Name: Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Dot-Blot-Methode zur AAV-Titration und zur funktionellen Bewertung von Assembly-aktivierenden Proteinen in HEK 293-Zellen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung von AAV-Kapsid-Assemblierung.

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Wir danken für die Bereitstellung von uns mit dem pEMBL-CMV-GFP-Plasmid Xiao Xiao an der University of North Carolina in Chapel Hill. Wir danken Christopher Cheng und Samuel J. Huang für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service (NIH R01 NS088399 und T32 EY232113) gewährt.

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<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Bericht wird die Nützlichkeit des quantitativen Dot-Blot Assays AAV AAPs und ihre Rolle im Kapsid Montage studieren beschrieben. Erkenntnisse aus diesen Studien bieten detaillierte Einblicke in die angeborenen Unterschiede in den Prozess der AAV Kapsid Montage und die funktionale Rolle der AAPs zwischen verschiedenen Serotypen. In dieser Hinsicht der AAV VP3-AAP Kreuz-Ergänzung Dot blot Test ergab, dass die Schlange AAV VP3 eine strenge Abhängigkeit auf die Co Expression von seinen Verwandten AAP Kapsid Montage...

Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein kleines, unbehüllte, einzelsträngige DNA-Virus mit einem Genom von ca. 4,7 Kilobases (kb). Die AAV-Genom enthält offene Lesung Frames (ORFs) für die Rep und GAP Gene. Im Jahr 2010 wurde eine bislang nicht identifizierte Elementoptionen Protein kodiert, indem ein + 1 Rahmen verschoben ORF im AAV2 GAP gen von Sonntag Et Al. entdeckt und festgestellt, dass eine entscheidende Rolle bei der Montage des AAV2 Kapsid VP Monomer Proteine in einer viralen Kapsid1. Dieses neuartige Protein wurde Montage-aktivierende Protein (AAP) nach der Rolle benannt spielt es bei der Förderung von Kapsid Montage1.
ORFs für AAP schon identifizierten Bioinformatically in den Genomen von allen Parvoviren innerhalb der Gattung Dependoparvovirus, aber nicht in das Genom der Viren von verschiedenen Gattungen des Parvovirus Familie1,2. Funktionelle Studien dieses neuartigen Proteins konzentrierten sich zunächst auf der AAP vom Prototyp AAV2 (AAP2), die die wesentliche Rolle der AAP2 etabliert hat, bei der Ausrichtung unmontiert VP Proteine der Nukleolus für ihre Ansammlung und Bildung in vollem Umfang Capsids1,3,4montiert. Die Unfähigkeit der AAV2 Capsids zusammenzubauen in Ermangelung von AAP Ausdruck wurde unabhängig von mehreren Gruppen, einschließlich der unsrigen bestätigt1,2,3,4,5 . Nachfolgende Studien zur AAV Serotypen 1, 8 und 9 bestätigt die wichtige Rolle der AAPs im Kapsid Montage als VP3 Monomer Proteine AAV1, 8 und 9 waren nicht in der Lage, eine komplett montierte Kapsid bei fehlender Co Ausdruck von AAP2zu bilden.
Vor kurzem, durch Ansätze, die die Verwendung des quantitativen Dot blot Assays, untersuchten wir die Fähigkeit der AAV1, 12 VP3 Monomere zusammenzubauen in Capsids in der Abwesenheit von AAP Ausdruck und die Fähigkeit des AAP1 bis 12 Montage VP3 Monomere von zu fördern heterologen Serotypen. Diese Studie hat ergeben, dass AAV4, 5 und 11 VP3 Monomere können ohne AAP zusammenstellen. Darüber hinaus ergab, dass acht von zwölf AAP-Serotypen wir untersuchten (d.h.alle außer AAP4, 5, 11 und 12) angezeigt eine breite Fähigkeit, Kapsid Montage der heterologen AAV Serotyp Capsids, während AAP4, 5, 11 und 12 angezeigt unterstützen eine wesentlich begrenzten Möglichkeiten in dieser Hinsicht6. Diese vier Serotypen sind phylogenetisch weit entfernt von den anderen AAP Serotypen2,3. Darüber hinaus hat die Studie erhebliche Heterogenität in subzellulären Lokalisierungen von verschiedenen AAPs6aufgedeckt. Darüber hinaus die Studie hat vorgeschlagen, dass der enge Vereinigung von AAP mit montierten Capsids und Nukleolus, das Markenzeichen der AAV2 Kapsid Versammlung, nicht unbedingt zu anderen Serotypen, einschließlich AAV5, verlängert werden 8 und 9, die Nukleolus Ausschluss von anzeigen montierte Capsids6. Deshalb der Erkenntnissen aus der Studie bestimmten Serotyp AAP nicht breit anwendbar auf alle AAP Biologie. Solch rätselhafte Natur der AAP Biologie unterstreicht die Notwendigkeit, die Rolle und Funktion der einzelnen AAP von kanonischen und nicht-kanonischen AAV-Serotypen zu untersuchen.
Die biologische Rolle von AAP in Kapsid Baugruppe kann beurteilt werden, durch die Bestimmung, dass vollständig verpackt AAV Viruspartikel Titer in menschlichen embryonalen Niere (HEK) 293-Zellen, die am häufigsten verwendeten Zelllinie für AAV Vektor Produktion, mit oder ohne AAP Protein produziert Ausdruck. Die Standardmethoden für AAV Quantifizierung sind quantitative PCR (qPCR)-basierte Assays7,8 und quantitative Dot-Blot-basierte assays9. Andere Methoden zur AAV Viruspartikel Quantifizierung wie Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay10,11 oder optische Dichte Messung12 sind nicht ideal für Proben, die aus vielen verschiedenen AAV-Serotypen abgeleitet oder Proben mit Verunreinigungen (grobe Lysates oder Kultur, Medien), die oft für AAV Forschung verwendeten Proben kontaminiert. QPCR wird derzeit am häufigsten für AAV Quantifizierung verwendet; Allerdings ist es notwendig zu erkennen, mögliche Vorbehalte des qPCR basierende Assays, als der Test Systemfehler und bedeutende Titer Variationen13,14führen können. PCR-basierte Testsysteme betroffen sind eine Reihe von potenziell Störfaktoren, wie das Vorhandensein von kovalent geschlossenen terminal Haarnadeln in PCR-Vorlagen, die Verstärkung13hemmen. Sogar eine erfahrene Person Potenzial einführen kann Störfaktoren in einer qPCR-basierten Test unwissentlich13. Im Gegensatz dazu sind quantitative Dot-Blot Assays eine klassische Molekularbiologie-Technik, die beinhaltet keine Genom Verstärkung und verwendet ein viel einfacheres Prinzip mit einem minimalen Risiko von Fehlern im Vergleich zu qPCR basierende Assays. Die Methode ist weniger technisch anspruchsvoll; die Untersuchungsergebnisse sind daher auch von unerfahrenen Personen einigermaßen reproduzierbar.
In diesem Bericht beschreiben wir die methodischen Details eines quantitativen Dot Blot Assays wir routinemäßig für AAV Vektor Quantifizierung verwenden und geben Sie ein Beispiel von, wie den Test zur Untersuchung der Montage-Förderung der Rolle von AAPs gemeinsam anwenden Serotypen (AAV5 und AAV9) und eine zuvor fußgelenkes AAP von Snake AAV14. In der Natur AAV VP und AAP Proteine werden in der GUS von einem einzigen Gen (d.h., VP-AAP Cis-Ergänzung), während in der hier beschriebenen Test ausgedrückt, VP und AAP Proteine liefern wir in Trans aus zwei separaten Plasmide (d.h., VP-AAP Trans-Ergänzung). Da jede VP oder AAP Protein aus verschiedenen Serotypen von jeder unabhängige Plasmid ausgedrückt werden kann, wird es möglich, Heterologe VP-AAP-Kombinationen für Kapsid Assembly (d.h. VP-AAP Kreuz-Ergänzung) zu testen. Kurz, drückt AAV VP3 aus verschiedenen Serotypen in HEK 293 Zellen von Plasmid DNA Transfektion, ein AAV-Vektor-Genom in das Vorhandensein oder Fehlen des cognate Serotyps AAP oder in Anwesenheit einer heterologen Serotyp AAP zu verpacken. Nach der Produktion unterliegen Nährmedien und Zelle Lysates ein Dot Blot Assay, das virale Genom innerhalb der Kapsid Shell zu quantifizieren. Der erste Schritt des Dot-Blot Assays ist zur Behandlung von Proben mit einer Nuklease kontaminierenden Plasmid-DNA und unverpackten AAV Genome in Proben zu entfernen. Andernfalls würde die Hintergrund-Signale insbesondere erhöhen, wenn ungereinigten Proben analysiert werden. Darauf folgt dann durch eine Protease-Behandlung zu brechen viralen Capsids und Nuklease-resistente viraler Genome in Beispiellösungen freisetzen. Nächste, virale Genome sind denaturiert, getupft auf eine Membran und hybridisiert mit eine virale Genom-spezifische DNA-Sonde für die Quantifizierung. In der Beispiel-Test hier berichtet zeigen wir Ihnen, dass Snake AAV VP3 Schlange AAP Kapsid Montage und Schlange AAP fördert nicht die Montage des AAV9 Capsids im Gegensatz zu vielen der AAPs abgeleitet von AAP-abhängige Serotypen, die auch die Montage von fördern können Heterologe Serotyp Capsids. Zu guter Letzt berichten wir eine wichtige Einschränkung, qPCR oder Dot-Blot-basierte AAV Quantifizierung Tests, dass die Wahl der Nuklease die Untersuchungsergebnisse erheblich beeinträchtigt.

<table><tbody><tr><td>Benzonase</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td> im <td>Haupttext als Serratia marcescen endonuclease bezeichnet.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>im Haupttext als DNase I Enzym A bezeichnet.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>im Haupttext als DNase I Enzym B bezeichnet.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>wird im Haupttext als DNase I Enzym C bezeichnet.</td></tr><tr><td>1,5 mL Attached O-Ring Screw Cap Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>AAV-293-Zellen</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>HEK-293-Zelllinie, die für die Verpackung von AAV-Virionen optimiert ist.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0,5 M EDTA-Lösung</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Buffer</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot-Gerät</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>DNA Extractor Kit</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>Dies wird für quantitative Dot-Blots auf gereinigten Viren verwendet. Wir verwenden nur ein halbes Volumen aller Reagenzien in jedem Schritt, der für das Protokollschema 2 in dem vom Hersteller bereitgestellten Handbuch empfohlen wird.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-hoher Glukosegehalt (4,5 g/L)Lonza</td><td></td> <td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>bezeichnet als Polysaccharose 400.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Hering Spermien DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid Hexahydrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini Quick Spin DNA-Säulen</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vektor</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimaging-Belichtungskassette</td><td>GE Gesundheitswesen Life Sciences</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimaging-Bildschirme</td><td>GE Gesundheitswesen Biowissenschaften</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Maxi-Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA-Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Random Primer Labeling Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Forward (N25 Nukleotide aus dem 4. Nukleotid im AAP ORF, RE1 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Reverse (N25 sind die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF, RE2 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Forward (N25 die ersten 25 Nukleotide des VP3 ORF, RE1 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Reverse (N25 sind die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF, RE2 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Lachsspermien DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>serologische Pipetten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat Tribasisches Dihydrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur Behandelt 6-Well-Platten-Corning</td><td></td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Es wird der optimale Vernetzungsmodus verwendet, der eine UV-Energiedosis von 120 mJ/cm2.</td></tr><tr><td>Zeta-Sondenmembran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

eine quantitative dot blot assay für aav titration und seine verwendung für funktionale bewertung von adeno-assoziierten virus assembly-aktivierende proteine

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Während Adeno-assoziierte Virus (AAV) als eine attraktive Vektor für die Gentherapie weithin anerkannt ist, dient es auch als Modell für das Verständnis der Biologie Virus Virus. In letzterer Hinsicht hat die jüngste Entdeckung eines nichtbauliche AAV-Proteins, Montage-aktivierende Protein (AAP), bezeichnet ein neues Licht auf die Vorgänge bei Einbau der viralen Kapsid VP Proteine in einem Kapsid vergossen. Obwohl viele AAV Serotypen AAP für die Montage benötigen, wir haben vor kurzem berichtet, dass AAV4, 5, und 11 sind Ausnahmen von dieser Regel. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass AAPs und montierten Capsids der verschiedenen Serotypen zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu lokalisieren. Diese unerwartete Heterogenität in den biologischen Eigenschaften und Funktionsrollen der AAPs unter verschiedenen AAV Serotypen unterstreicht die Bedeutung der Studien über AAPs aus verschiedenen Serotypen abgeleitet. Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für AAV Quantifizierung und seine Anwendung auf AAP Abhängigkeit und Serotyp Spezifität in Kapsid Baugruppe zu beurteilen. Um das Dienstprogramm des Dot-Blot Assays zu demonstrieren, brachen wir um zu charakterisieren, Kapsid Montage- und AAP Abhängigkeit der Schlange AAV, ein zuvor fußgelenkes Reptil AAV, sowie AAV5 und AAV9, die bisher gezeigt wurden, AAP-unabhängige und AAP-abhängige Serotypen, beziehungsweise. Der Test ergab, dass die Schlange AAV Kapsid Montage erfordert Schlange AAP und kann nicht durch AAPs aus AAV5 und AAV9 gefördert werden. Der Test zeigte auch, dass im Gegensatz zu vielen gemeinsamen Serotyp AAPs, die Förderung der heterologen Kapsid Montage durch Kreuz-Ergänzung, Schlange AAP Versammlung des AAV9 Capsids nicht fördert. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Wahl der Nuklease erheblich das Auslesen des Dot-Blot Assays beeinträchtigt, und somit eine optimale Enzym Auswahl entscheidend für erfolgreiche Beurteilung der AAV-Titer ist.

Ein repräsentatives Ergebnis der quantitativen Dot Flecken für die Quantifizierung der gereinigten AAV Vektor Bestände in großem Maßstab produziert ist in Abbildung 1dargestellt. Mit dieser Dot-Blot Assay war der Titer einer doppelsträngigen AAV2G9-CMV-GFP Vektor Aktie ermittelt. Der Vektor wurde durch zwei Runden der Cäsiumchlorid (CsCl) gereinigt-Dichtegradienten Ultrazentrifugation durch Dialyse als zuvor beschriebenen20gefolgt. In ...

Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für die Quantifizierung der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Titer und deren Anwendung zur Untersuchung der Rolle von Montage-aktivierende Proteine (AAPs), eine neuartige Klasse von nichttragenden virale Proteine in allen AAV Serotypen, bei der Förderung der Versammlung des Capsids verwandt und heterologen AAV-Serotypen abgeleitet.

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Mit dieser Methode können sowohl gereinigte als auch ungereinigte AV-Vaktiter bestimmt und die Fähigkeit des AAV-AAP beurteilt werden, die Assemblierung von verwandten und heterologen AV-Serotyp-Kapsis zu fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine unkomplizierte, kostengünstige Methode handelt, die die Nachteile anderer AAV-Titrationsmethoden vermeidet. Obwohl diese Methode häufig für die Quantifizierung von AAV-Vektoren verwendet wird, kann sie auch angewendet werden, um verschiedene grundlegende Fragen zur AAV-Biologie zu beantworten, wie in diesem Protokoll gezeigt.Am Tag Null, nach der Kultivierung von HEK 293-Zellen auf 90 % Konfluenz, bereiten Sie das Transfektionsreagenz vor, indem Sie die Plasmide in 96 Mikrolitern PBS ohne Kalzium oder Magnesium in sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Wie in dieser Tabelle angegeben, beträgt die Gesamtmenge an DNA zwei Mikrogramm pro Vertiefung. Fügen Sie dem PBS-Plasmid-DNA-Mix vier Mikroliter PEI-Lösung hinzu.Das endgültige Volumen beträgt ca. 100 Mikroliter oder 5 % Volumen des Nährmediums. Wirbeln Sie die Röhrchen kurz vor und inkubieren Sie das DNA-PEI-Gemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Röhrchen in einer Mikrozentrifuge kurz drehen, um die Flüssigkeit am Boden aufzufangen.Und geben Sie die DNA-PEI-Mischung tropfenweise in das Kulturmedium in jeder Vertiefung der HEK 293-Kulturplatte. Bewegen Sie dann die Platten vorsichtig und stellen Sie sie wieder in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2. Die Transfektion der HEK 293-Zelle ist eine wichtige Komponente dieses Protokolls für die Produktion von Viren mit hohem Titer.Es sollten gesunde Zellen mit niedriger Passagezahl verwendet werden, und es sollte darauf geachtet werden, dass die Monoschicht der Zellen nicht gestört wird. Beobachten Sie an den Tagen eins und zwei unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop Zellen, die mit dem PCMVGFP-Plasmid transfiziert wurden, um die Transfektionseffizienz zu beurteilen. Pipettieren Sie am fünften Tag die Zellen und das virushaltige Medium auf und ab oder verwenden Sie einen Zellschaber, um alle Zellen abzukratzen.Übertragen Sie dann die Suspension in konische 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Um die Viruspartikel zurückzugewinnen, tauen Sie die gefrorenen Röhrchen schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.Wirbeln Sie dann die Röhren eine Minute lang kräftig ein, um die Rückgewinnung von AAV aus den Zellen zu maximieren. Pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3.700 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann werden 200 Mikroliter des Überstands aus jedem Röhrchen in markierte Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen für den Dot-Blot-Assay überführt.Um die Proben mit Serratia marcescens Endonukompaktase zu behandeln, bereiten Sie die Reagenzien von Mischung A und Mischung B vor. Geben Sie 10 Mikroliter jedes Reagenzes in jedes Probenröhrchen. Wirbeln Sie die Proben fünf Sekunden lang und drehen Sie sie kurz, um die Flüssigkeit auf dem Boden der Röhrchen zu sammeln.Dann inkubieren Sie die Röhrchen mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie nach kurzem Schleudern der Proben eine Proteinase-K-Behandlung durch, indem Sie das Reagenz der Mischung C vorbereiten und 180 Mikroliter in jedes Röhrchen geben. Nach dem Vortexen und erneuten kurzen Schleudern der Röhrchen wird sie eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius inkubiert.Sobald die Proben wieder Raumtemperatur erreicht haben, fügen Sie 200 Mikroliter Phenol-Chloroform hinzu und wirbeln Sie die Röhrchen eine Minute lang durch. Anschließend werden die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 16, 100 G und Raumtemperatur mindestens fünf Minuten lang geschleudert. Übertragen Sie 320 Mikroliter der wässrigen Schicht oder 80 % des wässrigen Flüssigkeitsvolumens in ein neues Standard-Mikrozentrifugenröhrchen.Dieser Transferschritt ist von entscheidender Bedeutung, da das gleiche Volumen aus der Probe entnommen werden muss, um die Genauigkeit für die AAV-Quantifizierung zu erhalten. Es sollte darauf geachtet werden, dass die organische Phase beim Entfernen der wässrigen Schicht vermieden wird. Bereiten Sie das Reagenz der Mischung D vor und geben Sie 833 Mikroliter in jedes Probenröhrchen.Nachdem Sie die Röhrchen vortexiert haben, inkubieren Sie sie mindestens 20 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren den Überstand abgießen und die Röhrchen einmal auf einem sauberen Papiertuch abtupfen. Pipettieren Sie etwa 500 Mikroliter 70%iges Ethanol in jedes Röhrchen und wirbeln Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang durch.Nachdem Sie die Proben erneut geschleudert haben, gießen Sie den Überstand ab und tupfen Sie die Röhrchen einmal auf einem sauberen Papiertuch ab. Trocknen Sie die Pellets dann bei 65 Grad Celsius, bevor Sie sie in TE-Puffer resuspendieren. Um den Dot-Blot-Assay durchzuführen, bereiten Sie Plasmid-DNA-Standards vor, indem Sie AAV-vektorisierte Genomplasmid-DNA auf 10 Nanogramm pro Mikroliter in Wasser oder Tris-HCL-Puffer verdünnen.Übertragen Sie ein 25-Mikroliter-Aliquot der verdünnten Plasmid-DNA in ein frisches Röhrchen und linearisieren Sie es mit einem geeigneten Restriktionsenzym in einem Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern für eine Stunde. Geben Sie 450 Mikroliter Wasser oder TE in das Röhrchen mit dem verdauten Plasmid-DNA-Standard und mischen Sie es gründlich. Übertragen Sie dann 70 Mikroliter dieser Mischung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1.330 Mikrolitern Wasser oder TE, um einen verdünnten Plasmidstandard herzustellen.Um das Dot-Blot-Gerät einzurichten, schneiden Sie die Blotting-Membran mit einer Schere auf eine für die Anzahl der Proben und Standards geeignete Größe zu. Weichen Sie die Membran 10 Minuten lang mit Wasser ein, bevor Sie sie auf das Dot-Blot-Gerät legen. Decken Sie dann die ungenutzten Vertiefungen ab.Geben Sie Wasser in die Brunnen, in die die Proben geladen werden. Legen Sie ein Vakuum an, ziehen Sie das Wasser durch die Brunnen, prüfen Sie, ob Fehler vorhanden sind, und ziehen Sie dann die Schrauben wieder fest. Wiederholen Sie den Test, falls erforderlich.Tragen Sie 400 Mikroliter jedes verdünnten Plasmid-DNA-Standards auf jede Vertiefung auf und führen Sie vier Spuren mit Standardverdünnungen durch. Verwenden Sie zwei separate Aliquots des Standard-Digests, und laden Sie jedes in doppelter Ausführung. Tragen Sie dann 200 Mikroliter pro Vertiefung jeder viralen DNA-Probe auf.Wenden Sie ein sanftes Vakuum an, um die DNA-Lösungen durch die Vertiefungen zu ziehen. Sobald alle Vertiefungen geleert sind, lassen Sie das Vakuum ab, indem Sie das Dreiwegeventil einstellen. Geben Sie 400 Mikroliter einer X alkalischen Lösung in jede Vertiefung.Warten Sie dann fünf Minuten, bevor Sie das Vakuum erneut anwenden, um die Vertiefungen zu leeren. Wenden Sie das Vakuum erneut an und zerlegen Sie das Dot-Blot-Gerät. Entfernen Sie dann die Membran und spülen Sie sie mit zwei X SSC ab.Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben auf ein sauberes Papiertuch, um den überschüssigen Puffer zu entfernen. Verwenden Sie einen geeigneten UV-Vernetzer, um die geblotte DNA mit der Membran zu vernetzen. Die Membran ist nun bereit für die Hybridisierung.Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche. Spülen Sie die Membran mit fünf bis 10 Millilitern vorgewärmtem Hybridisierungspuffer und verwerfen Sie den Puffer. Fügen Sie dann 10 Milliliter vorgewärmten Hybridisierungspuffer hinzu und stellen Sie die Flasche in einen rotierenden Hybridisierungsofen, der auf 65 Grad Celsius eingestellt ist.Drehen Sie die Flasche mindestens fünf Minuten lang. Geben Sie schnell die denaturierte Spermien-DNA und die radioaktive Sonde in den Hybridisierungspuffer in der Flasche und schütteln Sie ihn 10 Sekunden lang, um ihn zu mischen. Stellen Sie die Flasche wieder in den 65 Grad Celsius heißen Ofen und inkubieren Sie sie mindestens vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius.Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, stoppen Sie die Rotation. Entfernen Sie die Hybridisierungsflasche und gießen Sie dann die radioaktive Sondenlösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit einem auslaufsicheren Stopfenverschluss. Um die Membran zu waschen, geben Sie 20 bis 30 Mikroliter vorgewärmten Waschpuffer in die Hybridisierungsflasche und drehen Sie sie fünf Minuten lang.Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen die Membran aus der Hybridisierungsflasche und entfernen Sie mit Küchenpapier den überschüssigen Puffer von der Membran. Legen Sie dann die Membran in einen durchsichtigen Papierhalter aus Kunststoff.Überprüfen Sie mit einem Geigerzähler die radioaktiven Signale auf der Membran. Nachdem Sie den gelöschten Phosphorbildschirm der Membran ausgesetzt haben, scannen Sie den Bildschirm mit einem Phosphorbild-Scansystem und erhalten Sie die Daten zur Signalintensität jedes Punkts. Führen Sie eine Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.Dieser quantitative Dot-Blot für die AAV-2G9-Vektortitration besteht aus zwei Sätzen von Standards und drei verschiedenen Mengen eines AAV-Vektorpräparats, einschließlich 0,3, 0,1 und 0,03 Mikroliter in doppelter Ausführung. Die Mengen, die auf dem Blot untersucht werden sollen, werden empirisch oder auf Basis eines vorläufigen Assays bestimmt. Es wurde durch Interpolation bestimmt, dass 0,3, 0,1 und 0,03 Mikroliter Aliquots des AAV-2G9-Vektors im Durchschnitt einen Titer von 5,16, 0,27 Nanogramm äquivalenten Mikrolitern aufwiesen.Alle möglichen verwandten und heterologen Serotyp-Kombinationen von VP3 cas-pid und AAP-Proteinen aus AAV5, AAV9 und Schlangen-AAV wurden mittels eines quantitativen Dot-Blot-Assays auf Kapsidassemblierung untersucht. Die Ergebnisse dieses Diagramms zeigen, dass AAV5 VP3 assembliert, unabhängig davon, ob AAP in trans bereitgestellt wurde. Darüber hinaus können AAP5 und AAP9 die Assemblierung von AAV9 VP3-Kapsidn fördern, obwohl AAP5 weniger effektiv funktioniert als AAP9.Weder AAP5 noch AAP9 zeigen eine Assemblierung, die die Aktivität auf Schlangen-AAV VP3 fördert, und Schlangen-AAP fördert nur die Assemblierung von Schlangen-AAV VP3. Eine Dot-Blot-Analyse wurde angewendet, um die Nukleaseaktivität von drei kommerziell erhältlichen Nukleasen unter nicht optimierten Bedingungen zu bewerten, die aus Zell- und Kulturmedien gewonnene Verunreinigungen enthielten. Es wurde festgestellt, dass Enzym A nicht so aktiv ist wie die beiden anderen Enzyme, was zeigt, dass die Wahl der Nuklease die Auslesung des Dot-Blot-Assays signifikant beeinflussen kann.Diese Technik ist für die Quantifizierung von AAV-Vektoren einfach und hilfreich bei der Bewertung der Rolle von AAP bei der Förderung der Assemblierung von AAV-Kapsiden, die von verwandten und heterologen Serotypen abgeleitet sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem Tag durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, sobald die Assay-Proben in Zellkulturexperimenten gewonnen wurden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das richtige Flüssigkeitsvolumen sorgfältig zu pipettieren, um die quantitative Genauigkeit zu gewährleisten.Nach seiner Entwicklung hat die Anwendung des quantitativen Dot-Blot-Assays zur Untersuchung von AAP den Weg für Forscher auf dem Gebiet der AAV-Biologie geebnet, um den Mechanismus der AAV-Kapsidassemblierung besser zu verstehen. Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen, viralen Wirkstoffen, Phenol-Chloroform und radioaktiven Materialien äußerst gefährlich sein kann. Und die Verwendung von Laborkitteln, Handschuhen und Schutzbrillen ist erforderlich, um die Exposition zu begrenzen.Diese Materialien sollten nur in zugelassenen Bereichen gehandhabt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Dot-Blot-Proben für die AAV-Quantifizierung vorbereiten, Dot-Blot-Geräte einrichten, AAV-Titer bestimmen und das Verfahren auf das Studium der AAV-Biologie anwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Assays wie AAV-Vektortransduktionsassays in Kulturzellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. den funktionellen Titer des vektorisierten im Vergleich zum physikalischen Partikeltiter, der durch den Dot-Blot-Assay bestimmt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video demonstrieren wir einen kolorimetrischen In-vitro-Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von neutralisierenden Antikörpern gegen alkalische Phosphatase-exprimierende rekombinante Adeno-assoziierte Virus-Serotyp 6 (rAAV6)-Vektoren in Schafserumproben. Der Assay nutzt die Reaktion zwischen dem AAV, das für ein menschliches plazentares alkalisches Phosphatase-Gen kodiert, und seinem Substrat, um ein unlösliches violettes Produkt zu erzeugen.

Zellbasierter AAV-neutralisierender Antikörper-Assay: eine kolorimetrische Technik zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen spezifische Adeno-assoziierte Viren im Serum

In diesem Video beschreiben wir den Dot-Blot-Assay zur Quantifizierung eines viralen Genoms. Die Signalintensität steht in direktem Zusammenhang mit der Menge an viraler DNA in der Probe.

Dot-Blot-Assay zur Quantifizierung des viralen Genoms

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent &gt;1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Dieses Protokoll zeigt, wie die AAV-Transduktionseffizienz in der Netzhaut der Maus mittels digitaler Tröpfchen-PCR (dd-PCR) in Verbindung mit AAV-Produktion im kleinen Maßstab, intravitrealer Injektion, retinaler Bildgebung und retinaler genomischer DNA-Isolierung quantifiziert werden kann.

Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut

Ein umfassendes Laborprotokoll und ein Analyse-Workflow werden für einen schnellen, kostengünstigen und unkomplizierten kolorimetrischen zellbasierten Assay zur Erkennung neutralisierender Elemente gegen AAV6 beschrieben.

Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung guter Laborpraktiken bei der konformen Detektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in menschlichen Tränen durch digitale Polymerase-Tröpfchenkettenreaktion zur Unterstützung der klinischen Entwicklung von Gentherapievektoren vor.

Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Da sich das Gebiet der Gentherapie ständig weiterentwickelt, besteht ein wachsender Bedarf an innovativen Methoden, die diese Herausforderungen bewältigen können. Hier wird eine einzigartige Methode vorgestellt, die den Prozess der Generierung von hochreinen und hochreinen AAV-Vektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform rationalisiert und die Qualitätsstandards für In-vivo-Studien erfüllt.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Die genaue Quantifizierung von Vektorgenomkopien des Adeno-assoziierten Virus (AAV) ist von entscheidender Bedeutung, aber ein standardisiertes Protokoll muss noch etabliert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine validierte Methode zur Aufbereitung gereinigter AAV-Proben und zur Durchführung einer digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd_PCR), um den viralen Genomtiter zuverlässig zu quantifizieren.

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Die Leitersprosse Walking Aufgabe ist es, eine neue Prüfung zur qualifizierten Fuß beurteilen und zu messen sowohl Vorderbein und Hinterbein platzieren, Stepping, und inter-Schenkel Koordination.

Die Leitersprosse Walking-Aufgabe: Ein Scoring-System und seine praktische Anwendung.

Lernen Sie eine quantitative Dot-Blot-Methode zur AAV-Titration und zur funktionellen Bewertung von Assembly-aktivierenden Proteinen in HEK 293-Zellen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung von AAV-Kapsid-Assemblierung.

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine (Video) | JoVE Journal

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

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