Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Isolierung und Kultivierung von Knochenmarkstromazellen oder BMSCs. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Knochen- und Adipozytenbereich zu Vorläuferzellen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass BMSCs relativ schnell, wiederholbar und kostengünstig isoliert werden können.

visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da es schwierig sein kann, die Sezierschritte allein mit Text zu erklären. Bevor Sie mit der Knochenentnahme beginnen, geben Sie 100 Mikroliter Knochenmarkstammzell-Kulturmedium in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jeweils drei zu entnehmende Knochen. Und schneiden Sie das Ende von einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze pro Mikrozentrifugenröhrchen ab, so dass jede Spitze in ein einzelnes Röhrchen mit geschlossenen Deckeln passt.

Legen Sie als nächstes die erste 78 Wochen alte euthanasierte Maus in Rückenlage auf ein Sezierbrett und besprühen Sie das Tier mit 70%Ethanol. Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Hautzelt auf dem Bauch zu erzeugen, und verwenden Sie eine sterile Sezierschere, um einen etwa einen Zentimeter großen Hautschnitt zu machen. Schäle die Haut ab, um den Unterbauch und die Beine freizulegen.

Schneiden Sie entlang des Beckenkamms jeder Hüfte, um die Oberschenkelköpfe vom Becken zu trennen, und machen Sie einen Schnitt durch die Mittellinie des Beckens, um die Beckenknochen zu trennen, und schneiden Sie unterhalb der Knöchelgelenke, um die Füße zu entfernen. Trennen Sie dann das Schienbein vom Oberschenkelknochen, indem Sie am Kniegelenk schneiden. Verwenden Sie dann fusselfreie Tücher, um den Muskel vorsichtig von den Oberschenkelknochen, Tibias und Beckenknochen zu entfernen.

Wenn alle Knochen entnommen wurden, legen Sie die Proben in PBS auf Eis und geben Sie die Proben in eine sterile Kulturhaube. Führen Sie mit steriler Technik ein bis zwei Millimeter große Schnitte sowohl am proximalen als auch am distalen Ende jedes Knochens durch, bevor Sie drei Knochen in jede modifizierte Mikropipettenspitze in den Mikrozentrifugenröhrchen einsetzen. Entnehmen Sie das Knochenmark durch Zentrifugation aus den Knochen und bestätigen Sie, ob das Knochenmark am Ende der Drehung vollständig auf den Boden jedes Mikrozentrifugenröhrchens pelletiert wurde.

Wenn das gesamte Knochenmark gesammelt wurde, erscheinen die Knochen weiß. Entfernen Sie die Mikropipettenspitzen und die Knochen aus den Entnahmeröhrchen, um sie ordnungsgemäß aus biologischer Sicherheit zu entsorgen. Um die Knochenmarkzellen zu plattieren, verwenden Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um die Pellets langsam wieder zu suspendieren und eventuelle Klumpen aufzubrechen, und geben Sie die Proben in einem einzigen konischen 15-Milliliter-Röhrchen zusammen.

Geben Sie 10 Milliliter Knochenmarkstammzell-Kulturmedium pro 500 Mikroliter Probe hinzu und filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 70-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, um alle Knochenfragmente zu entfernen. Nach der Zählung säen Sie die Knochenmarkzellen mit einer Dichte von 10 bis sechs Zellen pro Quadratzentimeter in frischem Kulturmedium für eine 72-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 aus. Ersetzen Sie am dritten Tag den Überstand durch frisches Medium und wechseln Sie das Medium danach alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 100 % erreichen.

Um eine gespaltene Knochenmarkzellpopulationskultur zu dispontieren, werden die entnommenen Knochenmarkzellen einer Maus 48 Stunden lang in einer 10 Zentimeter großen Zellkulturschale in frischem Kulturmedium in einem Zellkulturinkubator plattiert. Entfernen Sie am zweiten Tag der Kultur den nicht adhärenten hämatopoetischen Stammzellen-haltigen Überstand und waschen Sie die Platte vorsichtig mit PBS, ohne die adhärenten Knochenmarkzellen zu stören. Ersetzen Sie das PBS durch 0,25% Trypsin.

Nach ein bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius wird die Reaktion mit frischem Zellkulturmedium abgeschreckt und die Zellen in der resultierenden Zellsuspension gezählt. Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen für die Beschichtung und suspendieren Sie das Pellet in ausreichend frischem Kulturmedium für die gewünschte Beschichtungsdichte. Legen Sie dann die Platten bis zur Konfluenz in den Zellkultur-Inkubator.

Um die Differenzierung von Knochenmarkstammzellen in Osteoblasten zu induzieren, ersetzen Sie das Zellkulturmedium alle zwei Tage durch ein Differenzierungsmedium, bis die Zellen beginnen, weiße Mineralisierungsknötchen zu produzieren, die makroskopisch beobachtet werden können. Um die Differenzierung von Adipozyten in Knochenmarkstammzellen zu induzieren, ersetzen Sie das Zellkulturmedium einer konfluenten Knochenmarkzellkultur durch ein Adipozyten-Induktionsmedium. Ersetzen Sie den Überstand nach zwei Tagen Kultur durch frisches Adipozyten-Induktionsmedium und wechseln Sie am vierten Tag zu Adipozyten-Basismedium.

Bestätigen Sie am siebten Tag, dass die Zellen Lipidtröpfchen angesammelt haben und dass sie einen Phänotyp aufweisen, der dem reifen Adipozyten ähnelt. Um die hämatopoetischen Stammzellen in Osteoklasten zu differenzieren, wird das Zellkulturmedium durch ein Osteoklasten-Differenzierungsmedium ersetzt, wenn eine Gesamtknochenmarkzellkultur oder eine nicht adhärente Zellkultur adhärent wird. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage und überprüfen Sie die Osteoklastendifferenzierung täglich unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung, bis die Osteoklasten verschmelzen und mehrkernige Zellen bilden, typischerweise um den fünften bis siebten Tag der Differenzierung.

Konfluente Kulturen von BMSCs können unter Verwendung eines osteogenen Mediums, das aus Ascorbinsäure und Beta-Glycerophosphat besteht, in Osteoblasten differenziert werden. Nach einigen Tagen der Differenzierung beginnen die Osteoblasten mit der Expression alkalischer Phosphatase. Und eine weitere Differenzierung wird die Produktion der Osteoidmatrix und letztendlich die Mineralisierung dieser Matrix auslösen.

Interessanterweise differenziert sich nur ein Teil der Zellen in vitro zu Osteoblasten, wie die Kristallviolett-Färbung zeigt. Unabhängig davon, ob gemischte Populationen oder gespaltene Knochenmarkzellpopulationen verwendet werden, differenziert sich nur ein Teil der Zellen in Adipozyten, die als runde Zellen mit mehreren Lipidvakuolen erscheinen, die mit ölrotem O-Farbstoff gefärbt werden können. Humane Stammzellkulturen, die mit dem murinen zellstimulierenden Faktor und RANKL ergänzt werden, fusionieren schnell zu mehrkernigen Zellen, die positiv für TRAP gefärbt sind.

Diese Osteoklasten sind in der Lage, Mineralmatrix in vitro zu resorbieren und können zur Beurteilung der osteoklastischen Aktivität verwendet werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, abhängig von der Anzahl der Mäuse. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Werkzeuge zu sterilisieren und die Medien vorher vorzubereiten, um so schnell und aseptisch wie möglich arbeiten zu können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Stromazellen im Knochenmark isoliert und kultiviert.