Name: Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Lernen Sie die zweidimensionale Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie zur Analyse des Proteoms menschlicher Hypophysenadenome. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung niedrig abundanter Proteine.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation von China (Grant Nr. 81572278 und 81272798 zur XZ), die Zuschüsse aus der Hunan, China "863" Plan-Projekt (Grant No. 2014AA020610-1, XZ) und die Xiangya Krankenhaus Fonds für Talent (XZ) unterstützt. Provinzielle Natural Science Foundation von China (Grant No. 14JJ7008, XZ). Die Autoren erkennen auch die wissenschaftliche Beiträge von Dr. Dominic M. Desiderio in der University of Tennessee Health Science Center. X.Z. kontinuierlich entwickelt und 2DE-MS-Methoden verwendet, um die Hypophyse Adenom Proteom ab 2001 zu analysieren, konzipiert das Konzept für das vorliegende Manuskript, schrieb das Manuskript überarbeitet, koordinierte die einschlägige Arbeit und war verantwortlich für die finanzielle Unterstützung und entsprechende Arbeit. YL beteiligte sich an der Überarbeitung des Manuskripts. YH teilgenommen Sammlung von Referenzen und Überarbeitung des Manuskripts. Alle Autoren genehmigt das endgültige Manuskript.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

2de, gepaart mit MS Methoden einschließlich 2DE-MS PMF und 2DE-MS/MS, erfolgreich eingesetzt in unserem langfristigen Programm - die Verwendung von Proteomics, menschliche NFPA Proteomic Variationen und molekulare Netzwerk Variationen für die Aufklärung der molekularen Mechanismen zu studieren und Entdeckung der effektive Biomarker für NFPAs. 2de basierte vergleichende Proteomik mit gute Reproduzierbarkeit spielt eine wichtige Rolle bei der Identifizierung von NFPA Proteomic Variationen9,</su...

PA ist ein gemeinsames Tumor, der Auftritt in der menschlichen Hypophyse in der Hypothalamus-Hypophysen-bezogene Achse Organsysteme, die in das menschliche Hormonsystem eine wichtige Rolle spielen. PA enthält klinisch funktionelle und nicht funktionsfähige PAs (FPA und NFPA)1,2. NFPA ist im frühen Stadium-Diagnose und Therapie schwierig, weil nur leicht erhöhten Hormonspiegel im Blut im Vergleich zu FPA, die Ebenen der entsprechenden Hormone im Blut3,4 deutlich zugenommen hat (z.B.LH und FSH) ,5. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen und Entdeckung der effektive Biomarker hat wichtigen klinische Bedeutung in der Diagnostik, Therapie und Prognose der NFPA. Unser langfristige Ziel ist es, entwickeln und Proteomik Methoden verwenden, um NFPA für die Entdeckung der verlässliche Biomarker zu klären, die molekularen Mechanismen zu untersuchen und wirksame therapeutische Targets sowie diagnostische und prognostische Marker zu erkennen. 2-DE gepaart mit MS Methoden worden ausführlich in unserer langfristigen Forschungsprogramms über menschliche PA Proteom1,2,6,7, einschließlich Errichtung des Proteoms Referenz benutzt 3,8, Analyse differentiell exprimierten Protein Profile9,10,11,12,13, Hormon-Varianten14 Karten ,15, post-translationalen Modifikationen wie Phosphorylierung14 und Tyrosin Nitrierung16,17,18, die Proteomik-Variation der invasiven relativ zu nicht-invasive NFPAs19und der Proteomik Heterogenität der NFPA Subtypen13, führte zu die Entdeckung mehrerer wichtiger Signalweg Netze (mitochondriale Dysfunktion, Zellzyklus Dysregulation, oxidativen Stress und MAPK signaling System-Anomalie), NFPA13,19,20verändert werden.
2de trennt Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) (isoelektrischen Fokussierung, IEF) und Molekulargewicht (über Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dies ist eine gemeinsame und klassische Trennung Technik im Bereich der Proteomik, seit der Einführung der Konzepte der Proteom und Proteomics in 199524. MS ist die entscheidende Technik um herauszufinden, die Identität des 2DE getrennt Proteine, einschließlich PMF und MS/MS-Strategien. Die sehr rasche Entwicklung der MS Instrumente, insbesondere die Aspekte der Empfindlichkeit und Auflösung, in Kombination mit der Verbesserung der LC-System verbessert die Identität des gering oder sehr gering Fülle Proteine in einem Proteomforschung zur Maximierung der Berichterstattung über ein Proteome. Es fordert auch unsere traditionelle Konzepte, dass nur ein oder zwei Proteine befinden sich in einem 2D Gel vor Ort in einer Analyse der komplexen menschlichen Gewebes Proteom und bietet die Möglichkeit, mehrere Proteine in einem 2D Gel vor Ort in einer Analyse des komplexen menschlichen Gewebes zu identifizieren Proteome und maximieren Sie die Abdeckung des NFPA Proteoms.
Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle der 2DE MALDI-MS-PMF, 2DE MALDI-MS/MS und 2DE-LC-MS/MS, die erfolgreich in der Analyse des menschlichen Proteoms NFPA verwendet wurden. Die Protokolle sind Vorbereitung von Proben, zunächst Bemaßung (isoelektrischen Fokussierung, IEF), zweite Dimension (SDS-PAGE), Visualisierung von Proteinen (silberne Färbung und Coomassie blaue Färbung), Bildanalyse von 2D Gel, in Gel Trypsin-Verdauung Reinigung von tryptic Peptide, PMF, MS/MS und anbraten3,8,25,26-Datenbank. Darüber hinaus übersetzt dieses Protokolls leicht für die Analyse von anderen menschlichen Gewebes Proteome.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGphor 3&nbsp;</td><td>Isoelektrisches Fokussiersystem</td> <td>von GE Healthcare</td><td></td>.</tr><tr><td>Ettan DALTsix Multigel-Gießanlage</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALT II System</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>Das vertikale Elektrophorese-System</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor Streifenhalter</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix Multigel-Gießanlage</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>Multigel-Rolle</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp;</td><td>ABI, Foster City, CA</td><td></td><td>MALDI-MS PMF</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td><td>MALDI-MS/MS Massenspektrometer</td></tr><tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>ESI-MS/MS Massenspektrometer</td></tr><tr><td>EASY-nano LC System&nbsp;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Dänemark</td><td></td><td>Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-System</td></tr><tr><td>PepMap C18 Fallensäule</td><td>300 &mu; m i.d. & mal; 5 mm Länge; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Spalte</td><td>75 &mu; m i.d., 15 cm Länge; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimvipe&nbsp;</td><td></td><td>Unlösliches Papiertuch</td></tr><tr><td>Watter</td><td>Hergestellt von PURELAB Flex Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron Modell P710/35 Homogenisator</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp; Hercules, CA</td><td></td><td>2D-Gel-Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (Version Nr. 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DataExplore (Version 4.0.0.0) Software</td><td></td><td></td><td>MS-Spektrum-Verarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Mascot-Software</td><td></td><td></td><td>PMF-basierte Software zur Proteinsuche&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mascot-Software</td><td></td><td></td> MS<td>/MS-basierte Software für die Suche nach Proteinen</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer-Software v.1.3 beta</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur-Software v.2.1</td><td></td><td></td><td>MS/MS-Software für die Datenerfassung</td></tr><tr><td>Uniprot Version 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>Datenbank für humane Proteine</td></tr><tr><td>SEQUEST (Version Nr. 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MS-basierte Software zur Suche nach Proteinen I</td></tr><tr><td>MASCOT (Version 2.3.02)</td><td></td><td></td><td>MS/MS-basierte Software für die Proteinsuche II</td></tr><tr><td>C18 ZipTip Mikrosäule</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass Standard Kit&nbsp;</td><td>Perspective Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-ACRYLAMID</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>ACRYLAMID</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Thioharnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>IPG-Puffer pH 3-10, NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline Trockenstreifen pH 3-10NL,18cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

zweidimensionaler gelelektrophorese gekoppelt mit massenspektrometrie methoden für eine analyse der menschlichen hypophyse adenom gewebe proteom

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Menschlichen Hypophysen Adenom (PA) ist ein gemeinsames Tumor, der tritt in der menschlichen Hypophyse in der Hypothalamus-Hypophysen-bezogene Achse Organsysteme, und kann als klinisch funktionsfähig oder nicht funktionsfähige PA (FPA und NFPA) eingestuft werden. NFPA ist schwierig für Bühne Frühdiagnostik und Therapie durch Hormone im Blut im Vergleich zu FPA kaum erhöhen. Unser langfristige Ziel ist es, Proteomics Methoden verwenden, um verlässliche Biomarker zur Klärung der PA molekularen Mechanismen und Anerkennung der effektive diagnostische, prognostische Marker und therapeutischen Ziele zu entdecken. Effektive zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) Methoden wurden hier vorgestellt, um menschliche PA Proteome, einschließlich Vorbereitung von Proben, 2D Gelelektrophorese, Protein-Visualisierung, Bildanalyse, in-Gel zu analysieren Trypsin-Verdauung, Peptid Masse Fingerabdruck (PMF) und Tandem Massenspektrometrie (MS/MS). 2-dimensionale Gel-Elektrophorese Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie PMF (2DE MALDI-MS-PMF), 2DE MALDI-MS/MS und 2DE-Liquid Chromatographie (LC)-MS/MS-Verfahren zur Analyse der NFPA Proteom erfolgreich angewendet wurden. Mit dem Einsatz eines Massenspektrometers hochempfindlichen wurden viele Proteine mit 2DE-LC-MS/MS-Methode in jedes 2D Gel vor Ort in einer Analyse der komplexen PA-Gewebe um die Deckung des menschlichen Proteoms PA zu maximieren identifiziert.

1. 2DE MALDI-MS-PMF: mit dem oben beschriebenen experimentellen Verfahren wurden insgesamt 150 µg Proteine aus FSH ausgedrückt NFPA Gewebe extrahiert (weiblich; 50 Jahre alt, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-) (+), FSH und TSH (-)) und bekleidet mit einem 18 cm IPG-Streifen (pH 3-10 NL) und ein Großformat-SDS-PAGE Gel, visualisiert mit silbernen Färbung. Wir erhalten eine reproduzierbare und gute 2DE Gel Muster der NFPA Gewebe Proteom (<strong class="xfig"...

Hier präsentieren wir Ihnen eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) zu trennen und menschlichen Hypophysen Adenom Gewebe Proteom, stellt eine gute und reproduzierbare 2DE Muster identifizieren. Viele Proteine werden in jedem 2DE Fleck beobachtet, bei der Analyse von komplexen Krebs Proteome mit dem Einsatz von hochempfindlichen MS.

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Das übergeordnete Ziel dieser zweidimensionalen Gelelektrophorese in Verbindung mit dem Massenspektrometrieverfahren ist die Trennung und Identifizierung des menschlichen Hypophysenadenom-Gewebeproteoms. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteome zu beantworten. Wie zum Beispiel ein hohes Proteom.Und Entdeckung der Proteinsituation, des Proteins vier und des Proteinraums. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die zweidimensionale Gelelektrophorese leicht mit hochempfindlicher Massenspektrometrie gekoppelt werden kann, um Proteome, insbesondere Proteine mit geringer Abundanz, zu identifizieren. Proteinsituation, Protein vier und Protein geräumig.Die Implementierungen dieser Technik sind tendenziell auf die Therapie von Tieren ausgerichtet. Aufgrund des Schlüsselproteins für das Protein, das räumlich ist, ist das Proteinmuster bei der Diagnose des Patienten nützlich. Wir zeigen, dass eine Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung ist, da die zweidimensionalen Gelelektrophoreseschritte schwer zu erlernen sind, da sie zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind und es mehrere experimentelle Tricks gibt.Um dieses Verfahren zu starten, geben Sie 250 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten Proteinprobenlösung in jeden Schlitz eines 13 Zentimeter großen IPG-Streifenhalters. Legen Sie einen 18 Zentimeter großen IPG-Streifen mit der Gelseite nach unten auf jede Proteinprobenlösung und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Fügen Sie dann drei bis vier Milliliter Mineralöl hinzu, um jeden IPG-Streifen zu bedecken.Montieren Sie als Nächstes jeden IPG-Streifenhalter zu einem isoelektrischen Fokussiersystem, wobei sich das spitze Ende auf der Rückplatte und das quadratische Ende auf der Frontplatte befindet. Nachdem Sie die IPG-Streifen 18 Stunden lang bei Raumtemperatur rehydriert haben, stellen Sie die IEF-Parameter am isoelektrischen Fokussierungssystem mit einer Gesamtlaufzeit von 7,5 Stunden und 36.875 Voltstunden ein. Nehmen Sie nach IEF jeden IPG-Streifen aus dem isoelektrischen Fokussiersystem und entfernen Sie das überschüssige Mineralöl mit einem unlöslichen Papiertuch.Wickeln Sie dann jeden Streifen in ein Blatt Frischhaltefolie ein und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Um ein 12%iges PAGE-Gel zu gießen, fügen Sie doppelt destilliertes Wasser, 1,5 molare Tris-Salzsäurepuffer, 40% Acrylamid, Bis-Acrylamid-Stammlösung, 10% Immodiumpersulfat hinzu und geben Sie es in ein Becherglas. Mischen Sie die Gellösung vorsichtig und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden.Gießen Sie die Gellösung vorsichtig in eine Multicasting-Kammer bis zur erwarteten Gelhöhe von 19 Zentimetern. Geben Sie sofort etwa drei Milliliter doppelt destilliertes Wasser in die Multigießkammer, um jedes auflösende Gel zu bedecken, und lassen Sie jedes Gel etwa eine Stunde lang polymerisieren. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um ein hochwertiges SDS-PAGE-Gel herzustellen, und das Wasser muss sofort auf jedes Gel aufgetragen werden.Bereiten Sie zwei Liter Elektrophoresepuffer vor und geben Sie den Puffer in einen Puffertank der Elektrophorese-Trenneinheit. Nachdem Sie die fokussierten IPG-Streifen aus dem Gefrierschrank genommen haben, legen Sie sie in ein Kunststoffgefäß, das einen Milliliter reduzierenden Gleichgewichtspuffer und eine Spur Bromphenolblau enthält, und äquilibrieren Sie sie 10 Minuten lang unter leichtem Schaukeln. Nach Entfernen des reduzierenden Gleichgewichtspuffers geben Sie vier Milliliter Exkalationsgleichgewichtspuffer und eine Spur Bromphenolblau zu den IPG-Streifen und äquilibrieren sie 10 Minuten lang unter leichtem Schaukeln.Während des Gelgleichgewichts die Multicasting-Kammer zerlegen und die vorbereitete auflösende Gelkassette entfernen. Spülen Sie die Gelkassette dreimal mit doppelt destilliertem Wasser aus, entfernen Sie dann mit einem unlöslichen Papiertuch das Zugangswasser aus der Gelkassette und legen Sie sie in einen Gelständer. Spülen Sie anschließend die äquilibrierten IPG-Streifen mit Elektrophoresepuffer ab und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf jeder IPG-Streifenoberfläche mit einem unlöslichen Papiertuch.Legen Sie einen IPG-Streifen auf das auflösende SDS-PAGE-Gel, so dass die Kunststoffseite des IPG-Streifens mit dem spitzen Ende nach links die längere Glasplatte berührt. Fügen Sie nun schnell drei bis vier Milliliter heiße 1%ige Agarose und SDS-Elektrophoresepuffer hinzu, um den IPG-Streifen auf der Oberseite jedes SDS-PAGE-Gels zu versiegeln, und legen Sie die Oberseite des IPG-Streifens nach unten auf die Oberseite der kürzeren Glasplatte, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Diese Schritte sind sehr wichtig, um den IPG-Streifen mit dem SDS-PAGE-Gel zu versiegeln.Die heißen Agaroselösungen müssen sofort hinzugefügt werden, und der IPG-Streifen muss sofort in die Oberseite des SDS-Gels eingebracht werden. Nach der Polymerisation wird die zusammengebaute Gelkassette in einem vertikalen Elektrophoresesystem senkrecht zwischen die Kunststoffdichtungen eingeführt. Legen Sie die Oberseite des Gels mit dem IPG-Streifen neben die Kathode.Passen Sie als Nächstes den Gehalt an Elektrophoresepuffer an, um die Gelkassette einzutauchen, indem Sie dem Elektrophoresesystem das entsprechende Volumen Puffer hinzufügen. Schließen Sie das Netzteil an und stellen Sie es in den Konstantspannungsmodus und lassen Sie es ca. 370 Minuten lang mit 200 Volt laufen, während Sie den Farbstoff überwachen. Nehmen Sie nach Beendigung des Laufs die Gelkassette aus dem Elektrophoresesystem und entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Gelkassette, wobei Sie darauf achten, dass das Gel nicht reißt.Übertragen Sie das Gel vorsichtig auf eine Schale mit 250 Millilitern Fixierlösung und schütteln Sie das Gel vorsichtig 20 Minuten lang. Entsorgen Sie anschließend die Lösung und geben Sie 250 Milliliter 50%Methanol in die Schale. Schütteln Sie das Gel dann vorsichtig für 10 Minuten.Nachdem Sie das Gel in doppelt destilliertem Wasser geschüttelt haben, fügen Sie 250 Milliliter Sensibilisierungspuffer hinzu, der 0,02% Natriumsulfat enthält. Schütteln Sie das Gel eine Minute lang vorsichtig. Nachdem Sie das Gel zweimal in doppelt destilliertem Wasser geschüttelt haben, fügen Sie 250 Milliliter Silberreaktionslösung hinzu und schütteln Sie das Gel vorsichtig 20 Minuten lang.Nachdem Sie das Gel in doppelt destilliertem Wasser geschüttelt haben, fügen Sie 250 Milliliter Entwicklungslösung hinzu und schütteln Sie es vorsichtig, bis die gewünschte Färbung erreicht ist, was in der Regel ein bis drei Minuten dauert. Fügen Sie nun 250 Milliliter 5%ige saure Säure hinzu, um die Verfärbung zu beenden, und schütteln Sie das Gel vorsichtig 10 Minuten lang. Nachdem Sie das Gel in doppelt destilliertem Wasser geschüttelt haben, fügen Sie 250 Milliliter 8,8%iges Glycerin hinzu und lagern Sie das Gel bis zur Analyse bei vier Grad Celsius.Ein reproduzierbares und gutes zweidimensionales Gelmuster des NFPA-Gewebeproteoms wurde durch Gelelektrophorese mit etwa 1.200 Proteinspots in der zweidimensionalen Gelkarte detektiert, die hauptsächlich im Bereich von pH vier bis acht und einer Masse von 15 bis 150 Kilodalton verteilt waren. Insgesamt wurden 192 redundante Proteine aus 141 der 337 analysierten Gelspots in der MALDI-MS PMF-Analyse identifiziert, und in den restlichen 196 Spots wurde kein Protein identifiziert. Die Färbung mit Commassie-Blau ergab ein reproduzierbares und qualitativ hochwertiges zweidimensionales Gelmuster des invasiven NFPA-Gewebeproteoms und etwa 1.100 Proteinspots, die in einer zweidimensionalen Gelkarte nachgewiesen wurden und hauptsächlich im Bereich von pH vier bis acht und einer Masse von 15 bis 150 Kilodalton verteilt waren.Durchschnittlich ein Protein pro Spot wurde mit der MALDI tof tof MS MS-Analyse identifiziert. Dabei wurden ebenso viele Proteine an jedem entsprechenden Spot mit der LC-ESI-MS/MS-Analyse identifiziert. Diese Daten zeigen deutlich, dass jeder zweidimensionale Gel-Spot viele Proteine im komplexen Proteom des menschlichen Krebsgewebes enthält.Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in 32 Stunden für die zweidimensionale Gelelektrophorese durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Schritte zu befolgen, insbesondere gemäß dem Protokoll. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die stabile Markierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Kodierung von Proteinen im Proteom zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Proteinmixes, um in größerem Maßstab nachtranslationale Modifikationen von Proteinen mit geringer Abundanz, Proteinspezialisierung, Proteinraum und Protein vier unter Modellbedingungen, Patienten und Organsystemen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine zweidimensionale Gelelektrophorese in Verbindung mit Massenspektrometrie durchführen, um ein gutes und reproduzierbares zweidimensionales Gelelektrophoresemuster zu erzielen und viele Proteine an jedem Punkt zu identifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit SDS-Achreomie und TEMED äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Plastikhandschuhen getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

Quelle: Wulf, M., et.al.  Lasermikrodissektionsbasiertes Protokoll für die LC-MS/MS-Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granula. J. Vis. Exp. (2021). Dieses Video zeigt die Analyse von Peptidproben aus Neuromelanin-Granula (NMGs), die aus menschlichem postmortalem Hirngewebe isoliert wurden. Die Peptide werden zunächst mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt und anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert, um ihr Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) zu...

LC-MS/MS Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten, die aus menschlichem Hirngewebe isoliert wurden

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das zwei Paare Proteom-Techniken, nämlich 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) und Massenspektrometrie (MS), differentiell zwischen zwei oder mehr Gruppen von Primärproben ausgedrückt identifizieren / post-translationale modifizierten Proteinen. Dieser Ansatz, der zusammen mit funktionellen Experimenten ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Prognosemarkern / therapeutische Ziele.

Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

Eingehende Analysen von Krebszellproteomen erleichtern die Identifizierung neuer Wirkstoffziele und diagnostischer Biomarker. Wir beschreiben einen experimentellen Workflow zur quantitativen Analyse von (Phospho-)Proteomen in Krebszell-Subpopulationen, die aus flüssigen und festen Tumoren stammen. Dies wird durch die Kombination von zellulären Anreicherungsstrategien mit quantitativer Super-SILAC-basierter Massenspektrometrie erreicht.

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Extrahieren und Phosphopeptides von Prostatakrebs-Zelllinien oder Gewebe für eine Analyse der Phosphoproteome per Massenspektrometrie-basierte Proteomics zu bereichern.

Phosphopeptide Bereicherung gepaart mit quantitativen markierungsfreie Massenspektrometrie zu untersuchen, die Phosphoproteome bei Prostatakrebs

Hier etablieren wir eine massenspektrometrische proteomische Methode unter Verwendung isolierter Regionen von Interesse in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Dieses Protokoll wird verwendet, um Proteome aus bestimmten Gewebebereichen in archivierten formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten zu analysieren.

Ein optimierter Ansatz für die massenspektrometrische Proteomik unter Verwendung ausgewählter Geweberegionen

Dieses Protokoll bereitete erfolgreich ausreichend hochwertiges neovaskuläres Gewebe aus Gliomproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion für eine quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese vor, überwand die Einschränkungen von Studien, die traditionell hauptsächlich auf angiogene Faktoren fokussiert sind, und lieferte ein großflächiges proteomisches Profil der Gliomangiogenese.

Präparation von neovaskulären Geweben aus humanen Gliomgeweben für quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragmentanalyse diskutiert, die eine schnelle und effiziente direkte Messung der Telomerlänge ermöglicht. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Zellquellen von DNA zur Quantifizierung der Telomerlänge angewendet werden.

Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

Lernen Sie die zweidimensionale Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie zur Analyse des Proteoms menschlicher Hypophysenadenome. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung niedrig abundanter Proteine.

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom (Video) | JoVE Journal

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

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