Name: Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie kombiniert werden, um die Architektur von Mehruntereinheiten-Proteinkomplexen zu untersuchen. Diese Methode liefert komplementäre strukturelle Informationen für die Strukturbiologie.

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Wir danken unseren Kollegen für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch Ilme Schlichting und Karl-Peter Hopfner für die Bereitstellung von Proteinkomplexen. Wir anerkennen, dass Mittel des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF, ZIK Programm, 03Z22HN22), den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE, ZS/2016/04/78115) und der MLU Halle-Wittenberg, c.s. und Finanzierung vom Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z), A.P.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Protokolle sind Massenspektrometrie-basierte Strukturanalyse von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe vorgesehen. In das Protokoll beschriebenen zwei Techniken meist ergänzende Ergebnisse liefern und sind gut geeignet, um Einblicke in die strukturellen Vorkehrungen innerhalb von Protein (-Liganden) komplexe, die schwer durch herkömmliche strukturelle Techniken zu untersuchen sind. Native Massenspektrometrie liefert Einblicke in Protein Zusammensetzungen sowie Protein-Interaktionen durch die Analyse von Subcomplexes und stabilen Interaktion Module. Vernetzung, auf der anderen Seite liefert Informationen über direkten Kontaktstellen. Abhängig von der Vernetzer verwendet eine gewisse Flexibilität kann oder sollten in die Analyse einbezogen werden.
Die zur Verfügung gestellten Protokolle sind im Allgemeinen einfach durchzuführen und nicht zeitaufwendig. Das gesamte Protokoll kann innerhalb einer Woche durchgeführt werden und kann auf fast allen Proteinkomplexen angewendet werden, obwohl ein gewisses Maß von der Protein-Komplex für die erfolgreiche Analyse erforderlich ist. Vorbereitung der Probe ist einfach und erfordert keine speziell gereinigtes Protein-komplexe. Allerdings ist ein Fallstrick Kontamination der Probe während der Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Proteinidentifikation. Diese Verunreinigungen in den meisten Fällen gehören Keratine, die aus Staub, Haut- oder Haarfarbe stammen. Daher sollten zusätzliche wie das Tragen von Handschuhen und Kittel, Filtrierung wässrigen Puffer und hochreinen Lösungsmitteln während der Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Proteinidentifikation achten. Andere kontaminierende Proteine wie Chaperone sind in der Regel während der Proteinreinigung, z.B.eingeführt, wenn Affinität-Tags verwenden. In diesen Fällen sollte Proteinreinigung zum Beispiel verbessert werden, indem man Waschschritte. In jedem Fall Protein Verunreinigungen in der Probe sind leicht erkennbar, während die Datenbankrecherche durch Weglassen des Taxonomie-Filters (d.h.gegen Proteine von allen Tierarten suchen). Wenn nur ein paar Peptide eingehalten werden (d.h., eine eiweißarme Abdeckung konnte abgerufen werden), obwohl genügend Probe zur Verfügung steht, es kann notwendig sein, verwenden Sie ein anderes Proteinase während der Verdauung. Im allgemeinen ergibt Trypsin eine ausreichende Anzahl von Peptiden; jedoch in einigen Fällen wie Membranproteine oder Membrandomänen von Proteinen, die Anzahl der Folgen Spaltstellen reduziert und andere Enzyme gezielt hydrophobe Aminosäuren sind eine bessere Wahl.
In Bezug auf die Instrumentierung ist ein besonders modifizierte Instrument für native Massenspektrometrie unterhält nicht-kovalente Wechselwirkungen während der Übertragung in die Gasphase erforderlich. Verschiedene Gerätetypen wurden eingeführt, einschließlich der Q-ToF und Orbitrap Instrumente. Während modifizierte Q-ToF Massenspektrometer seit mehreren Jahren für native Massenspektrometrie im Handel erhältlich sind, letztere wurden erst vor kurzem eingeführt und in den meisten Fällen erfordern spezielle Änderung45. Jedoch die Anwendung des hochauflösenden Instrumente erlaubt Studium Bindung von mehrere Liganden und deren Quantifizierung46,47 und ist vielversprechend für zukünftige Anwendungen.
Um vernetzte di-Peptide durch flüssige Chromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie zu identifizieren, können standard-Verfahren mit wenigen Änderungen angewendet werden. Jedoch ist die Suche in der Datenbank der limitierende Faktor Spezialsoftware kann selten befassen sich mit großen Datenbanken sowie reduzierte Datenbanken, in denen die Protein-Untereinheiten der Anlagen erforderlich sind. Neuere Studien verwendeten Masse Spektrometrie spaltbaren Quervernetzern targeting Protein-Interaktionen in der gesamten Zelle Lysates48,49. Die Verwendung von chemischen Quervernetzern, die meist in Tandem-Massenspektrometrie Experimente fragment liefert lineare Peptide (von der Vernetzer geändert), die durch eine weitere Fragmentierung identifiziert werden können und Suche Datenbank lineare Peptide, und dies reduziert Suchzeit und rechnerische Suchraum. Um diese Experimente durchzuführen, ist jedoch ein Ionenfallen Masse Analysator oder ein Hybrid-Massenspektrometer mit einer Ionenfalle erforderlich. Im Allgemeinen als Fehlalarme ein wichtiges Thema sind, sind Massenspektren von vernetzten Peptiden oft manuell durch die Qualität ihrer Fragment Spektren überprüft die Daten Analysezeit enorm erweitert. Robuste scoring-Systeme zu entwickeln, die angewendet werden können, ohne weitere Validierungsschritte daher mögliche zukünftige Anwendungen sind. Eine Möglichkeit, die Datenanalyse zu verbessern und die Zahl der Fehlalarme zu reduzieren war die Einführung der false Discovery Rate Berechnungen und deren Anwendung auf die Vernetzung von Datensätzen50.
Im Allgemeinen können die hier beschriebenen Techniken mit weiteren Massenspektrometrie Techniken ergänzt werden (z.B.kovalente Kennzeichnung) zur Leistungssteigerung von der Analyse. Weitere Änderungen und Verbesserungen der Protokolle können leicht umgesetzt werden. Als solche entwirrt vergleichende vernetzende34 Konformationsänderungen in der Protein-Baugruppe. Weiterentwicklungen in der nativen Massenspektrometrie ermöglichen heute die Analyse der Membran Proteine51,52 und deren Interaktion mit Lipiden28,52,53,54 . Neuentwicklungen von hochauflösenden Massenspektrometer für native Massenspektrometrie wurden erweitert, der Anwendung und Liganden Bindung, z.B., Bindung von Lipiden, Membranproteine, können nun in die Analyse45, einbezogen werden 46. in Kombination mit computergestützten Modellierungsansätze, diese Techniken Strukturmodellen verschiedener Auflösung55liefern können. Wenn keine Kristallstrukturen für die intakten komplexen oder einzelnen Untereinheiten zur Verfügung stehen, kann Massenspektrometrie erste Einblicke in Protein-Interaktionen und die Topologie der unbekannten Anlage liefern. Je nach der verwendeten Techniken und die erzielten Ergebnisse erhalten Sie mit niedriger Auflösung Modelle des unbekannten komplexes56,57,58. Kristallstrukturen oder Homologie Modelle verfügbar sind, kann sogar in der Nähe von Native Modelle59durch die strukturellen Informationen seitens der Massenspektrometrie erzielt werden.
Im Vergleich zu anderen strukturellen Techniken, Massenspektrometrie hat den Vorteil, dass es erfordert geringe Stichprobe Mengen, heterogene Proben bewältigen kann und gilt für Proteinkomplexe unbegrenzter Größe. Darüber hinaus erlaubt Massenspektrometrie die Untersuchung des dynamischen Protein-Systeme. Verschiedene Populationen von Eiweiß oder Protein-Komplex, die in der Lösung vorhanden sind in der Regel gemeinsam analysiert und daher, anders als mit anderen strukturellen Techniken die Auswahl bestimmter Bevölkerungsgruppen erfordern alle Konformationen sind beibehalten während Analyse und sind in einem einzigen Experiment bewertbar. Quantitative vernetzende Ansätze wurden kürzlich eingeführten34,60,61 , sind vielversprechend für zukünftige Anwendungen Konformationsänderungen unter verschiedenen Bedingungen zu beschreiben.

Die strukturellen Untersuchung von Protein-Baugruppen ist besonders wichtig für das Verständnis der zellulären Prozesse geworden. Infolgedessen haben viele Techniken entwickelt und verbessert in der Strukturbiologie1. Diese Techniken sind jedoch manchmal in ihrer Anwendung aufgrund von Größe, Flexibilität oder Heterogenität der Proteinkomplexe untersuchten begrenzt. Massenspektrometrie kann diese Herausforderungen bewältigen und daher erwies sich als ein mächtiges Werkzeug in der Strukturbiologie2,3,4,5. Der größte Vorteil der Massenspektrometrie, ist jedoch die Fähigkeit, Proteine auch in komplexen und heterogenen Gemischen6eindeutig zu identifizieren. Zu diesem Zweck Proteine sind in der Regel mit Endoproteinases verdaut und die daraus resultierenden Peptid Mischung wird durch flüssige Chromatographie getrennt und direkt in das Massenspektrometer eluiert. Peptid-Massen werden anschließend bestimmt und Vorläufer Ionen sind für weitere Zersplitterung der Peptide ausgewählt. Proteine werden dann durch Suche Peptid und entsprechende Fragment Massen gegen eine bekannte Datenbank identifiziert. Dieses Verfahren ermöglicht nicht nur die Identifikation der Peptide/Proteine, sondern auch ihre Post-translationalen Modifikationen, die eine Masse Verschiebung der Vorläufer-Peptide und die Durchführung der Änderung7Fragment-Ionen verursachen. Einige der vielen Techniken in der strukturellen Massenspektrometrie basieren auf diesem Prinzip4,8. Z. B. Fuß Kennzeichnung Techniken wie z. B. Wasserstoff Deuterium Austausch9,10, chemische Kennzeichnung Strategien11,12, oder Hydroxyl-radikal Druck13,14 , geben Einblicke in die Oberfläche Zugänglichkeit der Proteine unter bestimmten Bedingungen.
Eine andere Technik ist (chemischen) Vernetzung, an denen die kovalente Verknüpfung der Aminosäuren in der Nähe durch ihre funktionellen Gruppen. Dafür sind chemische Reagenzien, UV-aktivierbare Reagenzien oder Aminosäuren beschäftigt15,16. Nach der Vernetzung, die Proteine sind in der Regel mit Proteasen hydrolysiert und vernetzte di-Peptide werden durch flüssige Chromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie analysiert. Die Identifizierung der Vernetzung Produkte von Datenbank-Suche, erfordert jedoch die Verwendung einer speziellen Software die Peptid-Sequenzen von verschiedenen Proteinen und verschiedenen Regionen17,18,19zu verketten. Die Verwendung von chemischen Quervernetzern hat den Vorteil, dass es werden, um fast jedes Protein Komplex von Interesse eingesetzt kann und erfordert keine Einbeziehung der UV-aktivierbare Aminosäuren, die nur erreicht werden kann, wenn das Protein des Interesses an Wirtszellen zum Ausdruck zu bringen. Als solche Vernetzung ist ein vielseitiges Werkzeug und arbeitete erfolgreich in vielen strukturellen Studien auch große Protein Baugruppen20.
Massenspektrometrie von intakten Proteinkomplexe (manchmal genannt "native" Massenspektrometrie), auf der anderen Seite beinhaltet die Analyse von intakten Proteinen und Proteinkomplexen ohne Hydrolyse in Peptide. Es zeigt Zusammensetzung, Heterogenität, Stöchiometrie, Topologie und Untereinheit Interaktionen von Protein-komplexe21,22. In Kombination mit Ionenbeweglichkeit ermöglicht native Massenspektrometrie weitere Bestimmung der ihre Konformation23,24. Dies macht es ein leistungsfähiges Werkzeug für die strukturelle Untersuchung der Proteinkomplexe, die schwierig zu beurteilen, durch herkömmliche strukturelle Techniken sind. Native Massenspektrometrie erfordert jedoch Analyse Puffer, die nicht-kovalente Proteininteraktionen während Elektrospray-Ionisation zu pflegen. Dies geschieht in der Regel durch wässrige, flüchtigen Puffer wie Ammonium Acetat25verwenden. Darüber hinaus sind Instrument Modifikationen nötig, Dissoziation während der Übertragung in die Gasphase des Massenspektrometers26zu verhindern. Auf diese Weise angewendet werden, wurden viele (große) Proteinkomplexe analysiert. Eindrucksvolle Beispiele sind die Studien von intakten Ribosomen27, ATP Synthasen28oder Viren29.
In früheren Studien bewährt sich besonders die Kombination von native Massenspektrometrie und Vernetzung. Zum Beispiel die Zusammensetzungen der Chaperon-komplexe, darunter eine unerwartete Hsp70-Dimer könnte eingeholt werden Massenspektrometrie Experimente der intakten Proteinkomplexe, während chemische Vernetzung die Modalitäten der Proteine in offenbart der Baugruppen30,31. In einer anderen Studie wurden die Effekte von post-translationalen Modifikationen auf eine intakte ATP-Synthase komplex untersucht. Native Massenspektrometrie bot Einblicke in die komplexen Proteinstabilität in das Vorhandensein oder Fehlen von Phosphorylierung und Acetylierung32,33. Eine vergleichende vernetzende Strategie34 deckte dann Konformationsänderungen des Proteins Komplex unter verschiedenen Bedingungen.
Hier bieten wir die Protokolle für Proteinidentifizierung von Massenspektrometrie (chemische) Vernetzung und native Massenspektrometrie, einschließlich Datenanalyse und Interpretation (Abbildung 1). Die Kombination von komplementären Ergebnisse, die von diesen Methoden mit Hilfe von zwei gut charakterisierten Proteinkomplexe ist nachgewiesene35. Unser Protokoll kann auf Protein-Montage angewendet werden, die bei bestimmten Reinheit und Konzentration gereinigt werden können. Der Ansatz ist in einigen Fällen durch Datenanalyse der Vernetzung von Daten, d. h., die Größe der Datenbank begrenzt eingesetzt die bestimmt die gewünschte Suche Raum und Zeit. Darüber hinaus manuellen Validierung der identifizierten Querverbindungen ist oft erforderlich und wird die Ausgabe weiter reduziert. Native Massenspektrometrie wird meist durch die Sample-Qualität, z.B., Puffer begrenzt und Addukte während der Reinigung und die Möglichkeit zum Austauschen von wässrigen und flüchtigen Puffer verwendet. Proteinkomplexe, die in der Regel für die Strukturanalyse gereinigt haben jedoch die Qualität, die für erfolgreiche Analyse mit unsere Protokolle erforderlich.

<table><tbody><tr><td>Chemikalien, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien2-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Acetonitril Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Amicon Ultra zentrifugal Geräte (unterschiedliche MWCO)</td><td>Millipore</td>, <td>d.h. UFC500396</td><td>Pufferaustausch, Konzentration</td></tr><tr><td>Ammoniumacetatlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>native MS</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>In-Gel-Aufschluss</td></tr><tr><td>Ammoniumlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>Vernetzer</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>Vernetzer</td></tr><tr><td>Cäsiumiodid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203033</td><td>Kalibrierung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>In-Gel-Aufschluss</td></tr><tr><td>Kapillaren (1,0 OD &times; 0,78 ID &times; 100 L mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>muttersprachliches MS</td></tr><tr><td>Disuccinimidylsuberat (DSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21655</td><td>Vernetzer</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>In-Gel-Aufschluss</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Ameisensäure Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>Lösungsmittelzusatz</td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Färbelösung</td><td>expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Färbelösung für die Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gele (1 mm, 10 Well)</td><td>life technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>In-Gel-Aufschluss</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol, HPLC-Qualität</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Methanol Fisher</td><td>Chemicals</td><td>A456-212</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6 Säulen</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>Puffertausch</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidans</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td>Laufpuffer, Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer (4 & mal;)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Probenladepuffer (nicht reduzierend) für die Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>NuPAGE Probenreduktionsmittel (10 & mal;)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td>Reduktionsmittel für die Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>PBS - phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Puffer SeeBlue Plus2 vorgefärbter Standardproteinmarker</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>vorgefärbter Proteinmarker für die Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Ethanolfällung</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)Aminomethan (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Puffer Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td><td>In-Gel-Aufschluss</td></tr><tr><td>Vivaspin Zentrifugalgeräte (verschiedene MWCO)</td><td>Sartorius</td><td>z.B. VS0101</td><td>Pufferaustausch, Konzentration</td></tr><tr><td>Wasser für HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td><stark>Name</stark></td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, Tischzentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Flaming / Brauner Mikropipettenabzieher Modell P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophoresekammer Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold Coater Quorum Q150R S</td><td>Quorum Technologies Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaler Gelschüttler Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Q-TOF Ultima Massenspektrometer, MS Vision High Mass Upgrade Waters</td><td>(Mikromasse)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Umkehrphasen-C18-Analysesäule Acclaim PepMap (C18, 75 mm Innendurchmesser, 50 cm, 3 mm Porengröße)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>C18-Vorsäule mit umgekehrter Phase (C18, 150 mm Innendurchmesser, 2 cm, 5 mm Porengröße)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164213</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac SPD121P Vakuumzentrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger USC-TH, Beschallungsbad</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate Dionex 3000 Nano-LC System, gekoppelt an Q-Exactive plus Hybrid-Massenspektrometer (Nano-ESI-Quelle)</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Software, Software Tools, Datenbanksuche</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methoden 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pXtract Conversion Tool</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Methoden 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombination von chemische vernetzung und massenspektrometrie intakt proteinkomplexe, die architektur des multi-untereinheit protein baugruppen zu studieren

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteine interagieren Sie mit ihrer Liganden in Form aktiver und dynamischer Assemblys die verschiedenen zellulären Funktionen durchführen. Erläuterung dieser Wechselwirkungen ist daher grundlegend für das Verständnis der zellulären Prozesse. Jedoch viele Proteinkomplexe sind dynamische Assemblys und nicht durch herkömmliche strukturelle Techniken zugänglich. Massenspektrometrie trägt zu der strukturellen Untersuchung dieser Versammlungen, und vor allem die Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken liefert wertvolle Einblicke in deren strukturelle Anordnung.
In diesem Artikel beschreiben wir die Anwendung und Kombination von zwei sich ergänzende massenspektrometrischen Techniken, nämlich chemische Vernetzung gekoppelt mit Massenspektrometrie und native Massenspektrometrie. Chemische Vernetzung umfasst die kovalente Verknüpfung der Aminosäuren in der Nähe durch die Verwendung von chemischen Reagenzien. Nach der Verdauung mit Proteasen vernetzte di-Peptide werden durch Massenspektrometrie identifiziert und Protein Interaktionen Websites werden aufgedeckt. Native Massenspektrometrie ist auf der anderen Seite die Analyse von intakten Proteinen Baugruppen in der Gasphase eines Massenspektrometers. Es zeigt Protein Zusammensetzungen sowie Eiweiß und Ligand Interaktionen. Beide Verfahren liefern daher ergänzende Informationen über die Struktur der Protein-Ligand Baugruppen und deren Kombination erwies sich mächtig in früheren Studien.

Die Strukturanalyse von Proteinen und die komplexe, die sie bilden ist grundlegend für das Verständnis ihrer Funktion. Massenspektrometrie trägt wesentlich zur strukturellen Untersuchung, dass es auf fast jeder Komplex von Interesse unabhängig von ihrer Größe angewendet werden können oder probieren Sie die Heterogenität. Wir veranschaulichen das Protokoll mithilfe von zwei gut charakterisierten Proteinkomplexe; Erstens, die Hetero-Dodecamer RvB1/B2 von C. Thermophilum und zweitens die Hetero-Octameric CPS Komplex aus E. Coli.
Erstens haben wir die Eiweißbausteinen der zwei komplexe identifiziert. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE (Abbildung 2) getrennt und Gel Bands wurden aus dem Gel geschnitten. Nach-Gel Verdauung der Proteine wurden die Peptid-Mischung wurde durch flüssige Chromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie analysiert und Peptid und Fragment Massen Datenbank durchsuchen. Nach diesen Workflow wir identifiziert alle Protein-Untereinheiten der zwei komplexe mit hohem Vertrauen, d. h., eine hohe Anzahl von Peptiden mit angemessenen Peptid-Scores wurde beobachtet nachgeben hohe Sequenz Abdeckung für alle Protein-Untereinheiten (Tabelle 1 ).
Dann analysierten wir die intakte RvB1/B2-Komplex durch native Massenspektrometrie (Abb. 3A). Das Massenspektrum ergab zwei Arten, eine auf ca. 8.000 m/Z und einer anderen Spezies auf ca. 11.000-12.000 m/Z. Die kalkulierten Massen für diese Arten entsprechen der Hexameric (RvB1)3(RvB2)3 Ring (ca. 310 kDa) und die Dodecameric Doppel-Ring (RvB1)6(RvB2)6 (ca. 620 kDa). Beide Gipfel Serien zeigen zwei Populationen; Diese stammen aus einer Mischung von seinem markiert und untagged RvB2 Untereinheiten in den komplexen. Eine Kristallstruktur für den RvB1/B2-Komplex wurde bisher36 und zeigt die Anordnung der Doppel-Ring (Abb. 3 b). Native Massenspektrum daher bestätigt die Stöchiometrie der intakten Dodecamer und darüber hinaus zeigt einen stabilen Sub-Komplex. Darüber hinaus sind nebeneinander bestehende Populationen identifiziert.
Um Protein Interaktion Websites in der RvB1/B2-Komplex zu identifizieren, vernetzt wir chemisch gereinigte Anlage mit BS3 Vernetzer. Wir titriert zunächst die Höhe der BS3 während die Vernetzungsreaktion die optimale Konzentration bestimmt. BS3 ist Amin-spezifische und kovalent Links Lysin-Seitenketten sowie die N-Termini der Proteine. Die Vernetzungsreaktion folgte SDS-PAGE (Abbildung 2A). Der nicht-Cross-linked Komplex zeigte sowohl RvB1 als auch RvB2 Untereinheiten. Das Reaktionsgemisch BS3 hinzufügen verursacht kovalente Bindung der Proteine, wodurch Protein-Banden bei höherem Molekulargewicht. Das SDS-Gel zeigt, dass BS3 in zunehmendem Maße ergeben höhere Mengen an vernetzten Arten, während nicht-Cross-linked Protein Untereinheiten reduziert werden. Wir schneiden die Protein-Bands aus dem Gel und folgte das Protokoll zur Verfügung gestellt über Protein Interaktion Websites identifizieren. Eine Beispiel-Spektrum an eine vernetzte di-Peptid wird (Abbildung 3) angezeigt. Das Spektrum zeigt y-Ion Serie beide Peptide Bestätigung dieser Protein-Interaktion. Insgesamt erhalten wir 14 Proteininteraktionen, darunter vier Querverbindungen zwischen RvB1 und RvB2-Untereinheiten und zwei Querverbindungen zwischen den beiden Kopien des RvB2 (Tabelle 2). Die Ergebnisse von BS3 Vernetzung werden in eine Interaktion Netzwerk (Abbildung 3D) mit intramolekularer Wechselwirkungen sowie Interaktionen zwischen verschiedenen Untereinheiten visualisiert. Intramolekularer Querverbindungen legen nahe, dass sowohl RvB1 als auch RvB2 Untereinheiten so Falten, dass N und C-terminalen Domänen in unmittelbarer Nähe befinden. Beachten Sie, dass intramolekularer Wechselwirkungen von Inter molekularen Wechselwirkungen von der gleichen Untereinheit in diesem Fall nicht zu unterscheiden sein. Inter molekulare Querverbindungen zwischen den beiden Untereinheiten wurden ebenfalls beobachtet. Von diesen konnten zwei Inter molekulare Querverbindungen zwischen RvB1 und RvB2 in der Struktur, die Validierung des Vernetzung Ansatzes visualisiert werden. Die Inter molekularen Querverbindungen befinden sich in der Kristallstruktur nicht enthalten sind in flexiblen Schlaufen. Wir identifizierten auch zwei Querverbindungen in RvB2, die die gleichen Peptid-Sequenzen enthalten. Diese Querverbindungen können eindeutig als Inter molekulare, wie sie zwei Kopien des gleichen Proteins (Abbildung 3D) stammen müssen klassifiziert werden. Unsere Vernetzung Experimente offenbaren Protein Interaktion Websites innerhalb der Anlage, sondern auch innerhalb der Protein-Untereinheiten, die Einblicke in ihre strukturelle Anordnung, die auch durch die bestehende Kristallstruktur (Abb. 3 b) bestätigt werden konnte.
Der zweite Protein-Komplex, die wir untersucht wurde CPS. Die native Massenspektrum (Abb. 4A) ergab drei Proteinkomplexe zwischen 6.000 und 12.000 m/Z. Die größte Komplex von 640 kDa entspricht der intakten Hetero-Octamer. Die kleinere komplexe repräsentieren zwei Sub-komplexe; Das Dimer von kleinen und großen CPS Untereinheiten (160 kDa) und eine Hetero-Tetramer mit zwei Kopien jeder Untereinheit (320 kDa). Diese Sub-komplexe liefern erste Einblicke in die Protein-Versammlung; d. h., die großen und kleinen Untereinheiten stehen in direktem Kontakt (wie durch die Hetero-Dimer aufgedeckt) und das Tetramer könnte ein Produkt von zwei Dimere. Um weitere Informationen über die strukturelle Anordnung in der intakten CPS Komplex zu gewinnen, führten wir durch Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) von der Hetero-Octamer und Hetero-Tetramer. In beiden Fällen der kleinen Untereinheit dissoziiert aus der Vorstufe darauf hindeutet, dass die kleine Untereinheit sich in der Peripherie der Versammlung (Abbildung 4 b befindet). In der Tat ist die kleine Untereinheit Peripherie in den verfügbaren Kristall-Struktur (Abbildung 4)-44.
Chemische Vernetzung mit der BS3-Vernetzer wurde ebenfalls durchgeführt. Mit steigenden Mengen, wurde die kovalente Verknüpfung der CPS Untereinheiten erweitert. Nach Verdauung der Proteine und Peptide wie oben beschrieben erhielten viele Protein-Interaktionen innerhalb der großen Untereinheit und einer Querverbindung entsteht in der kleinen Untereinheit (Tabelle 2). Außerdem, ähnlich wie bei der RvB1/B2-Komplex, fanden wir zwei Inter molekulare Querverbindungen zwischen den beiden Kopien von großen CPS-Untereinheit. Diese Querverbindungen legen Sie die zwei großen Untereinheiten, die einander an ihren C-terminale Seiten gegenüber. In einer früheren Studie identifiziert strukturelle Massenspektrometrie und computergestützten Modellierung35, kombinieren wir drei zusätzliche Interaktionen in der großen Untereinheit, die am ehesten ihren Ursprung in der Schnittstelle von zwei Kopien der großen Untereinheit validiert durch die Kristallstruktur und die erhaltenen Modell (Abbildung 4 und Tabelle 2). Diese Interaktionen können die Anordnung der CPS-Kern Komplex bestehend aus vier großen Untereinheiten. Allerdings wurden keine Inter Untereinheiten Querverbindungen zwischen dem kleinen und dem großen Untereinheiten beobachtet. Durch die Überprüfung der verfügbaren Kristallstruktur (Abbildung 4), wird deutlich, dass die Interaktion Oberfläche zwischen den tetrameres Kern des Komplexes, bestehend aus der großen Untereinheit und die peripheren kleinen Untereinheiten sehr klein, was erklären könnte das Fehlen von Inter Untereinheit Interaktionen. Dies durch native Massenspektrometrie, die zeigten, dass die kleine Untereinheit distanziert sich leicht aus der intakten komplexe sehr wahrscheinlich durch eine kleine verbindliche Schnittstelle. Protein-Interaktionen in der CPS komplexe chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie kombiniert gestatten dennoch Aufzucht ihrer strukturellen Anordnung (Abbildung 4).
Zusammengenommen, ermöglicht die Kombination von native Massenspektrometrie und chemische Vernetzung gepaart mit massenspektrometrische Identifizierung von Peptiden, die vernetzte Rekonstitution der strukturellen Anordnung der beiden Beispiel-komplexe. Während chemische Vernetzung Anordnung der Protein-Untereinheiten, zum Beispiel die Wechselwirkungen zwischen RvB1 und RvB2 oder innerhalb der tetrameres Kern des CPS, offenbart native Massenspektrometrie geliefert Protein Zusammensetzungen der intakt-komplexe und gängigen Subcomplexes. Bei CPS, wofür keine Inter molekularen Wechselwirkungen zwischen den beiden Untereinheiten konnte, durch chemische Vernetzung beobachtet werden, zufolge native Massenspektrometrie jede große Untereinheit mit einer kleinen Untereinheit (Abbildung 4) interagiert. Tandem-Massenspektrometrie schlug die periphere Lage der kleinen Untereinheit in der Anlage und eine kleine Schnittstelle zwischen beiden Untereinheiten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow der native Massenspektrometrie und Vernetzung. Beide Techniken liefern ergänzen Ergebnisse. Während Einheimische Massenspektrometrie Zusammensetzungen und Interaktion Module offenbart, gibt Vernetzung Einblicke in Protein Interaktion Websites innerhalb der komplexe. Beachten Sie, dass chemische Vernetzung nur binäre Interaktionen offenbart. (A) der erste Schritt in der nativen Massenspektrometrie ist Buffer Tausch auf einen flüchtigen und wässrigen Puffer mit Filtereinheiten oder Gel Filtration Spalten. Massenspektrometrie von intakten Proteinkomplexe zeigt dann ihre Stöchiometrie. In Tandem-Massenspektrometrie Experimente sind periphere Untereinheiten dissoziiert. (B) für chemische Vernetzung, die Protein-Komplex wird mit einem vernetzende Reagenz inkubiert. Die vernetzte Proteine werden dann in Peptide verdaut, die anschließend durch flüssige Chromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie analysiert werden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Abbildung 2: SDS-PAGE von RvB1/B2 (A) und CPS (B) komplexe vernetzt. (A) 2,5 µM RvB1/B2 pro Gel Bahn geladen wurden. Die Konzentration der BS3 war vielfältig. Non-Cross-linked RvB1/B2 zeigt die zwei Protein-Untereinheiten auf etwa 50 kDa. Zugabe von BS3 verursacht kovalente Verknüpfung der Protein-Untereinheiten Protein Banden bei höherem Molekulargewicht führt. Die vernetzte Arten wird mit höheren Konzentrationen von BS3 erhöht. Optimale Vernetzung Bedingungen sind (rot) markiert. (B) 10 µM CPS pro Gel Bahn geladen wurden. Der große (90 kDa) und kleine (40 kDa) CPS Untereinheiten sind erhalten. Zugabe von BS3 verursacht kovalente Verknüpfung der Protein-Untereinheiten Protein Banden bei höherem Molekulargewicht führt. Optimale Vernetzung Bedingungen sind (rot) markiert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Abbildung 3: Native Massenspektrometrie und chemische Vernetzung der RvB1/B2 Komplex. (A) das native Massenspektrum zeigt zwei Arten von RvB1/B2; die intakte Dodecamer (d.h. (RvB1)6(RvB2)6) bei ca. 11.000 bis 12.000 m/Z und der Hexameric Ring (RvB1)3(RvB2)3 bei ca. 8.000 m/Z. Beide Arten zeigen zwei Populationen aus seinem markiert und untagged RvB2. Das Spektrum wurde von35geändert. (B) der Kristall-Struktur des RvB1/B2 zeigt (PDB-ID 4WVY). Wechsel von RvB1 und RvB2 bilden Untereinheiten zwei Hexameric Ringe. (C) Fragmentierung Spektrum an eine vernetzte di-Peptid. Der N-Terminus des RvB1 war vernetzt mit K23 RvB1. y-Ionen-Serie wurden für beide Peptide (rot und Cyan) erhalten. (D) Intra - und inter - protein-Interaktionen in der RvB1/B2-Komplex erhalten. Intra-cross-Links sind in rot dargestellt und Inter-cross-links in blau angezeigt werden. Der Einsatz zeigt zwei Inter molekulare Querverbindungen zwischen RvB1 und RvB2-Untereinheiten, die in der Kristallstruktur (grün, einfügen) visualisiert werden können. Interaktionen, die ihren Ursprung in zwei RvB2 Kopien werden als blaue gepunktete Linien angezeigt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Abbildung 4: Native Massenspektrometrie und chemische Vernetzung der CPS. (A) die native Massenspektrum von CPS zeigt drei komplexe. Die Hetero-Dimer (160 kDa), Hetero-Tetramer (320 kDa) und die Hetero-Octamer (640 kDa). Das Spektrum wurde von35geändert. (B) Tandem-Massenspektrometrie die tetrameres und Octameric CPS komplexe offenbarten Dissoziation von der kleinen Untereinheit des CPS. (C) der Kristall-Struktur des CPS wird (PDB-ID 1BXR) angezeigt. Die großen Untereinheiten bilden einen tetrameres Kern und die kleinen Untereinheiten befinden sich in der Peripherie des Komplexes. Inter molekulare Querverbindungen zwischen den beiden Kopien der großen Untereinheit werden (grün) angezeigt. (D) Interaktionen der großen und kleinen Untereinheiten CPS. Native Massenspektrometrie zeigte Subcomplexes und schlägt eine periphere Lage der kleinen Untereinheit. Chemische Querverbindungen zeigen Arrangements im tetrameres Kern von CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Tabelle 1: Datenbank Suchergebnisse. Die Proteine wurden durch flüssige Chromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie und Suche Datenbank identifiziert. Die Protein-Namen Beitritt Nummer und Beschreibung sowie Eiweiß Masse erhalten. Die Protein-Partitur, Anzahl der beobachteten Spektren pro Protein und die Anzahl der beobachteten Peptid-Sequenzen werden aufgelistet. Die fünf Peptide mit höchsten Punktzahlen der Maskottchen-Peptide sind für jedes Protein-Untereinheit aufgeführt. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle 2: Querverbindungen beobachtet in RvB1/B2 und CPS. Die Untereinheiten der komplexe und vernetzte Rückstände sind gegeben. Die Art der Querverbindung entsteht (Intra- oder Inter molekulare) aus überlappenden Peptid-Sequenzen oder einer früheren Studie35offenbart wurde. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Das übergeordnete Ziel der Kombination von Vernetzung mit nativer Massenspektrometrie besteht darin, komplementäre strukturelle Informationen über Proteinanordnungen mit mehreren Untereinheiten zu erhalten, die zur Aufklärung ihrer dreidimensionalen Anordnung beitragen. Chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie helfen, Schlüsselfragen der Strukturbiologie wie Zusammensetzung, Konnektivität und Stöchiometrie zu beantworten. Der Hauptvorteil der Kombination mehrerer Techniken besteht darin, dass komplementäre Informationen gewonnen werden, die mit nur einer Technik nicht verfügbar sind.Unser Workflow kann auf jeden anderen Proteinkomplex angewendet werden. Es kann aus Salzen oder Gewebe gereinigt oder aus gereinigten Proteinen rekonstituiert werden. Tragen Sie zunächst 7,5 Mikroliter vierfachen einfachen Puffer und drei Mikroliter 10-faches Reduktionsmittel auf den gewünschten Proteinkomplex auf.Schleudern Sie die Probe eine Minute lang bei der 16-fachen 200-fachen Schwerkraft herunter. Nach der Zentrifugation erhitzen Sie die Probe 10 Minuten lang auf 70 Grad Celsius. Bereiten Sie ein Gradientengel mit vier bis 12 % Gradient für die Elektrophorese vor und geben Sie das Gel in die Elektrophoresekammer.Den zuvor vorbereiteten Laufpuffer 20-mal mit Wasser verdünnen und die Elektrophoresekammer füllen. Geben Sie dann 0,5 Milliliter Antisauerstoff in die innere Kammer. Laden Sie einen geeigneten Proteinmarker in die erste Kavität des Gels und die Proteinproben in die verbleibenden Kavitäten.Trennen Sie dann die Proteine für die entsprechende Zeit bei 200 Volt. Um die Proteinbanden zu färben, geben Sie das Gel in eine Gelfärbebox und bedecken Sie das Gel mit einer Coomassie-Standlösung auf Wasserbasis. Inkubieren Sie das Gel über Nacht bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Gelschüttler.Entfärben Sie das Gel am nächsten Tag, indem Sie die Färbelösung durch Wasser ersetzen. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt etwa drei bis fünf Mal, bis der Gelhintergrund klar erscheint. Schneiden Sie nun mit einem Skalpell die Proteinbanden, die durch den blauen Coomassie-Fleck sichtbar sind, von den Gelen ab.Schneiden Sie die Proteinbanden vorsichtig in kleine Stücke von etwa einem Milliliter. Waschen Sie dann die Proteinbänder mit Wasser und Acetonitril. Reduzieren Sie die Disulfidbindungen mit DTT und alkylieren Sie dann die Cysteinreste mit Jodacetamid.Anschließend verdauen Sie die Proteine mit Trypsin, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Peptide zu extrahieren, inkubieren Sie die Gelstücke mit Ammoniumbicarbonat und Acetonitril und sammeln Sie den peptidhaltigen Überstand. Anschließend werden die Gelstücke mit 5%iger Ameisensäure und Acetonitril inkubiert und der peptidhaltige Überstand aufgefangen.Nach dem Sammeln des peptidhaltigen Überstands werden beide Überstände kombiniert und die extrahierten Peptide getrocknet, indem die Lösungsmittel in einer Vakuumzentrifuge verdampft werden. Sobald die Peptide trocken sind, mischen Sie sie mit 20 Mikrolitern 2%iger Acetonitril- und 0,1%iger Ameisensäurelösung. Lösen Sie die Peptide mit einem Ultraschallbad für zwei bis drei Minuten auf.Schleudern Sie dann die Probe in einer Zentrifuge bei 16.200-facher Schwerkraft für 30 Minuten herunter. Nachdem Sie die Probe in ein Autosampler-Fläschchen überführt haben, injizieren Sie fünf Mikroliter in ein Nano-LC-MS/MS-System und laden Sie das Peptidgemisch auf eine Umkehrphasen-C18-Vorsäule, um die Peptide online zu entsalzen und zu konzentrieren. Entfernen Sie den Lagerpuffer aus einer Spin-Säule mit Größenausschluss, indem Sie eine Minute lang bei der 1.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius zentrifugieren.Nach dem Verwerfen des Durchflusses waschen Sie die Säule dreimal, indem Sie 500 Mikroliter 200 millimolares Ammoniumacetat hinzufügen und anschließend zentrifugieren. Nach der Zentrifugation werden 20 Mikroliter der Proteinprobe auf die Säule geladen und vier Minuten lang bei der 1.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius zentrifugiert. Legen Sie nun eine zuvor vorbereitete goldbeschichtete Kapillare in einen Kapillarhalter.Öffnen Sie die Spitze einer Nadel und füllen Sie die Kapillare mit ein bis vier Mikrolitern Proteinprobe. Verbinden Sie den Kapillarhalter mit der Nano-Elektrospray-Quelle des Massenspektrometers und positionieren Sie die Spitze der Kapillare in einem Abstand von 0,5 bis 1,5 Zentimetern zur Konusöffnung. Verwenden Sie 80 bis 150 Liter Nanoflow-Gas pro Stunde, um das Spray zu initiieren, und passen Sie den Gasfluss an, um einen stabilen Sprühnebel zu erhalten.Passen Sie die Parameter und die Tune-Seite des Q-TOF-Instruments an. Starten Sie dann die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" klicken, und kombinieren Sie so viele Scans wie möglich, um ein gutes Massenspektrum zu erhalten. Lösen Sie 1,43 Milligramm BS3 und 100 Mikroliter Wasser, um eine 25-Millimolar-Stammlösung herzustellen.Fügen Sie als nächstes BS3 zum Proteinkomplex hinzu. Verwenden Sie unterschiedliche Mengen an BS3, um die optimale Vernetzerkonzentration zu ermitteln. Inkubieren Sie die Reaktionsgemische bei 25 Grad Celsius für eine Stunde in einem Thermomischer.Führen Sie nun die SDS-Seite der vernetzten Proteine mit einem Gradientengel von vier bis 12 % durch. Schneiden Sie die Gelbanden ab und verdauen Sie das Protein durch In-Gel-Verdauung, wie zuvor beschrieben. Nachdem Sie die Peptide aus dem In-Gel-Aufschluss erhalten haben, führen Sie die flüssigkeitschromatographische gekoppelte Massenspektrometrie wie zuvor beschrieben durch.Alle Proteinuntereinheiten des Heterododecamers RvB1/B2 und der heterooktameren CPS-Komplexe wurden mit hoher Sicherheit identifiziert. Das Massenspektrum von RvB1/RvB2 zeigt zwei Spezies, die den hexameren und dodekameren Doppelringen entsprechen. Eine Kristallstruktur für den RvB1/B2-Komplex zeigt die Anordnung des Doppelrings.Die Zugabe von BS3 an den RvB1/RvB2-Komplex bewirkt eine kovalente Bindung der Proteine, was zu Proteinbanden mit höherem Molekulargewicht führt. Und steigende Mengen an BS3 führen zu höheren Mengen an vernetzten Spezies, während nicht vernetzte Proteinuntereinheiten reduziert werden. Das vernetzte Dipeptidspektrum zeigt die Y-Ionenreihe beider Peptide, was diese Proteininteraktion bestätigt.Die Ergebnisse der BS3-Vernetzung werden in einem Interaktionsnetzwerk visualisiert, das sowohl intramolekulare Wechselwirkungen als auch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Untereinheiten zeigt. Das native Massenspektrum von CPS zeigt das Heterodimer, das Heterotetramer und das Heterooctamer. Die Tandem-Massenspektrometrie des tetramischen und oktameren CPS zeigt eine Dissoziation der kleinen CPS-Untereinheit.Die chemische Vernetzung von CPS mit dem BS3-Vernetzer zeigt mehrere intramolekulare Vernetzungen zwischen zwei Kopien der großen CPS-Untereinheit. Die Kristallstruktur zeigt, dass die Wechselwirkungsfläche zwischen dem tetramischen Kern und den peripheren kleinen Untereinheiten sehr klein ist, was das Fehlen von Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten erklären könnte. Einmal gemeistert, kann unser Workflow eine Woche lang durchgeführt werden, wenn er richtig ausgeführt wird.Da der Proteinaufbau zu komplex ist, wird zusätzliche Zeit für die Datenanalyse benötigt. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine computergestützte Modellierung durchgeführt werden, um dreidimensionale Modelle der Proteinkomplexe zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie chemische Vernetzungs- und native Massenspektrometrie-Experimente durchführen, bis diese beiden komplementären Techniken helfen, die Strukturen von Proteinanordnungen aufzuklären.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie ist eine aufstrebende Gas-Phasen-Technologie, die Ionen trennt, auf der Grundlage ihrer Kollision Querschnitt und Masse. Die Methode liefert dreidimensionale Informationen über die gesamte Topologie und Form der Protein-Komplexen. Hier skizzieren wir ein grundlegendes Verfahren für die Geräteeinstellung und Optimierung, Kalibrierung der Drift Zeiten, und die Interpretation der Daten.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Massenspektrometrie (MS) hat als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Struktur und Dynamik der makromolekularen Versammlungen entstanden. Hier integrieren wir MS-basierte Ansätze, um komplexe Proteinbildung und Liganden Bindung zu befragen.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Hier zeigen wir, wie kleine Winkel x-ray Scattering (SAXS) genutzt werden können, um Informationen auf niedriger Auflösung Umschläge repräsentieren die makromolekularen Strukturen zu erhalten. Bei Verwendung in Verbindung mit hochauflösenden strukturelle Techniken wie Röntgen-Kristallographie und magnetischen Kernresonanz bieten SAXS detaillierte Einblicke in multidomain Proteine und makromolekulare komplexe in Lösung.

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. Eine einfache Methode, um multimerische Komplexe zu analysieren, die durch diese Verknüpfungen stabilisiert werden, ist die Nicht-Remation der SDS-PAGE-Analyse. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS veranschaulicht.

Die Kombination von nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse und chemischer Vernetzung mit Detect Multimerischen Komplexen, die durch Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture stabilisiert wurden

Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Die experimentellen Verfahren zur Durchführung einer diethylpyrocarbonat-basierten kovalenten Markierung mit massenspektrometrischem Nachweis werden beschrieben. Diethylpyrocarbonat wird einfach mit dem interessierenden Protein oder Proteinkomplex gemischt, was zur Modifikation von lösungsmittelzugänglichen Aminosäureresten führt. Die modifizierten Rückstände können nach proteolytischem Aufschluss und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie identifiziert werden.

Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

Erfahren Sie, wie chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie kombiniert werden, um die Architektur von Mehruntereinheiten-Proteinkomplexen zu untersuchen. Diese Methode liefert komplementäre strukturelle Informationen für die Strukturbiologie.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren (Video) | JoVE Journal

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

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