Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die komplexe Bildung von SNARE-Proteinen in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Membrantransports zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung der Sätze von SNARE-Proteinen, die die spezifischen Schritte des Organellentransports katalysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die direkte Visualisierung von zellulären Stellen ermöglicht, an denen SNAREs an der Komplexbildung beteiligt sind.

In diesem Experiment werden 900.000 HeLa-Zellen, aufgeteilt auf drei Eppendorf-Röhrchen, für die Transfektion verwendet. Transfizieren Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben mit den folgenden Konstrukten. Probe Nummer eins mit dem Syntaxinin-4 mCitrin-Konstrukt, Probe Nummer zwei mit dem Syntaxinin-4 mCitrin und VAMP3-mCherry und Probe Nummer drei mit Syntaxinin-3, das sowohl mit mCitrin als auch mit mCherry fusioniert ist.

Kultivieren Sie die transfizierten Zellen in hochglukosehaltigem DMEM, das mit 10 % FCS und 1 % Antibiotikum versorgt ist, bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in einem Zellkultur-Inkubator über Nacht. Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal zwei Minuten lang mit einem Medium für lebende Zellen. Legen Sie danach die Zellen in ein frisches Bildgebungsmedium.

Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie Probe Nummer zwei bei 37 Grad Celsius auf einen beheizten Tisch unter ein konfokales Mikroskop mit Fluoreszenzlebensdauer im Zeitbereich mit einer gepulsten Anregungsquelle für das Donorfluorophor und einer zeitaufgelösten Datenerfassung. Vor jeder Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie oder FLIM-Messung wählen Sie eine Zelle mit sichtbarer Expression der mCitrin- und mCherry-markierten SNARE-Proteine aus und zeichnen Sie ein konfokales Bild von 256 x 256 Pixeln mit gleichzeitiger Anregung beider Fluorophore auf. Nehmen Sie ein FLIM-Bild auf, indem Sie auf FLIM ausführen klicken, wobei das FLIM-Bild mit den gleichen Abmessungen und der gleichen räumlichen Auflösung wie das zuvor aufgenommene konfokale Bild aufgenommen wird.

Nehmen Sie das Bild mit mindestens 50.000 Photonen für die FLIM-Analyse der gesamten Zelle oder mit mindestens 400 Photonen pro Pixel auf. Es ist wichtig, die FLIM-Messungen mindestens einen Mikrometer von der Glasoberfläche entfernt aufzuzeichnen, um eine Reflexionsansicht zu vermeiden. Wiederholen Sie die Bildgebung von mehreren Zellen in Probe Nummer zwei und für Zellen in Probe Nummer eins und Probe Nummer drei.

Legen Sie anschließend einen sauberen Glasdeckglas auf den Mikroskoptisch, um eine Instrumentenreaktionsfunktion (IRF) aufzuzeichnen. Stellen Sie den Monochromator des Emissionsdetektors auf die Anregungswellenlänge ein und klicken Sie auf die Schaltfläche FLIM ausführen, um ein FLIM-Bild mit der Rückstreuung vom Glasdeckglas aufzunehmen. Die Fotoaufnahmen werden mit der PT32ICS Konvertierungssoftware in FLIM-Bilder umgewandelt.

Konfigurieren Sie die Software. Legen Sie die Ausgabe auf ImageJ fest, um FLIM-Bilder zu erzeugen. Legen Sie die Bildgröße auf 256 x 256 Pixel und den Kanal auf zwei Pixel fest.

Drücken Sie auf Konvertieren und laden Sie eine oder mehrere Photonenspuren. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, um mehrere Photonenspuren auszuwählen. FLIM-Bilder sollten im selben Ordner erzeugt werden, in dem die Photonenspuren gespeichert sind.

Beginnen Sie damit, das Datenanalyse-Softwareprogramm zu öffnen, das in der Lage ist, sich an die Dekonvolution anzupassen. Importieren Sie die Textdatei, die das Histogramm für jede Photonenspur enthält. Ordnen Sie die Tabelle so an, dass sich die IRF in der zweiten Spalte der Tabelle neben den Zeitwerten in Spalte A befindet.Bestimmen Sie die Qualität der aufgezeichneten Photonenspuren, indem Sie alle Spalten auswählen.

Analysieren Sie keine Photonenspuren mit einem hohen Reflexionspeak. Ein Beispiel sehen Sie hier. Verwenden Sie die Strg-Taste, um alle Spalten auszuwählen, die die qualitätsgeprüften Lebensdauer-Histogramme enthalten, die angepasst werden sollen, sowie die IRF in Spalte B, und laden Sie die nichtlineare Anpassung.

Laden Sie die Funktion für die entfaltete Einpassung, indem Sie diese Funktion zur Analysesoftware hinzufügen. Wählen Sie die Fit-Funktionsdatei aus. Diese Funktion passt zu den Fluoreszenzlebensdauer-Histogrammen mit einer monoexponentiellen Zerfallsfunktion, die mit dem IRF entfaltet ist.

Führen Sie eine Skalierung der angepassten Kurven auf der X-Achse durch. Passen Sie die Kurven durch Drücken von "Anpassen" an. Dadurch wird die Anpassung konvertiert und ein Berichtsblatt im Array mit der Tabelle mit den Fluoreszenzlebensdauer-Offsets und Amplituden erstellt.

Außerdem wird ein Datenblatt mit den angepassten Kurven und den Residuen der Anpassung generiert. Gezeigt sind repräsentative konfokale Bilder von Helozellen, die nur Syntaxin vier mCitrin, Snytaxin vier mCitrin mit VAMP3 mCherry exprimieren, oder das Syntaxin drei mCitrin mCherry Tandemkonstrukt. In diesen begleitenden Bildern der Fluoreszenzlebensdauer zeigt die Farbe die durchschnittliche scheinbare Lebensdauer der Fluoreszenz an.

Die Bilder wurden dann mit den Fluoreszenzintensitäten des mCitrin-Donor-Fluorophors gefaltet. Es folgen die gleichen Bilder mit Anpassung mit bi-exponentiellen Zerfallsfunktionen. Die Pixelfarben zeigen die geschätzten Anteile von Syntaxin vier im Komplex mit VAMP3 an.

Die Ansprechfunktion des Aufbaus wurde anhand der Rückstreuung an der Glaswassergrenzfläche gemessen. Ganzzelllebensdauer-Histogramme werden für Zellen gezeigt, die nur Syntaxin vier mCitrin exprimieren, Syntaxin vier mCitrin mit VAMP3 mCherry co-exprimieren und die Syntax in drei mCitrine mCherry Tandemkonstrukt exprimieren. Panel E zeigt eine Überlagerung der Abklingkurven der Panels B, C und D.Die Inlays zeigen die gleichen Graphen, jedoch mit logarithmischer Skalierung der Y-Achse.

Ein fluoreszierendes Lebensdauerhistogramm, das zu nahe an der Oberfläche des Mikroskopdeckglases aufgenommen wurde, führte zu einem großen Reflexionspeak, der durch den gelb schattierten Bereich dargestellt wurde. Abschließend wird ein Lebensdauerhistogramm mit repräsentativer Anpassung mit biexponentieller Zerfallsfunktion gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, mehrere Zellen aufzuzeichnen, während die Expressionsniveaus des Donators und des Interceptors SNARES die Lebensdauer beeinflussen können. Nach diesem Verfahren können die Zellen aktiviert werden, um zelltypspezifische Fragen im Zusammenhang mit dem Rerooting des SNARE-vermittelten Membrantransports zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Membrantransports, um die interzellulären Wege des Organellenverkehrs in allen eukaryotischen Zellen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die FLIM-Daten aufzeichnen und analysieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit gentechnisch veränderten Organismen und Hochleistungslasern äußerst gefährlich sein kann und dass bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe und Augenschutz getroffen werden sollten.