Name: Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Dot-Blot-Methode zur AAV-Titration und zur funktionellen Bewertung von Assembly-aktivierenden Proteinen in HEK 293-Zellen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung von AAV-Kapsid-Assemblierung.

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Wir danken für die Bereitstellung von uns mit dem pEMBL-CMV-GFP-Plasmid Xiao Xiao an der University of North Carolina in Chapel Hill. Wir danken Christopher Cheng und Samuel J. Huang für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service (NIH R01 NS088399 und T32 EY232113) gewährt.

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<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
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<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li>
<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Bericht wird die Nützlichkeit des quantitativen Dot-Blot Assays AAV AAPs und ihre Rolle im Kapsid Montage studieren beschrieben. Erkenntnisse aus diesen Studien bieten detaillierte Einblicke in die angeborenen Unterschiede in den Prozess der AAV Kapsid Montage und die funktionale Rolle der AAPs zwischen verschiedenen Serotypen. In dieser Hinsicht der AAV VP3-AAP Kreuz-Ergänzung Dot blot Test ergab, dass die Schlange AAV VP3 eine strenge Abhängigkeit auf die Co Expression von seinen Verwandten AAP Kapsid Montage...

Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein kleines, unbehüllte, einzelsträngige DNA-Virus mit einem Genom von ca. 4,7 Kilobases (kb). Die AAV-Genom enthält offene Lesung Frames (ORFs) für die Rep und GAP Gene. Im Jahr 2010 wurde eine bislang nicht identifizierte Elementoptionen Protein kodiert, indem ein + 1 Rahmen verschoben ORF im AAV2 GAP gen von Sonntag Et Al. entdeckt und festgestellt, dass eine entscheidende Rolle bei der Montage des AAV2 Kapsid VP Monomer Proteine in einer viralen Kapsid1. Dieses neuartige Protein wurde Montage-aktivierende Protein (AAP) nach der Rolle benannt spielt es bei der Förderung von Kapsid Montage1.
ORFs für AAP schon identifizierten Bioinformatically in den Genomen von allen Parvoviren innerhalb der Gattung Dependoparvovirus, aber nicht in das Genom der Viren von verschiedenen Gattungen des Parvovirus Familie1,2. Funktionelle Studien dieses neuartigen Proteins konzentrierten sich zunächst auf der AAP vom Prototyp AAV2 (AAP2), die die wesentliche Rolle der AAP2 etabliert hat, bei der Ausrichtung unmontiert VP Proteine der Nukleolus für ihre Ansammlung und Bildung in vollem Umfang Capsids1,3,4montiert. Die Unfähigkeit der AAV2 Capsids zusammenzubauen in Ermangelung von AAP Ausdruck wurde unabhängig von mehreren Gruppen, einschließlich der unsrigen bestätigt1,2,3,4,5 . Nachfolgende Studien zur AAV Serotypen 1, 8 und 9 bestätigt die wichtige Rolle der AAPs im Kapsid Montage als VP3 Monomer Proteine AAV1, 8 und 9 waren nicht in der Lage, eine komplett montierte Kapsid bei fehlender Co Ausdruck von AAP2zu bilden.
Vor kurzem, durch Ansätze, die die Verwendung des quantitativen Dot blot Assays, untersuchten wir die Fähigkeit der AAV1, 12 VP3 Monomere zusammenzubauen in Capsids in der Abwesenheit von AAP Ausdruck und die Fähigkeit des AAP1 bis 12 Montage VP3 Monomere von zu fördern heterologen Serotypen. Diese Studie hat ergeben, dass AAV4, 5 und 11 VP3 Monomere können ohne AAP zusammenstellen. Darüber hinaus ergab, dass acht von zwölf AAP-Serotypen wir untersuchten (d.h.alle außer AAP4, 5, 11 und 12) angezeigt eine breite Fähigkeit, Kapsid Montage der heterologen AAV Serotyp Capsids, während AAP4, 5, 11 und 12 angezeigt unterstützen eine wesentlich begrenzten Möglichkeiten in dieser Hinsicht6. Diese vier Serotypen sind phylogenetisch weit entfernt von den anderen AAP Serotypen2,3. Darüber hinaus hat die Studie erhebliche Heterogenität in subzellulären Lokalisierungen von verschiedenen AAPs6aufgedeckt. Darüber hinaus die Studie hat vorgeschlagen, dass der enge Vereinigung von AAP mit montierten Capsids und Nukleolus, das Markenzeichen der AAV2 Kapsid Versammlung, nicht unbedingt zu anderen Serotypen, einschließlich AAV5, verlängert werden 8 und 9, die Nukleolus Ausschluss von anzeigen montierte Capsids6. Deshalb der Erkenntnissen aus der Studie bestimmten Serotyp AAP nicht breit anwendbar auf alle AAP Biologie. Solch rätselhafte Natur der AAP Biologie unterstreicht die Notwendigkeit, die Rolle und Funktion der einzelnen AAP von kanonischen und nicht-kanonischen AAV-Serotypen zu untersuchen.
Die biologische Rolle von AAP in Kapsid Baugruppe kann beurteilt werden, durch die Bestimmung, dass vollständig verpackt AAV Viruspartikel Titer in menschlichen embryonalen Niere (HEK) 293-Zellen, die am häufigsten verwendeten Zelllinie für AAV Vektor Produktion, mit oder ohne AAP Protein produziert Ausdruck. Die Standardmethoden für AAV Quantifizierung sind quantitative PCR (qPCR)-basierte Assays7,8 und quantitative Dot-Blot-basierte assays9. Andere Methoden zur AAV Viruspartikel Quantifizierung wie Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay10,11 oder optische Dichte Messung12 sind nicht ideal für Proben, die aus vielen verschiedenen AAV-Serotypen abgeleitet oder Proben mit Verunreinigungen (grobe Lysates oder Kultur, Medien), die oft für AAV Forschung verwendeten Proben kontaminiert. QPCR wird derzeit am häufigsten für AAV Quantifizierung verwendet; Allerdings ist es notwendig zu erkennen, mögliche Vorbehalte des qPCR basierende Assays, als der Test Systemfehler und bedeutende Titer Variationen13,14führen können. PCR-basierte Testsysteme betroffen sind eine Reihe von potenziell Störfaktoren, wie das Vorhandensein von kovalent geschlossenen terminal Haarnadeln in PCR-Vorlagen, die Verstärkung13hemmen. Sogar eine erfahrene Person Potenzial einführen kann Störfaktoren in einer qPCR-basierten Test unwissentlich13. Im Gegensatz dazu sind quantitative Dot-Blot Assays eine klassische Molekularbiologie-Technik, die beinhaltet keine Genom Verstärkung und verwendet ein viel einfacheres Prinzip mit einem minimalen Risiko von Fehlern im Vergleich zu qPCR basierende Assays. Die Methode ist weniger technisch anspruchsvoll; die Untersuchungsergebnisse sind daher auch von unerfahrenen Personen einigermaßen reproduzierbar.
In diesem Bericht beschreiben wir die methodischen Details eines quantitativen Dot Blot Assays wir routinemäßig für AAV Vektor Quantifizierung verwenden und geben Sie ein Beispiel von, wie den Test zur Untersuchung der Montage-Förderung der Rolle von AAPs gemeinsam anwenden Serotypen (AAV5 und AAV9) und eine zuvor fußgelenkes AAP von Snake AAV14. In der Natur AAV VP und AAP Proteine werden in der GUS von einem einzigen Gen (d.h., VP-AAP Cis-Ergänzung), während in der hier beschriebenen Test ausgedrückt, VP und AAP Proteine liefern wir in Trans aus zwei separaten Plasmide (d.h., VP-AAP Trans-Ergänzung). Da jede VP oder AAP Protein aus verschiedenen Serotypen von jeder unabhängige Plasmid ausgedrückt werden kann, wird es möglich, Heterologe VP-AAP-Kombinationen für Kapsid Assembly (d.h. VP-AAP Kreuz-Ergänzung) zu testen. Kurz, drückt AAV VP3 aus verschiedenen Serotypen in HEK 293 Zellen von Plasmid DNA Transfektion, ein AAV-Vektor-Genom in das Vorhandensein oder Fehlen des cognate Serotyps AAP oder in Anwesenheit einer heterologen Serotyp AAP zu verpacken. Nach der Produktion unterliegen Nährmedien und Zelle Lysates ein Dot Blot Assay, das virale Genom innerhalb der Kapsid Shell zu quantifizieren. Der erste Schritt des Dot-Blot Assays ist zur Behandlung von Proben mit einer Nuklease kontaminierenden Plasmid-DNA und unverpackten AAV Genome in Proben zu entfernen. Andernfalls würde die Hintergrund-Signale insbesondere erhöhen, wenn ungereinigten Proben analysiert werden. Darauf folgt dann durch eine Protease-Behandlung zu brechen viralen Capsids und Nuklease-resistente viraler Genome in Beispiellösungen freisetzen. Nächste, virale Genome sind denaturiert, getupft auf eine Membran und hybridisiert mit eine virale Genom-spezifische DNA-Sonde für die Quantifizierung. In der Beispiel-Test hier berichtet zeigen wir Ihnen, dass Snake AAV VP3 Schlange AAP Kapsid Montage und Schlange AAP fördert nicht die Montage des AAV9 Capsids im Gegensatz zu vielen der AAPs abgeleitet von AAP-abhängige Serotypen, die auch die Montage von fördern können Heterologe Serotyp Capsids. Zu guter Letzt berichten wir eine wichtige Einschränkung, qPCR oder Dot-Blot-basierte AAV Quantifizierung Tests, dass die Wahl der Nuklease die Untersuchungsergebnisse erheblich beeinträchtigt.

<table><tbody><tr><td>Benzonase</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td> im <td>Haupttext als Serratia marcescen endonuclease bezeichnet.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>im Haupttext als DNase I Enzym A bezeichnet.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>im Haupttext als DNase I Enzym B bezeichnet.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>wird im Haupttext als DNase I Enzym C bezeichnet.</td></tr><tr><td>1,5 mL Attached O-Ring Screw Cap Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>AAV-293-Zellen</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>HEK-293-Zelllinie, die für die Verpackung von AAV-Virionen optimiert ist.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0,5 M EDTA-Lösung</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Buffer</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot-Gerät</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>DNA Extractor Kit</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>Dies wird für quantitative Dot-Blots auf gereinigten Viren verwendet. Wir verwenden nur ein halbes Volumen aller Reagenzien in jedem Schritt, der für das Protokollschema 2 in dem vom Hersteller bereitgestellten Handbuch empfohlen wird.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-hoher Glukosegehalt (4,5 g/L)Lonza</td><td></td> <td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>bezeichnet als Polysaccharose 400.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Hering Spermien DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid Hexahydrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini Quick Spin DNA-Säulen</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vektor</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimaging-Belichtungskassette</td><td>GE Gesundheitswesen Life Sciences</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimaging-Bildschirme</td><td>GE Gesundheitswesen Biowissenschaften</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Maxi-Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA-Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Random Primer Labeling Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Forward (N25 Nukleotide aus dem 4. Nukleotid im AAP ORF, RE1 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Reverse (N25 sind die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF, RE2 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Forward (N25 die ersten 25 Nukleotide des VP3 ORF, RE1 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Reverse (N25 sind die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF, RE2 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Lachsspermien DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>serologische Pipetten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat Tribasisches Dihydrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur Behandelt 6-Well-Platten-Corning</td><td></td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Es wird der optimale Vernetzungsmodus verwendet, der eine UV-Energiedosis von 120 mJ/cm2.</td></tr><tr><td>Zeta-Sondenmembran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

eine quantitative dot blot assay für aav titration und seine verwendung für funktionale bewertung von adeno-assoziierten virus assembly-aktivierende proteine

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Während Adeno-assoziierte Virus (AAV) als eine attraktive Vektor für die Gentherapie weithin anerkannt ist, dient es auch als Modell für das Verständnis der Biologie Virus Virus. In letzterer Hinsicht hat die jüngste Entdeckung eines nichtbauliche AAV-Proteins, Montage-aktivierende Protein (AAP), bezeichnet ein neues Licht auf die Vorgänge bei Einbau der viralen Kapsid VP Proteine in einem Kapsid vergossen. Obwohl viele AAV Serotypen AAP für die Montage benötigen, wir haben vor kurzem berichtet, dass AAV4, 5, und 11 sind Ausnahmen von dieser Regel. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass AAPs und montierten Capsids der verschiedenen Serotypen zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu lokalisieren. Diese unerwartete Heterogenität in den biologischen Eigenschaften und Funktionsrollen der AAPs unter verschiedenen AAV Serotypen unterstreicht die Bedeutung der Studien über AAPs aus verschiedenen Serotypen abgeleitet. Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für AAV Quantifizierung und seine Anwendung auf AAP Abhängigkeit und Serotyp Spezifität in Kapsid Baugruppe zu beurteilen. Um das Dienstprogramm des Dot-Blot Assays zu demonstrieren, brachen wir um zu charakterisieren, Kapsid Montage- und AAP Abhängigkeit der Schlange AAV, ein zuvor fußgelenkes Reptil AAV, sowie AAV5 und AAV9, die bisher gezeigt wurden, AAP-unabhängige und AAP-abhängige Serotypen, beziehungsweise. Der Test ergab, dass die Schlange AAV Kapsid Montage erfordert Schlange AAP und kann nicht durch AAPs aus AAV5 und AAV9 gefördert werden. Der Test zeigte auch, dass im Gegensatz zu vielen gemeinsamen Serotyp AAPs, die Förderung der heterologen Kapsid Montage durch Kreuz-Ergänzung, Schlange AAP Versammlung des AAV9 Capsids nicht fördert. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Wahl der Nuklease erheblich das Auslesen des Dot-Blot Assays beeinträchtigt, und somit eine optimale Enzym Auswahl entscheidend für erfolgreiche Beurteilung der AAV-Titer ist.

Ein repräsentatives Ergebnis der quantitativen Dot Flecken für die Quantifizierung der gereinigten AAV Vektor Bestände in großem Maßstab produziert ist in Abbildung 1dargestellt. Mit dieser Dot-Blot Assay war der Titer einer doppelsträngigen AAV2G9-CMV-GFP Vektor Aktie ermittelt. Der Vektor wurde durch zwei Runden der Cäsiumchlorid (CsCl) gereinigt-Dichtegradienten Ultrazentrifugation durch Dialyse als zuvor beschriebenen20gefolgt. In ...

Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für die Quantifizierung der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Titer und deren Anwendung zur Untersuchung der Rolle von Montage-aktivierende Proteine (AAPs), eine neuartige Klasse von nichttragenden virale Proteine in allen AAV Serotypen, bei der Förderung der Versammlung des Capsids verwandt und heterologen AAV-Serotypen abgeleitet.

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Mit dieser Methode können sowohl gereinigte als auch ungereinigte AV-Vaktiter bestimmt und die Fähigkeit des AAV-AAP beurteilt werden, die Assemblierung von verwandten und heterologen AV-Serotyp-Kapsis zu fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine unkomplizierte, kostengünstige Methode handelt, die die Nachteile anderer AAV-Titrationsmethoden vermeidet. Obwohl diese Methode häufig für die Quantifizierung von AAV-Vektoren verwendet wird, kann sie auch angewendet werden, um verschiedene grundlegende Fragen zur AAV-Biologie zu beantworten, wie in diesem Protokoll gezeigt.Am Tag Null, nach der Kultivierung von HEK 293-Zellen auf 90 % Konfluenz, bereiten Sie das Transfektionsreagenz vor, indem Sie die Plasmide in 96 Mikrolitern PBS ohne Kalzium oder Magnesium in sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Wie in dieser Tabelle angegeben, beträgt die Gesamtmenge an DNA zwei Mikrogramm pro Vertiefung. Fügen Sie dem PBS-Plasmid-DNA-Mix vier Mikroliter PEI-Lösung hinzu.Das endgültige Volumen beträgt ca. 100 Mikroliter oder 5 % Volumen des Nährmediums. Wirbeln Sie die Röhrchen kurz vor und inkubieren Sie das DNA-PEI-Gemisch 15 Minuten lang bei

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Forschung

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Biology

Biologie

In diesem Video demonstrieren wir einen kolorimetrischen In-vitro-Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von neutralisierenden Antikörpern gegen alkalische Phosphatase-exprimierende rekombinante Adeno-assoziierte Virus-Serotyp 6 (rAAV6)-Vektoren in Schafserumproben. Der Assay nutzt die Reaktion zwischen dem AAV, das für ein menschliches plazentares alkalisches Phosphatase-Gen kodiert, und seinem Substrat, um ein unlösliches violettes Produkt zu erzeugen.

Zellbasierter AAV-neutralisierender Antikörper-Assay: eine kolorimetrische Technik zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen spezifische Adeno-assoziierte Viren im Serum

In diesem Video beschreiben wir den Dot-Blot-Assay zur Quantifizierung eines viralen Genoms. Die Signalintensität steht in direktem Zusammenhang mit der Menge an viraler DNA in der Probe.

Dot-Blot-Assay zur Quantifizierung des viralen Genoms

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent &gt;1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Dieses Protokoll zeigt, wie die AAV-Transduktionseffizienz in der Netzhaut der Maus mittels digitaler Tröpfchen-PCR (dd-PCR) in Verbindung mit AAV-Produktion im kleinen Maßstab, intravitrealer Injektion, retinaler Bildgebung und retinaler genomischer DNA-Isolierung quantifiziert werden kann.

Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut

Ein umfassendes Laborprotokoll und ein Analyse-Workflow werden für einen schnellen, kostengünstigen und unkomplizierten kolorimetrischen zellbasierten Assay zur Erkennung neutralisierender Elemente gegen AAV6 beschrieben.

Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung guter Laborpraktiken bei der konformen Detektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in menschlichen Tränen durch digitale Polymerase-Tröpfchenkettenreaktion zur Unterstützung der klinischen Entwicklung von Gentherapievektoren vor.

Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Da sich das Gebiet der Gentherapie ständig weiterentwickelt, besteht ein wachsender Bedarf an innovativen Methoden, die diese Herausforderungen bewältigen können. Hier wird eine einzigartige Methode vorgestellt, die den Prozess der Generierung von hochreinen und hochreinen AAV-Vektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform rationalisiert und die Qualitätsstandards für In-vivo-Studien erfüllt.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Die genaue Quantifizierung von Vektorgenomkopien des Adeno-assoziierten Virus (AAV) ist von entscheidender Bedeutung, aber ein standardisiertes Protokoll muss noch etabliert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine validierte Methode zur Aufbereitung gereinigter AAV-Proben und zur Durchführung einer digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd_PCR), um den viralen Genomtiter zuverlässig zu quantifizieren.

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Die Leitersprosse Walking Aufgabe ist es, eine neue Prüfung zur qualifizierten Fuß beurteilen und zu messen sowohl Vorderbein und Hinterbein platzieren, Stepping, und inter-Schenkel Koordination.

Die Leitersprosse Walking-Aufgabe: Ein Scoring-System und seine praktische Anwendung.

Lernen Sie eine quantitative Dot-Blot-Methode zur AAV-Titration und zur funktionellen Bewertung von Assembly-aktivierenden Proteinen in HEK 293-Zellen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung von AAV-Kapsid-Assemblierung.

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine (Video) | JoVE Journal

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

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