Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Das übergeordnete Ziel dieser Chromatin-Spread-Präparation ist es, die dynamischen Lokalisationsmuster von Chromatin-gebundenen Proteinen und die Chromosomenmorphologie von Eizellen während der gesamten Säugetier-Oogenese chronologisch sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der weiblichen Fortpflanzungsbiologie zu beantworten, wie z. B. homologe Chromosomenpaarung, Synapse, DNA-Reparatur und meiotische Chromosomensegregation. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine eindeutige Immunmarkierung und Visualisierung von Proteinen ermöglicht, die mit Chromosomen assoziiert sind, und die Beurteilung der Eizellploidie.

Die Oogenese ist fehleranfällig, und eine Fehltrennung der Chromosomen führt häufig zu genetischen Erkrankungen. Diese Methode kann verwendet werden, um unser Verständnis der mütterlichen Ursachen von Aneuploidie und Unfruchtbarkeit zu verbessern. Nachdem Sie eine weibliche Maus 14 bis 19 Tage nach dem Koitum eingeschläfert haben, machen Sie eine V-förmige Öffnung in die Bauch-Becken-Höhle.

Entfernen Sie dann das mütterliche Gebärmutterhorn. Als nächstes trenne ich die Embryonen von der Plazenta und opfere die Embryonen durch Enthauptung. Dann werden sie in eine 35-Millimeter-Petrischale mit drei Millilitern PBS bei 37 Grad Celsius gegeben

Setzen Sie dann einen Welpen in eine separate Schüssel, die ebenfalls mit warmem PBS beladen ist. Nachdem Sie den Fötus eingeschläfert haben, machen Sie einen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie der hinteren Hälfte, entlang der vorderen Hälfte unterhalb der Vordergliedmaßen und direkt über den Hintergliedmaßen und dem Schwanz. Öffnen Sie als Nächstes den Bauch des Embryos mit einer 3,5-Zoll-Schere.

Verschieben oder entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die Leber und die Darmschlingen und legen Sie die Gonaden frei. Bestimme nun, ob es sich bei den Gonaden um männliche oder weibliche Gonaden handelt. Die Eierstöcke befinden sich unmittelbar unterhalb und hinter der Niere, in Richtung der hinteren Wand der Bauchhöhle.

Entfernen Sie beide Eierstöcke mit einer Pinzette mit feiner Spitze und geben Sie sie in einen kleinen Behälter mit PBS, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Fahren Sie schnell fort, um die Eierstöcke von allen Föten zu entnehmen. Tauchen Sie anschließend jeden einzelnen Satz Eierstöcke in einen neuen kleinen Behälter vollständig in einen halben Milliliter frisch hergestellten Hypoextraktionspuffer.

Lassen Sie sie mindestens 15 Minuten, aber nicht länger als 30 Minuten bei 25 Grad Celsius inkubieren. Zeichnen Sie während der Inkubation mit einem hydrophoben Barriere-PAP-Stift zwei 22 x 22 Millimeter große Quadrate auf einen sauberen Objektträger. Bereiten Sie für jeden Satz Eierstöcke einen Objektträger vor.

Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, geben Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen 100 millimolare Saccharose auf einen sauberen Objektträger und geben Sie ein Paar Eierstöcke in den Tropfen. Verwenden Sie nun zwei 27-Gauge-Nadeln, um die Eierstöcke zu necken und die darin befindlichen Zellen freizusetzen. Entfernen Sie mit einer Pinzette die großen Eierstockstücke und entsorgen Sie sie.

Pipettieren Sie dann vorsichtig die Saccharoselösung, um die freigesetzten Zellen zu dispergieren. Laden Sie anschließend jedes Quadrat auf einen Objektträger mit 40 Mikrolitern 1 % PFA und 0,2 % Triton X-100. Verteilen Sie die Lösung mit einer Pipettenspitze oder indem Sie den Schieber hin und her bewegen.

Laden Sie dann für jeden Pool Saccharoselösung mit Zellen zwei Fixierpfützen mit 20 Mikrolitern suspendierten Zellen, so dass jeder Objektträger Zellen aus einem Satz Eierstöcke enthält. Bereiten Sie für die Entnahme von MI- oder MII-Eizellen zuerst die Spendermaus vor und euthanasieren Sie sie. Machen Sie dann eine große V-förmige Öffnung in die Bauch-Becken-Höhle und verwenden Sie eine Pinzette, um den Darm zu verschieben, um jedes Gebärmutterhorn zu lokalisieren.

Finden Sie die Eierstöcke proximal zum Brustkorb. Halten Sie den Eileiter mit einer feinen Pinzette fest und schneiden Sie das Fett oberhalb des Eierstocks mit einer Präparierschere ab. Während Sie den Eileiter noch halten, lösen Sie den Eierstock mit einer feinen Zange aus dem Schleimbeutel und geben Sie die Eierstöcke in eine Auffangschale mit Medium, das bei 37 Grad Celsius gehalten wird.

Um Eizellen im GV-Stadium zu entnehmen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel, um die Kumulus-Eizell-Komplexe freizusetzen, indem Sie die großen Antralfollikel manuell punktieren. Um Eizellen im MII-Stadium zu sammeln, reißen Sie ein Loch in die Ampulle des Eileiters, um sie freizusetzen, anstatt einfach eine Punktion zu machen. Entnehmen Sie nun die Eizellen mit einer mundbetriebenen Glaspipette oder Kapillare oder verwenden Sie eine handbetriebene Mikrometerspritze.

Einige Eizellen können von Kumuluszellen umgeben sein, andere nicht. Bereiten Sie für die MI-Eizellen frische Hyaluronidase in MEM-alpha/BSA vor, um die Eizellen der umgebenden Kumuluszellen zu entblößen. Behandeln Sie jede Entnahme von Eizellen drei Minuten lang in einem Inkubator mit 2,5 Millilitern vorbereiteter Hyaluronidase.

Übertragen Sie dann die MI-Eizellen in frisch hergestelltes warmes MEM-alpha/BSA-Medium. Verwenden Sie dort eine mundbetriebene Glaspipette, um die Scherkraft zu erzeugen, die erforderlich ist, um die Kumuluszellen vollständig zu lösen. Im Allgemeinen erfordert der Erfolg dieses Verfahrens die Beherrschung der Eizellentnahme und -manipulation mit mundbetriebenen Glaspipetten oder Kapillaren.

Lassen Sie die Eizellen im Inkubator sich erholen. In der Zwischenzeit werden in eine erhitzte Neun-Well-Glasplatte 300 Mikroliter warme Tyrode-Lösung geladen. Beladen Sie zwei Vertiefungen mit 300 Mikrolitern warmem MEM-alpha/BSA und eine Vertiefung mit 300 Mikrolitern warmem Waymouth-Medium.

Um die Zona pellucida zu entfernen, werden fünf bis 10 MI- oder MII-Eizellen für nur 30 bis 45 Sekunden in das Bad der Tyrode-Lösung gegeben, während sie unter einem Präpariermikroskop beobachtet werden. Wenn die Zona pellucida sichtbar aufgelöst ist, übertragen Sie die Eizellen sofort mit einer Pipette, die mit MEM-alpha/BSA-Medium vorgetränkt ist, in das Medium. Übertragen Sie dann die Eizellen in ein zweites Bad mit erwärmtem Medium.

Nach dem zweiten Bad werden die Eizellen in das warme Medium von Waymouth überführt und 30 Minuten lang in einem Inkubator ruhen gelassen. Zur Vorbereitung einer Chromatinausbreitung zeichnen Sie mit einem PAP-Stift ein 11 x 44 Millimeter großes Rechteck auf einen Objektträger. Bestreichen Sie den Objektträger anschließend mit einer dünnen Schicht aus 1 % PFA und 0,2 % Triton X-100 in Wasser und schaukeln Sie dann den Objektträger hin und her, um die Lösung zu verteilen.

Tippen Sie dann auf die Folie, um den Überschuss zu entfernen. Saugen Sie nun zwischen fünf und 10 Eizellen mit einer minimalen Menge an Medium ab. Übertragen Sie dann die Eizellen auf den vorbereiteten Objektträger, indem Sie gleichzeitig eine Pipettenspitze durch die Fixierlösung ziehen und die Eizellen aus etwa einem Zentimeter Höhe auf den Objektträger fallen lassen.

Die Eizellen sollten sofort platzen und das Chromatin auf dem Objektträger verteilen. Inkubieren Sie nun die Objektträger bei Raumtemperatur in einer geschlossenen befeuchteten Kammer. Lassen Sie sie über Nacht einwirken, damit das Chromatin am Objektträger haftet.

Die beschriebene embryonale Chromatinsammlung wurde verwendet, um die Crossover-Bildung in Eizellen, die aus C57 black/6J-Embryonen entnommen wurden, quantitativ zu analysieren. Prophase-Chromatin-Spread-Präparate wurden immunmarkiert, um SYCP3, SYCP1 und MLH1 nachzuweisen, und mit DAPI gefärbt. Chromosomen im Pachytenstadium wiesen 27 MLH1-Foki auf, die auf 20 vollständig assemblierte SC-Strukturen verteilt waren.

Wenn das Präparat suboptimal war und einzelne Chromosomen nicht unterscheidbar waren, wurde das Präparat nicht in die Bewertung einbezogen. In guten Präparaten wurde SMC6 an der perizentromeren Heterochromatinregion und entlang der Chromosomenarme angereichert, und die MLH1-Foki verteilten sich entlang des SC im Pachytenstadium. Die Anzahl der MLH1-positiven Crossover aus 15 guten Wildtyp-Präparaten betrug etwa 24.

Die Methode der Eizellentnahme wurde verwendet, um die Chromatinmorphologie in Eizellen nach Wiederaufnahme der meiotischen Regeneration zu beurteilen. Sowohl die Proteinlokalisation als auch die Ploidie konnten leicht beurteilt werden, was mögliche Ursachen für Chromosomensegregationsfehler aufdeckte. Die Topoisomerase II-alpha war entlang der Chromosomenarme und des perizentromeren Heterochromatins zu sehen.

In MII-Eizellen konnten paarige Schwesterchromatiden anhand der Chromosomen- und Zentromermorphologie unterschieden werden. Einmal gemeistert, können diese Techniken ohne oder nach der Kultivierung innerhalb von ein bis zwei Stunden per Maus durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere komplementäre Methoden, wie die Immunmarkierung von Ganzzell-Eizellen und die Bildgebung lebender Zellen, durchgeführt werden, um homologe Chromosomen und Schwesterchromatiden im Kontext der Zelle zu beurteilen.

Zusammenfassend können die hier beschriebenen Chromatinausbreitungsmethoden leicht angewendet werden, um die Oogenese von Säugetieren und die sexuell dimorphen Merkmale der Chromosomen- und Proteindynamik während der Meiose zu beurteilen.