Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, CRISPR/Cas9-Geneditierung zu nutzen, um Calreticulin-Mutationen in zytokinabhängigen hämatopoetischen Zellen zu modellieren und so ihre onkogene Aktivität zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der hämatologischen Malignome zu beantworten, wie z.B. die biologische Funktion von Treibermutationen, wenn sie auf physiologischer Ebene exprimiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das CRISPR/Cas9-Gen-Editing-System verwendet, um die biologische Funktion von Genen, die an Krebs beteiligt sind, zu modellieren und zu untersuchen.

Um die Oligos zu glühen und zu phosphorylieren, fügen Sie die Reagenzien zu insgesamt 10 Mikrolitern in einem PCR-Röhrchen hinzu, das auf Eis aufbewahrt wird. Stellen Sie das Programm im Thermocycler ein. Verwenden Sie Wasser, um die Reaktion nach Abschluss des Zyklus zu verdünnen.

Um den lentiGuide-Puro-Vektor zu verdauen, bereiten Sie 50 Mikroliter Digestorreaktion vor. Starten Sie dann die Aufschlussreaktion bei 55 Grad Celsius an einem Heizblock. Nach einer Stunde fügen Sie einen weiteren Mikroliter des BsmB1-Restriktionsenzyms hinzu und setzen Sie die Reaktion für eine weitere Stunde fort.

Um den abgeschnittenen Knochen zu dephosphorylieren, fügen Sie dem Verdauungsvektor sieben Mikroliter Phosphatase-Reaktionspuffer und zwei Mikroliter Phosphatase-Enzym hinzu. Dann die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Reinigen Sie das bereits geschnittene und dephosphylierte Rückgrat mit einem handelsüblichen Kit.

Um die Ligationsmischung herzustellen, geben Sie 15 Nanogramm verdautes Rückgrat und andere Reagenzien in ein auf Eis aufbewahrtes PCR-Röhrchen und stellen Sie das Volumen mit Wasser auf 10 Mikroliter ein. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Transformieren Sie dann STBL3-kompatible Zellen mit zwei Mikrolitern der Ligationsmischung.

Und dann auf die Lysogenie-Brühe-Agar-Platte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin aufschlagen. Danach die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Wähle drei Völker aus und impfe sie.

Führen Sie für jede Kultur eine Mini-Vorbereitung durch und sequenzieren Sie die Oligo-Insertionsstelle mit einem Primer aus der U6-Promotorregion. Hek293t-Zellen auf einer 10-Zentimeter-Schale säen. Und lassen Sie es über Nacht inkubieren.

Um das DNA-Gemisch für die Transfektion vorzubereiten, pipettieren Sie 45 Mikroliter des Transfektionsreagenzes auf die DNA. Mischen Sie die DNA und das Transfektionsreagenz vorsichtig mit einer Pipette und lassen Sie sie 20 Minuten lang stehen. Danach geben Sie die DNA-Transfektionsmischung tropfenweise auf die ausgesäten Zellen.

Schwenken Sie die Platten vorsichtig. Und inkubieren Sie einen Tag lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Ernten Sie das Virus, das Supernatent enthält, nach 24 und 48 Stunden, indem Sie es durch einen 0,22-Mikromiter-Filter leiten.

Und aliquotieren Sie 1,6 Milliliter Supernatent in jedem Kryofläschchen. Als nächstes aspirieren Sie das Übergeborene und resuspendieren die Ba/F3-Zellen im Medium, indem Sie die Zellen mehrmals auf und ab pipettieren. Geben Sie 500 Mikroliter der resuspendierten Zellen, 1,5 Milliliter Virusüberstand, vier Mikroliter Polybren und 10 Nanogramm pro Milliliter murines Interleukin 3 in eine Sechs-Well-Gewebekulturplatte.

Zentrifugieren Sie die Platte bei 440 g für 120 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird die Platte in einen Inkubator überführt, wo sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert wird. Danach schleudern Sie die Zellen drei Minuten lang bei 440 g herunter.

Und in fünf Millilitern frischem, warmem Medium in einer Sechs-Well-Platte resuspendieren. Um die Cas9-infizierten Zellen auszuwählen, drehen Sie die Zelle zunächst nach unten. Und dann in frischen, warmen Medien resuspendieren, ergänzt mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin nach 48 Stunden Infektion.

Fahren Sie neun Tage lang mit der Selektion von Zellen mit Blasticidin fort, bis alle nicht infizierten Zellen tot sind. Übertragen Sie dann die resistenten Zellen in ein Medium mit einem Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin. Transduzieren Sie die Elternzellen und die Zellen, die Cas9 stabil exprimieren, mit dem pXPR-011-Reporterkonstrukt durch lentivirale Infektion.

Setzen Sie die Selektion von Zellen mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Puromycin für drei Tage, 48 Stunden nach der Infektion, fort. Infizieren Sie die Cas9-exprimierenden Zellen mit einfacher Ribonukleinsäure unter Verwendung des Lentivirus. Verwenden Sie dann zwei Mikrogramm pro Milliliter Puromycin, um die Zellen drei Tage lang, 48 Stunden nach der Infektion, auszuwählen.

Werfen Sie die exponentiell wachsenden Ba/F3-Zellen, die ektopisches Cas9 exprimieren, und die Monoguide-Ribonukleinsäure von Interesse. Aspirieren Sie das Übergeborene und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Schleudern Sie die Zellen herunter und waschen Sie sie dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem Zellviabilitätsanalysator. Danach werden Samenzellen in zwei Millilitern Frischmedium ohne Interleukin 3 in sechs Well-Kulturplatten dreifach gefüttert. Beginnen Sie mit der Überwachung und Zählung der Zellen alle zwei Tage für acht Tage.

Repräsentative flusspsychometrische Daten, die die Cas9-Aktivität in elterlichen Ba/F3-Zellen und Ba/F3-überexprimierenden Cas9-Zellen zeigen, sind hier dargestellt. Das grün fluoreszierende Proteinsignal ist in Ba/F3-überexprimierenden Cas9-Zellen um 76 % reduziert, was auf eine robuste Cas9-Aktivität hinweist, während in elterlichen Ba/F3-Zellen das grün fluoreszierende Proteinsignal bei 100 % bleibt. Repräsentative Wachstumskurven für Zellen, die eine onkogene Aktivität von Calreticulin zeigen, sind hier dargestellt. Die CRISPR/Cas9-vermittelte plus eine Basenpaar-Frame-Shift-Mutation wurde im Exon-Neun-Locus von Calreticulin unter Verwendung der m1- und m2-Singleguide-RNase eingeführt.

Die Wachstumskurven für Calreticulin-gerichtete Ba/F3-Thrombopoietin-Rezeptor-Cas9-Zellen zeigen ein unabhängiges Wachstum von murinem Interleukin 3. Die Wachstumskurven für die anderen Zelltypen zeigen jedoch kein zytokinunabhängiges Wachstum. Die Sequenzierungsergebnisse bestätigen die On-Target-Editierung von endogynösem Calreticulin-Exon neun in Calreticulin-gerichteten Ba/F3-Thrombopoietin-Rezeptor-Cas9-Zellen unter Verwendung der m1- und m2-Singleguide-RNase.

Die plus eins Basenpaar Frame Shift-Mutationen sind schwarz dargestellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu verstehen, welche Art von Mutationen im interessierenden Gen für den gewünschten Phänotyp verantwortlich sein können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden zur weiteren Charakterisierung der Mutation durchgeführt werden, wie z. B. ihre Rolle bei der Zellsignalisierung oder bei Protein-Protein-Interaktionen, um den Mechanismus, durch den sie Krankheiten verursacht, besser zu verstehen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hämatologie, um die Wirkung von Gain-of-Function-Mutationen auf physiologischer Ebene auf die Zelltransformation in hämatopoetischen Ba/F3-Zellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Methode nutzen können, um die onkogene Aktivität von Gain-of-Function-Mutationen in zytokinabhängigen hämatopoetischen Zellen zu untersuchen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einer BL2 plus-Einrichtung getroffen werden sollten.