beschrieben worden, denen chorioallantoic Anlage scheitert10auftreten, und die MGI-Datenbank listet derzeit 108 Maus-Mutanten, die durch abnorme chorioallantoic Fusion (http:// gekennzeichnet sind Www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), die interzelluläre Interaktion zwischen die vaskuläre Zelle Adhäsion Molekül-1 (VCAM-1, drückte auf den Viruswenig Mesoderm) und α4β1 Integrin (ausgedrückt auf die Chorion Mesothelium, die abgeleitet von extraembryonic Mesoderm) scheint für chorioallantoic Anlage und Fusion11,12,13unverzichtbar sein. Immunhistochemische Färbung des gesamten-Mount Wildtyp Embryonen hat gezeigt, dass VCAM-1 innerhalb der distale zwei Drittel der Viruswenig Stiel etwa embryonale Tag (E) 7,5 ausgedrückt wird13 (1-4 Somiten Bühne) und seinen Ausdruck bleibt hoch während chorioallantoic Anlage und -Fusion11,12. Ausfall der Viruswenig Bindung an das Chorion ist in der Regel durch histologische Analysen der Gebärmutter Knospen erkannt. Jedoch Allantois Größen sind physiologisch sehr variabel zwischen und sogar innerhalb Würfe von der gleichen Entwicklungsstufe14, und die Allantois kann nur an die Chorion anfügen, wenn sie eine ausreichende Größe, körperlichen Kontakt zu machen erreicht hat. Reflektieren diese natürliche Variabilität, chorioallantoic Anlage findet irgendwann zwischen ~ E 8.0 und 9.0 E in der Gebärmutterund eine statistisch zuverlässige Beurteilung dieses Verfahrens durch Histologie ist also abhängig von der Analyse einer großen Anzahl von Conceptuses, genügend Exemplare in den entsprechenden Entwicklungsstadium zu erhalten.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung Viruswenig Anlage ex Utero , die Allantois Größe weniger abhängig ist. Wir demonstrieren das Sezieren von Mäuseembryonen und ihre Allantoides aus Uteri von schwangeren Mäusen ~ 8 Tage post Coitum (Dpc; Dpc 0,5 bezeichnet die Erkennung von einem vaginalen Stecker), und die nachfolgende Kultur der Allantois explants auf immobilisierte α4β1 Integrine. Diese Methode ermöglicht eine schnelle, funktionale Bewertung der Anlage und Verhalten von mehreren Allantois Explantaten parallel und zu verschiedenen aufeinander folgenden Zeitpunkten zu verbreiten. Das Protokoll kann verwendet werden zum Bildschirm für die Auswirkungen von gezielter Mutationen, Drogen oder verschiedene Umweltfaktoren auf Allantois Anlage ex Vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J Wildtyp-Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>Lager-Nr.:&nbsp; </td><td></td>000664</tr><tr><td>70 % (v/v) Ethanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Zange mit Standardmuster</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Pinzette zum Öffnen der Bauchhöhle.</td></tr><tr><td>Mikro-Präparierzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 Rezepte für die medizinische Biologie mit feiner, scharfer Spitze.</td></tr><tr><td>Feine Schere&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Gerade Klingen.</td></tr><tr><td>Federschere&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes Federschere mit 14 mm Klingen zum Sezieren von Gebärmutterknospen.</td></tr><tr><td>Mikrolöffel</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Löffeldurchmesser.</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>Wir verwenden unbeschichtete, sterile Angiogenese-Objektträger (Innenvolumen 50 &; Mikro; L) mit einer hydrophoben Oberfläche, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde, um nicht-&#945; 4&#946; 1-vermittelte Bindung an Kunststoff.</td></tr><tr><td>10 cm Schale</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sterile Gewebekulturschalen.</td></tr><tr><td>3,5 cm Schale</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Sterile Gewebekulturschalen.</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit großer Öffnung&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Pipettenspitzen mit geringer Bindung, 200 & Mikrol.</td></tr><tr><td>&#945; 4&#946; 1 integrin</td><td>R& ; D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Maus &#945; 4&#946; 1 Integrin, rekombinant exprimiert und gereinigt aus einer Ovarialzelllinie des chinesischen Hamsters.</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>ohne Ca2+ und Mg2+.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>Die Formulierung enthält 4,5 g/L Glucose, 110 mg/L Natriumpyruvat und 3,7 g/L NaHCO3 jedoch kein L-Glutamin, das separat zugegeben wird.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10.000 U/ml Penicillin und 10.000 &; Mikro; g/ml Streptomycin) Stammlösung.&nbsp; Vorbereiten und Lagern von Aliquoten bei -20 & Grad; C, um Frost/Tauen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stammlösung. Vorbereiten und Lagern von Aliquoten bei -20 & Grad; C, um Frost/Tauen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>Wir verwenden hitzeinaktiviertes FBS (erhitzt auf 56 °; C für 30 min mit Mischen zur Inaktivierung des Komplements).</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Wir verwenden protease- und fettsäurefreies Albumin. Bereiten Sie eine 0,1 %ige Lösung in DMEM vor. Sterilfiltrieren Sie die Lösung durch einen Einweg-Zellkulturfilter mit einem 0,22 & Mikro; m Porengröße und geringe Proteinbindungsmembran und lagern Sie Aliquote bei -20 °C.</td></tr><tr><td>para-Formaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>Um eine Formaldehydlösung in PBS herzustellen, wird para-Formaldehydpulver in einer belüfteten Haube gewogen und in das auf ca. 60 μm vorgeheizte PBS gegeben; C in einem Becherglas auf einer Rührplatte. Fügen Sie tropfenweise 1 N NaOH hinzu, bis die Lösung klar ist. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und filtrieren Sie sie durch eine 0,22-mm-Filterspritze. Stellen Sie den pH-Wert mit verdünntem HCl auf ca. 6,9 ein und stellen Sie ihn mit PBS auf das Endvolumen ein. Wir aliquotieren und frieren die Lösung ein, aber sie kann auch bei 4 & Grad gelagert werden; C für etwa vier Wochen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiter Öffnung, um unverdünntes Triton X-100 zu handhaben.</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>Zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern in Immunfluoreszenzanalysen.</td></tr><tr><td>&#945;-CD31 Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Aufgereinigte monoklonale Anti-Maus-Antikörper an Ratten, Klon MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Sekundäre Anti-Ratten-Antikörper</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Anti-Ratten-IgG (schwere und leichte Ketten), kreuzadsorbiert, fluoreszenzmarkiert mit Alexa Fluor 488. Auch andere fluoreszierende Markierungen sind möglich.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Eindeckmedium für die Zytochemie. MW ~31.000</td></tr><tr><td>Labovert&nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&nbsp;</td><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop mit einem 4 x und 10 x Objektiv für die Somitenpaarzählung. Andere Phasenkontrastmikroskope (wie sie routinemäßig in Gewebekulturen eingesetzt werden) sind ebenfalls geeignet. &nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereomikroskop mit 8 : 1 Zoombereich (mit einer Vergrößerung zwischen 7,5 x und 60 x) für die Dissektion von Embryonen und Allantois.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Mikroskopsystem für die Histologie mit LED-Beleuchtung. Wir verwenden HCX PL FLUOTAR 5 x/0,15 und HC PL FLUOTAR 10 x/0,30 Objektive. Andere Mikroskope, die mit Phasenkontrast- und Fluoreszenzoptiken ausgestattet sind, können zur Ritzung der Allantoisbefestigung verwendet werden.</td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD-Digitalaufnahmekamera, die an das DM4000B LED-Mikroskop angeschlossen ist. Wir verwenden die Diskus-Software (Hilgers), um sowohl das Mikroskop als auch die Kamera zu bedienen.</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Konfokalmikroskop für die hochauflösendere Darstellung von Endothelien im Gefäßplexus von Allantois-Explantaten. Die Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem 40-fach-Objektiv aufgenommen.</td></tr></tbody></table>

dissektion und modellabhängigen kultur der murinen allantois zur in-vitro- analyse der viruswenig anlage

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Die Plazenta ist essentiell für das Wachstum und die Entwicklung von Säugetier-Embryonen. Aus diesem Grund können zahlreiche genetische Veränderungen und wahrscheinlich auch ökologische Beleidigungen, die Plazenta-Entwicklung oder Funktion stören frühen Schwangerschaft bei Mäusen und Menschen verloren gehen. Dennoch fehlen einfache in-vitro- Assays für mögliche Auswirkungen auf die Bildung der Plazenta auf den Bildschirm. Hier konzentrieren wir uns auf die Modellierung der ersten und entscheidenden Schritt in Plazenta-Formation, bestehend aus der Befestigung des die Allantois an der Chorion. Wir beschreiben eine Methode, um schnell die Befestigung der Viruswenig Explantaten an immobilisierte α4β1 Integrin, bewerten die als Chorio-mimetischen Substrat dient. Dieser in-vitro- Ansatz ermöglicht eine qualitative Bewertung der Anlage und Verhalten von mehreren Allantois Explantaten zu verschiedenen aufeinander folgenden Zeitpunkten zu verbreiten. Das Protokoll kann verwendet werden, untersuchen die Wirkung von gezielten Maus Mutationen, Drogen oder verschiedene Umweltfaktoren, die zu Komplikationen während der Schwangerschaft oder fetale Verlust aus der Allantois Anlage ex Vivoverknüpft wurden.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum isolieren und explant murinen Allantoides ex Vivound details die qualitative Bewertung der Allantois Bindung an α4β1 Integrin, ein kritischer Prozess bei der in Vivo chorioallantoic Fusion. Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 1A–H zeigen die aufeinander folgenden Schritte der Allantois Isolation der schwangeren Gebärmutter ab. Mütterlichen Gewebe, die die ...

Wir beschreiben einen in-vitro- Test auf Modell chorioallantoic Anlage, der erste Schritt bei der Bildung der Plazenta. Das Protokoll zeigt die Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantoides auf immobilisierte α4β1 Integrin. Allantois Anlage wird mikroskopisch zu vorher festgelegten Zeitpunkten ausgewertet.

Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantois zur In-vitro- Analyse der Viruswenig Anlage

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Dissektion und Explantatkultur von murinen Allantois für die Analyse des allantoischen Attachments in vitro. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Embryonalentwicklung von Säugetieren zu beantworten, wie z.B. die Kontrolle des allantoischen Attachments für die Plazentabildung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den ersten und entscheidenden Schritt der Plazentabildung in vitro modelliert.Das Verfahren wird von Kerstin Hadamek, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Um die Platten aufzustellen, geben Sie zunächst 20 Mikroliter frisch hergestellte Alpha 4/Beta 1 Integrinlösung in jede Vertiefung. Planen Sie eine Allantois pro Vertiefung ein.Lagern Sie keine Lösung mit Luftblasen ab, da dies eine ordnungsgemäße Beschichtung verhindert. Nach dem Befüllen der Vertiefungen inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator. Nach der Inkubation aspirieren Sie den Überstand aus den Vertiefungen, während Sie die Platte schräg halten, damit die Pipette die Lösung sanft heraussaugen kann, ohne den Boden der Vertiefung zu berühren.Waschen Sie anschließend die Vertiefun

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann.

Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten

Der kraniale Mesenchym erfährt dramatischen morphogene Bewegungen, die wahrscheinlich stellt eine Antriebskraft für die Elevation der...

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Eine einfache Methode, primäre menschliche Plazenta (Villi) und dezidualen Organkulturen zu etablieren beschrieben. Villöse und dezidualen Organkulturen sind wertvolle Werkzeuge Pathogenese an der menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle für das Studium. Eine Infektion mit dem Bakterium fakultativ intrazellulären Listeria monocytogenes nachgewiesen wird .

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

Erfahren Sie die Präparation und Explantatkultur muriner Allantois zur Analyse der Allantoisanheftung in vitro. Diese Methode modelliert den ersten Schritt der Plazentabildung und ermöglicht Studien zur frühen Embryonalentwicklung.

Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantois zur In-vitro- Analyse der Viruswenig Anlage

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