Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine stabile Integration eines interessierenden Gens in das menschliche Genom von Primärzellen durch das transkriptionell regulierte Dornröschen-System zu erreichen, das in integrationsdefekte lentivirale Vektoren verpackt ist. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Gentherapie zu beantworten, wie z. B. die Integration des interessierenden Gens in Primärzellen mit Hilfe des Dornröschen-Systems. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das induzierbare hyperaktive Dornröschen-System effizient Primärzellen liefert, die gegen verschiedene Transfektionsmethoden resistent sind.

Das Verfahren wird von Daniela Benati, einer Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert. Vor dem Tag der Transduktion werden die humanen primären Keratinozyten gezüchtet, wie im Textprotokoll beschrieben. Um subkonfluente Keratinozyten in Kultur abzulösen, entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 1X PBS und geben Sie einen Milliliter vorgewärmte Trypsin-Arbeitslösung in jede Vertiefung

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Resuspendieren Sie die Zellen einer Vertiefung gründlich und überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern serumhaltigem Medium. Spülen Sie die Vertiefung einmal mit drei Millilitern 1X PBS und geben Sie die gespülte Lösung mit der Zellsuspension in das Zentrifugenröhrchen.

Bei 580 mal g fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS, zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 580-mal g und entsorgen Sie den Überstand. In einem 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen 1,6 mal 10 bis zum fünften Keratinozyten in einem Milliliter CFAD-Medium verdünnen.

Bereiten Sie eine Verdünnung für jede Bedingung vor. Die drei integrationsdefekten, lentiviralen oder IDLV-Vektoren wurden bereits früher hergestellt, wie im Textprotokoll beschrieben. IDLVTKSB trägt die TET-regulierten hyperaktiven SB100X-Transponierungen.

IDLVrtTA kodiert für den Modulator und IDLVT2 trägt das Gen von Interesse. GFP in diesem Beispiel flankiert von invertierten Transposon-Wiederholungen. Die lentiviralen Vektoren werden in einem Milliliter CFAD-Medium in Gegenwart von 20 Mikrolitern Polybren verdünnt, wie in dieser Tabelle angegeben.

Eins, Zwei und Drei sind Negativkontrollen ohne Vektoren. Vier und fünf enthalten IDLVTKSB und IDLVrtTA. Sechs, sieben, acht und neun enthalten alle drei lentiviralen Vektoren.

Transduzieren Sie Zellen in Suspension, indem Sie jede lentivirale Vektorverdünnung zur entsprechenden Keratinozytensuspension hinzufügen. Entfernen Sie das Medium aus letal bestrahlten 3T3-J2-Feeder-Zellen, die sich vor einem Tag zurückgebildet haben, und plattieren Sie die transduzierten Keratinozyten auf sie. Nachdem Sie eine Vertiefung transduziert haben, fahren Sie mit der nächsten fort.

30 Minuten bei 25 Grad inkubieren. Versetzen Sie dann die Zellen sechs Stunden lang auf 37 Grad. Geben Sie nach sechs Stunden einen Milliliter CFAD-Medium in jede Vertiefung

Geben Sie ein Mikromolar Doxycyclin in die Vertiefungen fünf, acht und neun. Bringen Sie die Zellen wieder auf 37 Grad Celsius zurück. Verarbeiten Sie anschließend die Zellen in jeder Vertiefung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Für die zytofluorimetrische Analyse müssen die transduzierten primären Keratinozyten, die am dritten und sechsten Tag abgelöst wurden, von der 3T3-J2-Feeder-Schicht unterschieden werden, indem die Zellen mit monoklonalen APC-konjugierten Antifeeder-Antikörpern der Maus markiert werden. Bereiten Sie vier Milliliter Färbepuffer für jede Probe vor, indem Sie 5 % FBS, 500 Millimolar EDTA und 1X PBS kombinieren. Waschen Sie die abgelösten Zellen mit einem Milliliter Färbepuffer

Bei 580 mal g fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. In einem Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Erfassung fünfmal 10 bis vierte Zellen in 100 Mikrolitern Färbepuffer resuspendieren. Fügen Sie zwei Mikroliter Antifeeder-Antikörper in einer Verdünnung von eins bis 50 hinzu und mischen Sie gut.

30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren. Nach 30 Minuten mit zwei Millilitern Fleckenpuffer waschen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 580 mal g.

Der Überstand wird verworfen und in 200 Mikrolitern Färbepuffer resuspendiert. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, das mit einem blauen Laser, einem roten Laser und Filtern für die Detektion von GFP- und APC-Fluoreszenz konfiguriert ist, um APC- und GFP-Signale zu erfassen. Die GFP-positive Zellfraktion der APC-negativen Zellpopulation weist auf transduzierte Keratinozyten hin.

Um eine Echtzeit-PCR durchzuführen, werden Reaktionen in dreifacher Ausfertigung auf einer 96-Well-Platte mit einem endgültigen Reaktionsvolumen von 25 Mikrolitern eingerichtet. Jede Reaktion enthält einen Mikroliter cDNA, 12,5 Mikroliter 2X-Mastermix, 1,25 Mikroliter Primer in 20X-Sondenmischung und 10,25 Mikroliter steriles Wasser. Führen Sie die Echtzeit-PCR gemäß diesem PCR-Programm durch, einen Zyklus bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten, dann 40 Zyklen von 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und 60 Grad Celsius für eine Minute und halten Sie ihn bei vier Grad Celsius.

Analysieren Sie abschließend die Echtzeit-PCR-Daten, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Expressionsanalyse von HeLa-Zellen, die mit steigenden Dosen von Transposen in Modulatorvektoren plus oder minus Doxycyclin transduziert wurden, zeigte, dass hohe Dosen beider IDLVs erforderlich waren, um die SB100X-Expression stark zu induzieren. Die quantitative Analyse der SB100X-Expression auf HeLa-Zellen, die mit einem Transpose-Vektor in Gegenwart oder Abwesenheit des Modulatorvektors transduziert wurden, ergab eine achtfache Aktivierung über dem Hintergrund in Gegenwart von Doxycyclin.

Das transkriptionell regulierte Dornröschen-System kann auch in Primärzellen eingesetzt werden. Die SB100X-Expression auf Keratinozyten, die mit Transposen und Modulatorvektoren transduziert wurden, zeigte eine 15-fache Aktivierung über den ausgeschalteten Zustand. Das Transpositionsexperiment, das an Keratinozyten durchgeführt wurde, die mit den drei IDLV-Vektoren plus oder minus Doxycyclin transduziert wurden, zeigte, dass 12 % der mit Doxycyclin behandelten Zellen mindestens eine Kopie von GFP stabil in ihr Genom integrierten.

Einmal gemeistert, kann die lebenswichtige Transduktion in Primärzellen in acht Stunden, die zytofluorimetrische Analyse in zwei Stunden und die Expressionsanalyse in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Vektordosiskombination zu optimieren, die zur Transduktion von Primärzellen verwendet wird, und das höhere Expressionsniveau der induzierbaren Dornröschen-Transponierungen zu erreichen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die quantitative PCR und die Linker-vermittelte PCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Anzahl der Transposonkopien pro Zelle und die Integration für die Ablage des Genoms zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für den Forscher auf dem Gebiet der Gentherapie, um die Anwendung des Dornröschensystems bei der Züchtung klinisch relevanter Zellen zu erforschen. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie zunächst primäre Keratinozyten mit den IDLV-Vektoren transduzieren. Zweitens, messen Sie die Expression hyperaktiver Transponierungen im Doxycyclin-Zustand und folgen Sie schließlich der Transposition durch Durchflusszytometrie.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren extrem gefährlich sein kann, daher sollten Vorsichtsmaßnahmen wie BCL zur Eindämmung des Niveaus und der Einwegvorrat immer mitgenommen werden, wenn Sie diese Verfahren durchführen.