Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genexpression von Reporterkonstrukten zu messen, nachdem sie durch Partikelbeschuss in Gersten-Aleuron-Zellen eingeführt wurden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Regulation der Genexpression von Pflanzenhormonen zu beantworten, z. B. wie bestimmte Signalmoleküle wirken, um Abscisinsäure in gersteninduzierte Gene zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen höheren Durchsatz als bisherige Methoden bietet, so dass eine große Anzahl von Genkonstrukten und Inkubationsbedingungen getestet werden kann.

Grace, eine Studentin in meinem Labor, wird das Protokoll vorführen. Geben Sie zunächst einige embryolose Körner in den Deckel einer 90 Millimeter großen Petrischale aus Plastik, die 20 Milliliter Trinklösung und 20 Mikroliter Chloramphenicol enthält. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig die durchsichtige Samenhülle von jedem Korn.

Das Schälen der Samenschalen vom Gerstenkorn ist ein kritischer Schritt. Wenn die Samenschalen nicht vollständig entfernt werden, wird verhindert, dass die Gold-Microcarrier in die Aleuronzellen gelangen. Wird das Peeling aber zu grob durchgeführt, können die Aleuronzellen geschädigt werden.

Nachdem Sie die Samenschale von allen Körnern geschält haben, geben Sie sie aus der Petrischale auf eine Vermiculitplatte. Legen Sie dann die geschälten embryolosen Körner für 16-20 Stunden bei 24 Grad Celsius in einen Inkubator. Beschriften Sie nun von jeder Behandlung ein Ein-Komma-Fünf-Milliliter-Röhrchen, das in das Bombardement-Experiment einbezogen wird.

Zu jedem Röhrchen werden zwei Komma fünf Mikrogramm UBI-Luziferase internes Kontrollplasmid, zwei Komma fünf Mikrogramm eines GUS-Reporterplasmids und die gewünschte Menge eines Effektorplasmids gegeben. Geben Sie ultrareines Wasser in jedes Röhrchen, um das Gesamtvolumen auf fünf Mikroliter zu bringen. Geben Sie für jede Behandlung 50 Mikroliter Mikrocarrier, die in 50 % Glycerin suspendiert sind, in jedes Ein-Komma-Fünf-Liter-Röhrchen mit Plasmid-DNA.

Im letzten Schritt des Microcarrier-Codierungsverfahrens pipettieren Sie acht Mikroliter suspendierter Microcarrier auf jeden der fünf Makrocarrier und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Richten Sie den Teilchenbeschuss ein, indem Sie die Vakuumpumpe einschalten, das Heliumventil öffnen und dann das Teilchenzufuhrsystem einschalten. Setzen Sie eine 1550 psi Berstscheibe in die Haltekappe ein und montieren Sie sie auf das Partikelzufuhrsystem.

Platzieren Sie einen Makrocarrier, der die gewünschte Plasmidkombination mit einem Stoppsieb enthält, in die Microcarrier-Startanordnung. Setzen Sie die Baugruppe in den oberen Schlitz der Beschusskammer ein. Ordnen Sie dann acht embryolose Körner in einem engen radialen Muster an, wobei die dünneren Enden nach innen zeigen, auf einem Filterpapierkreis, der flach auf den Deckel einer 90-Milliliter-Petrischale geklebt ist.

Stellen Sie die Schale mit den Körnern in einem Abstand von sechs Zentimetern zum Stoppsieb in die Beschusskammer. Schließen Sie die Tür und drücken Sie den Vakuumschalter, um die Bombardementkammer auf 95 Kilopascal zu evakuieren. Drehen Sie den Vakuumschalter schnell in die Halteposition.

Halten Sie dann den Feuerschalter gedrückt, um die Probe zu bombardieren. Nach dem Lösen des Vakuums werden die beschossenen Körner in eine beschriftete 60-Millimeter-Petrischale gegeben, in der sich vier Milliliter Trinklösung mit einem Milligramm pro Milliliter Chloramphenicol befinden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Bombardements abgeschlossen sind.

Dann inkubieren Sie die beschossenen Körner auf einer Schüttelplattform bei 100 U/min bei 24 Grad Celsius für 24 Stunden. Mit einer Pinzette die acht beschossenen Körner aus der 60 Millimeter großen Petrischale nehmen und auf einem Papiertuch trocken tupfen. Teilen Sie die Körner in zwei beschriftete Zwei-Milliliter-Röhrchen auf, die jeweils 800 Mikroliter Mahlpuffer und eine fünf Millimeter dicke Edelstahlperle enthalten.

Nachdem Sie den vorherigen Schritt für alle beschossenen Körner wiederholt haben, legen Sie bis zu 48 Zwei-Milliliter-Röhrchen in zwei Gestelle eines Perlhomogenisators. Montieren Sie dann die Racks auf den Homogenisator und schütteln Sie die Proben drei Minuten lang bei 30 Hertz. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Racks aus dem Homogenisator und legen Sie sie fünf Minuten lang auf Eis, um die Proben erneut abzukühlen.

Montieren Sie nun die Racks in entgegengesetzter Richtung auf dem Homogenisator. Schütteln Sie die Proben erneut bei 30 Hertz für drei Minuten. Nachdem Sie die Racks aus dem Homogenisator genommen haben, legen Sie sie fünf Minuten lang auf Eis, um die Proben wieder abzukühlen.

Anschließend zentrifugieren Sie die Getreideextrakte bei 16.000 g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Unmittelbar nach der Zentrifugation werden die klaren Überstände in einen zweiten Satz Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt. Jedes Röhrchen kurz durchwirbeln und auf Eis lagern.

Nach dem Umfüllen des Überstands werden die Edelstahlperlen aus den Pellets zurückgewonnen, damit sie gewaschen und wiederverwendet werden können. Geben Sie nun 200 Mikroliter GUS-Assay-Puffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Geben Sie 50 Mikroliter jedes Getreideextrakts in eine der Vertiefungen und mischen Sie es mit der Pipettenspitze.

Versiegeln Sie dann die Oberseite der Platte mit Siegelfolie. Stellen Sie die 96-Well-Platte 20 Stunden lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte 10 Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius.

Wenn du fertig bist, lege den Teller auf Eis. Fügen Sie nun 250 Mikroliter Nullkomma zwei Molar Natriumcarbonat zu jeder Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte hinzu. Geben Sie sechs Komma zwei und fünf Mikroliter jeder zentrifugierten GUS-Assay-Mischung in jede Vertiefung der schwarzen Platte und mischen Sie sie mit der Pipettenspitze.

Schließen Sie Vertiefungen mit sechs Komma zwei, fünf Mikrolitern von 10-40 bei 100 Mikromolaren und vier Methylumbelliferon als Standards ein. Setzen Sie die schwarze Platte in ein Plattenfluorometer ein. Lesen Sie die Fluoreszenz von Methylumbelliferon ab, indem Sie die Verstärkung des Instruments so einstellen, dass eine Vertiefung mit sechs Komma zwei, fünf Mikrolitern von 40 Mikromol, vier Methylumbelliferon und 250 Mikrolitern von null Komma zwei molaren Natriumcarbonat einen Messwert von 100 Fluoreszenzeinheiten ergibt.

In diesem Experiment wurde ein HVA1 GUS Reporterkonstrukt zusammen mit einem UBI TaABF1 Effektorkonstrukt in Aleuronzellen eingebracht. Während ein TaABF1-HVA1-Verhältnis von nur null Komma null ausreichte, reichte eins aus, um in Abwesenheit von Exogenis, Absyssinsäure oder ABA, eine dreifache Induktion des HVA1-Reportergens zu bewirken. Höhere Spiegel des TaABF1-Konstrukts führten zu einer progressiv höheren HVA1-Expression in einer dosisabhängigen Weise.

Sowohl Exogenis, ABA als auch TaABF1 könnten die Expression des HVA1-GUS-Reporterkonstrukts stark induzieren. In beiden Fällen hemmte das Vorhandensein von einem Butanol die HVA1-Induktion stark, was darauf hindeutet, dass Phospholipase D eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1-Genexpression durch ABA durch TaABF1 spielen könnte. Es wurde gezeigt, dass ABA die Gibberellin-induzierte Expression für das Amy32b-GUS-Reporterkonstrukt stark hemmt.

Weder Wasserstoffperoxid noch Natriumnitroprussid führten zu einer signifikanten Reduzierung. Diese Ergebnisse unterstützen daher keine Rolle von Stickstoffmonoxid und Wasserstoffperoxid bei der ABA-Reaktion von Aleuronzellen. Einmal gemeistert, kann diese Technik es ermöglichen, viele verschiedene Proben in relativ kurzer Zeit auf Genexpression zu messen.

Zum Beispiel kann das Bombardement von 200 verschiedenen Getreideproben von zwei Untersuchern in ein paar Stunden durchgeführt werden. Am nächsten Tag kann ein einzelner Untersucher dann alle Proteinextrakte in zwei Stunden zubereiten. Der modifizierte GUS-Assay, der in 96-Well-Platten durchgeführt wird, erfordert auch viel weniger Arbeitsaufwand als andere Protokolle, die in Zukunft Röhrchenassays verwenden.