Name: Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Lernen Sie die Messung der Genexpression in Gerste-Aleuronschichten durch Partikelbombardement mit hohem Durchsatz. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse hormonregulierter Gene in Pflanzenzellen.

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Die Autoren danken Greyson Butler und Margaret Barrett für Hilfe bei der Durchführung der Experimente, Judy Stone für die Beratung über Korn Homogenisierung und Lynn Hannum für Beratung bei Fluorometry. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOB 0443676), durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant-Nummer P20GM0103423 und durch Zuschüsse unterstützt. die Colby College Division der Naturwissenschaften.

1. Vorbereitung der Effektor und Reportergen konstruiert
<ol><li>Effektor-Konstrukte, die konstitutiven Promoter (z. B. Mais Ubiquitin, UBI) beschäftigen Laufwerk Ausdruck aus einem gewünschten offenen Leseraster zu bauen. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit UBI::TaABF1 Antrieb stark konstitutive Ausdruck des TaABF15.</li>
	<li>Reporter-Konstrukte, die der Veranstalter enthalten, deren Aktivität gemessen werden, soll, zu bauen, platziert einen offenen Leserahmen, wie GUSvorgeschaltet. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit HVA1::GUS zur Messung der Ausdruck aus der HVA1 Veranstalter2,5.</li>
	<li>Aufbau eines internen Kontrollsystems Konstrukt (z. B. UBI::Luciferase).</li>
	<li>Mit einer Kieselsäure verbindlichen Spalte Protokoll (siehe Tabelle der Materialien), aller erforderlichen Genkonstrukte qualitativ hochwertige Plasmid vorbereiten. Mit UV-Spektroskopie (siehe Tabelle der Materialien), sorgfältig messen die Konzentration der einzelnen Plasmid-Vorbereitung.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Gerstenkörner für die Bombardierung
<ol><li>Richten Sie eine Tabellenkalkulation (siehe Abbildung 1 für ein Beispiel) unter Angabe der Plasmide, die bombardiert werden, die entsprechenden Hormonbehandlungen und andere relevante Informationen für jede Behandlung, die Teil des Experiments werden.</li>
	<li>Ein Schneidebrett mit einer sterilen Rasierklinge abgeschnitten die Embryonen aus Körnern des Himalaya Gerste (40 für jede Behandlung in das Experiment einbezogen). Schließen Sie Körner aus, die verfärbten oder wesentlich kleiner als der Durchschnitt sind.</li>
	<li>Legen Sie die embryoless Körner in einer 50 mL-Tube. 40 mL Wasser und Fels für 10 Minuten hinzufügen.</li>
	<li>Gießen Sie das Wasser sorgfältig (um nicht zu verlieren Körner) und 40 mL 10 % Bleichmittel. Rock für 20 Minuten.</li>
	<li>Gießen Sie das Bleichmittel und geben Sie 40 mL sterilem Wasser hinzu. Rock für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese steriles Wasser waschen noch viermal.</li>
	<li>40 mL Imbibing Lösung (20 mM Natrium Succinat, 20 mM-Kalzium-Chlorid, pH 5,0) zugeben und 40 μl der Stammlösung Chloramphenicol (10 mg/mL).</li>
	<li>Saugende Lösung (mit Chloramphenicol) aus der Tube in ein Vermiculit Platte übertragen (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie dann die Körner auf die Oberfläche des nassen Filterpapiers in Vermiculit Platte. Die Körner gleichmäßig verteilt. Gießen Sie in genügend saugende Lösung weiterhin die Körner teilweise (aber nicht vollständig) getaucht. Legen Sie den Deckel auf die Vermiculite-Platte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die embryoless Körner bei 24 ° C für ca. 48 h mit Leuchtstoffbeleuchtung. Fügen Sie zusätzliche Imbibing Lösung als notwendig.</li>
	<li>Öffnen Sie eine 90 mm Kunststoff Petrischale und gießen Sie selbst und 20 mL in der umgekehrten Deckel 20 mL Imbibing Lösung in die Schüssel. Fügen Sie jeweils 20 μl von Chloramphenicol (10 mg/mL hinzu). Zwei Paare der feinen Spitze Zange durch Eintauchen in Alkohol zu sterilisieren.</li>
	<li>Legen Sie ein paar der embryoless Körner in den Deckel der Petrischale. Entfernen Sie mit der Pinzette, vorsichtig (transparent) Samenschale aus jedem Korn. Beschädigen Sie beim Entfernen der Samenschale von der glatten Seite des Getreides nicht die darunter liegenden Zellen (Aleuronschicht). Übertragen Sie das geschälte Korn auf der Petrischale mit saugende Lösung.</li>
	<li>Nach dem peeling die Samenschale aller Körner, kehren sie an die Vermiculite-Platte. 16-20 Stunden inkubieren Sie die geschälten embryoless Körner bei 24 ° C.</li>
	<li>Nur vor die Körner für die Bombardierung, entfernen Sie Oberflächenfeuchtigkeit durch Schütteln sie zwischen Filterpapiere in einer Petrischale.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Plasmid-DNA für die Bombardierung
<ol><li>Beschriften Sie eine 1,5 mL-Tube für jede Behandlung, die in der Bombardierung Experiment aufgenommen werden. Hinzufügen jedes Rohr 2,5 µg von UBI::Luciferase interne Kontrolle Plasmid, 2,5 µg Plasmid ein GUS -Reporter und die gewünschte Menge (in der Regel 0,025 µg zu 2,5 µg) ein Effektor-Plasmid. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen zu 5 µL zu bringen.</li>
	<li>Bereiten Sie 1,6 µm gold-Microcarriers (siehe Tabelle der Materialien) Protokolle6veröffentlicht.</li>
	<li>Fügen Sie für jede Behandlung 50 µL abgehängte Microcarriers in der 1,5 mL Tube mit Plasmid DNA hinzu. Mantel der Microcarriers mit Plasmid DNA gemäß des Herstellers Protokolle6.</li>
	<li>Im letzten Schritt wenn Plasmid-beschichtete Microcarriers werden in 48 µL 100 % Ethanol, Pipettieren 8 μL der abgehängten Microcarriers auf jede der fünf Macrocarriers und sie an der Luft lassen trocknen.</li>
</ol>(4) Teilchen-Bombardement von Embryoless Gerstenkörner
<ol><li>Richten Sie die Partikel Bombardement-Apparat (siehe Tabelle der Materialien)6.</li>
	<li>Eine Berstscheibe 1550 Psi in den Sicherungsring Deckel aufgelegt und es auf dem Instrument.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Macrocarrier, enthält die gewünschte Plasmid-Kombination (zusammen mit einer Stopp-Bildschirm) in das Microcarrier Start Baugruppe. Fügen Sie die Assembly in den oberen Steckplatz der Bombardierung Kammer. Legen Sie den Abstand zwischen der Berstscheibe, Beibehaltung der GAP und der Macrocarrier Deckel im standard Abstand (6 mm), und legen Sie die anhalten-Screen-Unterstützung an der (standard) mittlere Position, so dass eine Macrocarrier-Reise-Entfernung von 11 mm (Abbildung 2A).</li>
	<li>8 embryoless Körner in einem engen radiale Muster (mit den dünneren enden nach innen zeigen) auf ein Filterpapier-Kreis, der sich flach auf den Deckel einer 90 mm Petrischale mit Klebeband ist zu vereinbaren (siehe Abb. 2 b).</li>
	<li>Legen Sie die Schale mit den Körnern in die Bombardierung Kammer, in einem Abstand von 6 cm vor dem Bildschirm anhalten.</li>
	<li>Evakuieren Sie die Bombardierung Kammer bis 95 kPa zu und dann bombardieren Sie die Probe.</li>
	<li>Übertragen Sie nach der Veröffentlichung des Vakuums bombardiert Körner auf einer beschrifteten 60 mm Petrischale mit 4 mL Imbibing Lösung enthält 1 mg/ml Chloramphenicol.</li>
	<li>Wiederholen Sie, bis alle die Bombardierungen durchgeführt wurden. 24 Stunden (auf einer schütteln Plattform bei 100 u/min) bei 24 ° C inkubieren.</li>
</ol>(5) Extraktion von löslichen Proteinen aus bombardiert Körner
<ol><li>Mit Pinzette, einer 60 mm Petrischale 8 bombardierten Körner entnehmen und sie auf einem Papiertuch trocken tupfen. Teilen Sie die Körner in zwei beschriftete 2,0 mL Röhrchen (4 Körner pro Röhre) jeweils 800 μl Schleifen Puffer (100 mM Na-Phosphat pH 7,2, 5 mM DVB-t, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Glycerin) und eine 5 mm Edelstahl Perle. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle bombardiert Körner.</li>
	<li>Setzen Sie die zwei Racks mit Wulst-Homogenisator (bis zu 48) 2,0 mL Röhrchen (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die Regale an den Homogenisator.</li>
	<li>Schütteln Sie die Proben bei 30 Hz, für 3 Minuten.</li>
	<li>Der Homogenisator entfernen Sie Homogenisatoren Racks und legen Sie sie auf dem Eis (5 min) die Proben wieder abkühlen lassen.</li>
	<li>Montieren Sie die Regale zurück auf den Homogenisator - in der entgegengesetzten Richtung. Die Proben wieder bei 30 Hz 3 Minuten schütteln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Regale auf Eis, kühlen Schritte 5,3 bis 5,5. Dies wird auf insgesamt 12 Minuten schütteln addieren.</li>
	<li>Die Korn-Extrakte bei 16.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten zentrifugiert.</li>
	<li>
Sofort nach der Zentrifugation Dekantieren klares Überstände in einen zweiten Satz von Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie jedes Rohr eine schnelle Wirbel. Speichern Sie die Rohre auf dem Eis.</li>
	<li>Erholen Sie nach der Übertragung des Überstands, die Stahlkügelchen aus den Pellets gewaschen und wiederverwendet werden können.</li>
</ol>6. Messung der Luciferase Aktivität aus Korn-Extrakten
<ol><li>Für jedes Rohr von Korn-Extrakt, untersucht werden, bereiten ein 12 x 75 mm Test Glasrohr mit 200 μL der Luciferase Assay Mischung (45 mM Tris Sulfat pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DVB-t, 1,5 mM EDTA, 1 mM Luciferin, 1 mM ATP).</li>
	<li>Der erste Test Tube 100 μL der ersten Getreide-Extrakt hinzufügen. Vortex: schnell, gut mischen. Sofort setzen Sie das Rohr in die Rohrhalter die Luminometer und schließen Sie die Tür. Wenn die Messung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Rohr aus Luminometer – ließ die Tür offen für die Platzierung der nächsten Röhre.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Proben gemessen wurden.</li>
</ol>7. Messung des GUS-Aktivität aus Korn-Extrakten
<ol><li>Geben Sie 200 μL der GUS Testpuffer (50 mM Na-Phosphat pH 7,2, 2,5 mM 4-Methylumbelliferyl - D-Glucuronid, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Methanol, 0,02 % Natriumazid) in jeweils einer 96-well-Platte.</li>
	<li>Platz 50 μL jeder Korn-Extrakt in das entsprechende gut. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Dichten Sie oben mit Film Abdichtung ab.</li>
	<li>20 Stunden inkubieren Sie der 96-well-Platte bei 37 ° C im Dunkeln.</li>
	<li>Die 96-well-Platte bei 4.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten Zentrifugieren und auf Eis legen.</li>
	<li>Geben Sie 250 μl 0,2 M Na2CO3 in jeder schwarz 96-well-Platte.</li>
	<li>Hinzufügen von 6,25 μL jeder zentrifugiert GUS-Assay-Mischung in das entsprechende gut (mit 0,2 M Na2CO3) des schwarzen 96 gut Platte. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Gehören Sie Brunnen mit 6,25 μL von 10 μm, 40 μm und 100 μm 4-Methylumbelliferone als Standards.</li>
	<li>Die schwarze Platte in eine Platte Fluorometer und lesen Sie die Fluoreszenz des Methylumbelliferone zu. Nehmen Sie die Messwerte bei einer Erregung Wellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm. Die Gewinn des Instruments so eingestellt, dass ein gut mit 6,25 μL 40 μM 4-Methylumbelliferone und 250 μl 0,2 M Na2CO3 eine Lesung von 1000 Fluoreszenz Einheiten gibt.</li>
</ol>8. die Datenanalyse
<ol><li>Geben Sie die Werte für die Luciferase und GUS Assays in eine Tabellenkalkulation. Ausschließen von der Betrachtung einer Probe mit einer Luciferase-Lesung von weniger als 20.000 relative Lumineszenz Einheiten s-1, da dies zeigt, dass die Genkonstrukte nicht erfolgreich auf die Aleuronschicht Zellen geliefert wurden.</li>
	<li>Für jedes erfolgreich bombardiert Korn Extrakt (als Vertreter einer Gruppe von vier embryoless Körner), den normalisierten GUS Ausdruck aus den GUS und Luciferase Rohdaten wie folgt zu berechnen: normalisiert GUS = [(Ausdruck der GUS - GUS leer) x (2.000.000)] / (Luciferase Ausdruck – Luciferase leer). Hinweis: Dies normalisiert sich die Menge der GUS-Aktivität, was in einem Bombardement beobachtet haben würde, die eine Luciferase-Lesung von 2.000.000 gab.</li>
	<li>Bericht der relativen Ebene der Ausdruck eines bestimmten Reporter-Konstrukts in Anwesenheit von Effektor Konstrukte oder Hormonbehandlungen von im Vergleich zu der Ebene des Ausdrucks in der Abwesenheit von Effektoren oder Hormone getestet.</li>
</ol>

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<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Einführung der Effektor gen konstruiert über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte ist eine sinnvolle Strategie für die Rolle von bestimmten Akteuren in GA/ABA Signalisierung und das daraus resultierende Hormon reguliert gen sezieren Ausdruck. Allerdings sind die vorhandenen Protokolle für solche Experimente in Gerste Aleuronschicht Zellen2,3,4,5<s...

Die Aleuronschicht Gerste ist eine gut etablierte Modellsystem für das Studium der Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen1. Insbesondere werden eine Reihe von Genen, die für die Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung durch Gibberellin (GA), aktiviert, während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. GA und ABA Signalwege sind miteinander verflochten, wie der Ausdruck einiger GA-aktivierten Gene von ABA und umgekehrt1gehemmt wird.
Eine sinnvolle Strategie für Verständnis, dass die Rolle von bestimmten Akteuren bei der Signalisierung GA/ABA wurde die Einführung der Effektor Genkonstrukte über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte, mit denen den daraus resultierende Effekt auf nachgeschalteten Genexpression bestimmt werden. Die Verwendung von Reporter-Gene wie GUS (β-Glucuronidase) oder Luciferase ermöglicht die sensible und quantitative Messung der Genexpression speziell innerhalb der Zellen, die die Effektor-Konstrukt erhalten haben. Zum Beispiel festgestellt die Einführung eines Effektor-Konstrukts Codierung der Transkriptionsfaktor TaABF15,6 , dass ABA-induzierten Genen wie HVA1 von TaABF1, beim GA-induzierten Genen wie Amy32b induziert werden werden unterdrückt. Teilchen-Bombardement als experimentelle Strategie wurde von mehreren Labors untersuchen verschiedene Aspekte des GA/ABA Signalisierung verwendet. Diese Arbeit führte zur Identifizierung der Promotor Elemente wichtig für die Aktivierung des GA-induzierte2 und ABA-induzierten Genen3und zur Entdeckung von Protein Kinasen4 und Transkription Faktoren5 , die Regeln der Expression dieser Gene.
Die vorhandenen Protokolle2,3,4,5,6 für Teilchen-Bombardement und Folgebewertung von transiente Genexpression sind sehr arbeitsintensiv, wie jede Gruppe von bombardiert kaum Getreide wird von Hand in einem Mörser und Stößel homogenisiert und die Enzym-Assays werden individuell durchgeführt. Diese Handschrift berichtet eine verbesserte Protokoll, das teilweise automatisiert und rationalisiert die Homogenisierung Schritt und der GUS assays um deutlich mehr Durchsatz ermöglichen eine größere Anzahl von Behandlungen im gleichen Experiment getestet werden bei schönem und/oder die Aufnahme von mehr Wiederholungen für jede Behandlung mehr statistisch solide Ergebnisse zu erzielen. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck von HVA1 und Amy32b Reporter Konstrukte, reguliert durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 sowie GA, ABA und andere regulatorische Moleküle dargestellt.

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis Spektralphotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Himalaya Gerstenkörner</td><td>/</td><td>/</td><td>Eine Vielzahl von Schalengerste (im Dunkeln bei 4° lagern; C)</td></tr><tr><td>Natriumsuccinat</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reagenz zum Trinken von</td></tr><tr><td>Calciumchlorid (Dihydrat)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reagenz zum Trinken von Lösung</td></tr><tr><td>Trinklösung</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>20 mM Natriumsuccinat, 20 mM Calciumchlorid, pH 5,0. Vor Gebrauch durch Autoklavieren sterilisieren.</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Bereiten Sie eine 10 mg/ml-Stammlösung in 70%igem Ethanol vor.</td></tr><tr><td>Vermiculit</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Wird für Vermiculitplatten verwendet.</td></tr><tr><td>Filterpapierkreise (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Wird für Vermiculit und für die Getreidevorbereitung vor dem Bombardement</td></tr> verwendet <tr><td>Vermiculit Platten</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>Geben Sie 50 mL Vermiculit in eine Petrischale aus Glas. Lege einen 90 mm großen Papierkreis auf das Vermiculit. Autoklav.</td></tr><tr><td>Pinzette (fein zugespitzt)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Wird zum Entfernen der Samenschale von Gerstenkörnern verwendet.</td></tr><tr><td>Pinzette (ultrafeine Spitze)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Wird zum Entfernen der Samenhülle von Gerstenkörnern verwendet.</td></tr><tr><td>Gold-Mikroträger (1,6 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>Makrocarriern</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (Dihydrat)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Bereiten Sie eine 2,5 M Stammlösung vor und lagern Sie 1 mL Aliquots bei -20°C.</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Bereiten Sie eine 100 mM Stammlösung vor und lagern Sie 500 μm; L aliquotiert bei -20°; C (innerhalb von 2 Monaten verbrauchen).</td></tr><tr><td>Berstscheiben (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>Stoppsiebe</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>Makroträgerhalter</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Partikelabgabesystem</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisches Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reagenz für 1M Natriumphosphat pH 7,2</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Reagenz für 1M Natriumphosphat pH 7,2</td></tr><tr><td>1M Natriumphosphat pH 7,2</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>Kombinieren Sie 6,9 g monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat mit 7,1 g Natriumphosphat zweibasisch. Fügen Sie 100 ml Wasser hinzu. Fügen Sie NaOH hinzu, um einen pH-Wert von 7,2 zu erhalten.</td></tr><tr><td>Dithiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>In Wasser bis zu 1 M auflösen. Bei -20 μ° in 1 mL Aliquoten lagern.</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>In Wasser auf 10 mg/ml auflösen. Bei -20° lagern; </td></tr><tr><td>C.glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Bereiten Sie eine 50%ige Lösung in Wasser vor.</td></tr><tr><td>Mahlpuffer</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>Kombinieren Sie 10 mL von 1 M Natriumphosphat pH 7,2, 500 &mu; L von 1 M DVB-T, 100 &mu; L von 10 mg/ml Leupeptin und 40 ml von 50% Glycerin. Fügen Sie 100 ml Wasser hinzu.</td></tr><tr><td>Edelstahlperlen (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>Dieses spezielle Röhrchenmodell wird für die Verwendung mit dem Homogenisator empfohlen.</td></tr><tr><td>Bead-Homogenisator (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Reagenzgläser aus Glas</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Bereiten Sie eine 25 mM Stammlösung vor und lagern Sie 1 mL Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Bereiten Sie eine 100 mM Stammlösung vor und lagern Sie 250 μm; L aliquotiert bei -20°; &nbsp;C.</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagenz für 1M Trissulfat pH 7,7.</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagenz für 1M Trissulfat pH 7,7.</td></tr><tr><td>1M Trissulfat pH 7,7</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>12,1 g Tris-Base in 100 mL Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit Schwefelsäure auf 7,7 ein.</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M9397</td> In <td>Wasser bis 2 M auflösen.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Buffer (LAB)</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>Kombinieren 3 mL 1 M Trissulfat pH 7,7, 500 &mu; L von 2 M Magnesiumchlorid, 1 mL von 1 M DTT und 200 μm; L von 0,5 M EDTA. Fügen Sie Wasser zu 50&nbsp; hinzu Ml.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Mischung</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>Kombinieren Sie 15 mL LAB, 800 &mu; L von 25 mM Luciferin, 200 &mu; L 100 mM ATP und 4 mL Wasser. Dadurch ergibt sich eine ausreichende Assay-Mischung (20&nbsp; mL) für 100 Luciferase-Assays.</td></tr><tr><td>Luminometer (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&beta;-D-Glucuronid (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>In DMSO auf 100 mM auflösen.</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Bereiten Sie eine 2%ige Stammlösung in Wasser vor und lagern Sie 1 ml Aliquote bei -20 °C.</td></tr><tr><td>96-Well-Platten (Standard)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS Assay-Puffer</td><td>hausgemacht</td><td>/</td><td>Kombinieren Sie 2,5 mL MUG, 5 mL 1 M Natriumphosphat pH 7,2, 400 &mu; L von 0,5 M EDTA, 1 mL von 1 M DVB-T, 100 &mu; L von 10 mg/ml Leupeptin, 20 mL Methanol und 1 ml 2% Natriumazid. Fügen Sie 100 ml Wasser hinzu.</td></tr><tr><td>TempPlate Versiegelungsfolie</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Platten (schwarz)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Bereiten Sie eine 200 mM Lösung in Wasser vor.</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferon</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Bereiten Sie ein 100 &mu; M-Lösung in Wasser. Frieren Sie 1 ml Aliquote bei -20 ° C ein. &nbsp;C.</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Fluoureszenz-Reader</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der genexpression in bombardierten gerste aleuronschicht schichten mit erhöhter durchsatz

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Die Aleuronschicht Gerstenkörner ist ein wichtiges Modellsystem für Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen. In Aleuronschicht Zellen Gene benötigt zur Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung werden aktiviert, indem Gibberellin (GA), während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. Die Mechanismen der GA und ABA Signalisierung können abgefragt werden, durch die Einführung von Reporter Genkonstrukte in Aleuronschicht Zellen über Teilchen-Bombardement, mit den daraus resultierenden transiente Expression mit Enzym-Assays gemessen. Eine verbesserte Protokoll wird berichtet, dass teilweise automatisiert und rationalisiert das Korn Homogenisierung Schritt und die Enzym-Assays, wodurch deutlich mehr Durchsatz als bestehende Methoden. Homogenisierung der Getreide Proben erfolgt über eine automatisierte Gewebe-Homogenisator und GUS (β-Glucuronidase) Assays werden mit Hilfe einer 96-Well-Platte-System durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse über das Protokoll legen nahe, dass Phospholipase D Tätigkeit eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1 Genexpression von ABA, durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 spielen kann.

Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, jeder Test Genkonstrukt in Aleuronschicht Zellen der Gerstenkörner einzuführen. Dann kann die Ebene des Ausdrucks aus dem Test-gen bequem gemessen (Abbildung 2). Die höheren Durchsatz Protokoll hier beschriebenen stark erhöht die Effizienz der Samen Schleifen und Enzym-Assay-Schritte. Diese Methode wurde zur Beurteilung der Fähigkeit der Transkription Faktor TaABF15,<sup c...

Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genexpression von Reporterkonstrukten zu messen, nachdem sie durch Partikelbeschuss in Gersten-Aleuron-Zellen eingeführt wurden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Regulation der Genexpression von Pflanzenhormonen zu beantworten, z. B. wie bestimmte Signalmoleküle wirken, um Abscisinsäure in gersteninduzierte Gene zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen höheren Durchsatz als bisherige Methoden bietet, so dass eine große Anzahl von Genkonstrukten und Inkubationsbedingungen getestet werden kann.Grace, eine Studentin in meinem Labor, wird das Protokoll vorführen. Geben Sie zunächst einige embryolose Körner in den Deckel einer 90 Millimeter großen Petrischale aus Plastik, die 20 Milliliter Trinklösung und 20 Mikroliter Chloramphenicol enthält. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig die durchsichtige Samenhülle von jedem Korn.Das Schälen der Samenschalen vom Gerstenkorn ist ein kritischer Schritt. Wenn die Samenschalen nicht vollständig entfernt werden, wird verhindert, dass die Gold-Microcarrier in die Aleuronzellen gelangen. Wird das Peeling aber zu grob durc

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Gene Microarrays sind mächtige Werkzeuge in Genexpressions-Profiling bei einer genomweiten Ebene. Diese Technologie findet Anwendung in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen Entwicklungsbiologie und Toxikologie. In diesem Video-, Detail haben wir ein Protokoll für die globale Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Oligonukleotid-Microarray-Plattform für die Zebrafisch.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Wir berichten über eine Methode für die Einführung, Überwachung und quantitative Analyse der GFP-Expression in Pflanzenzellen. Diese Methode verwendet einen speziell entworfenen Robotik-System für semi-kontinuierlichen Bildsammlung aus einer großen Anzahl von Proben, über die Zeit. Wir zeigen auch die Verwendung von ImageJ und ImageReady für die Analyse von Bildserien.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Makromolekulare Handel zwischen Pflanzenzellen können durch transiente Expression eines Fluoreszenz-markierten Proteins von Interesse und die Analyse ihrer intra-und interzelluläre Verteilung durch konfokale Mikroskopie beurteilt werden.

Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Wir haben ein Protokoll entwickelt, das schnell, sensitiv und reproduzierbar für die Erstellung von Erreger-Genexpressionsprofilen während einer Infektion ist.

Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Es wird eine Methode zur Transkription von Getreideprofilen vorgestellt. Das mikroarraybasierte Genexpressionsprofiling beginnt mit der Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA aus Getreidekörnern und setzt sich mit der Generierung von cDNA fort. Nach cRNA-Kennzeichnung und Mikroarray-Hybridisierung werden Empfehlungen zur Signalerkennung und Qualitätskontrolle gegeben.

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung

Hier wird ein Protokoll zur Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von Pflanzengeweben vorgestellt. LCM ist eine mikroskopische Technik zur kontaminationsfreien Isolierung von Gewebebereichen. Das Verfahren umfasst Gewebefixierung, Paraffineinbettung, Schnitt, LCM und RNA-Extraktion. RNA wird in der nachgeschalteten gewebespezifischen, zeitlich aufgelösten Analyse von Transkriptomen eingesetzt.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

Lernen Sie die Messung der Genexpression in Gerste-Aleuronschichten durch Partikelbombardement mit hohem Durchsatz. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse hormonregulierter Gene in Pflanzenzellen.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

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