Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

Mit dieser Methode können sowohl gereinigte als auch ungereinigte AV-Vaktiter bestimmt und die Fähigkeit des AAV-AAP beurteilt werden, die Assemblierung von verwandten und heterologen AV-Serotyp-Kapsis zu fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine unkomplizierte, kostengünstige Methode handelt, die die Nachteile anderer AAV-Titrationsmethoden vermeidet. Obwohl diese Methode häufig für die Quantifizierung von AAV-Vektoren verwendet wird, kann sie auch angewendet werden, um verschiedene grundlegende Fragen zur AAV-Biologie zu beantworten, wie in diesem Protokoll gezeigt

Am Tag Null, nach der Kultivierung von HEK 293-Zellen auf 90 % Konfluenz, bereiten Sie das Transfektionsreagenz vor, indem Sie die Plasmide in 96 Mikrolitern PBS ohne Kalzium oder Magnesium in sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Wie in dieser Tabelle angegeben, beträgt die Gesamtmenge an DNA zwei Mikrogramm pro Vertiefung. Fügen Sie dem PBS-Plasmid-DNA-Mix vier Mikroliter PEI-Lösung hinzu.

Das endgültige Volumen beträgt ca. 100 Mikroliter oder 5 % Volumen des Nährmediums. Wirbeln Sie die Röhrchen kurz vor und inkubieren Sie das DNA-PEI-Gemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Röhrchen in einer Mikrozentrifuge kurz drehen, um die Flüssigkeit am Boden aufzufangen.

Und geben Sie die DNA-PEI-Mischung tropfenweise in das Kulturmedium in jeder Vertiefung der HEK 293-Kulturplatte. Bewegen Sie dann die Platten vorsichtig und stellen Sie sie wieder in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2. Die Transfektion der HEK 293-Zelle ist eine wichtige Komponente dieses Protokolls für die Produktion von Viren mit hohem Titer.

Es sollten gesunde Zellen mit niedriger Passagezahl verwendet werden, und es sollte darauf geachtet werden, dass die Monoschicht der Zellen nicht gestört wird. Beobachten Sie an den Tagen eins und zwei unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop Zellen, die mit dem PCMVGFP-Plasmid transfiziert wurden, um die Transfektionseffizienz zu beurteilen. Pipettieren Sie am fünften Tag die Zellen und das virushaltige Medium auf und ab oder verwenden Sie einen Zellschaber, um alle Zellen abzukratzen.

Übertragen Sie dann die Suspension in konische 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Um die Viruspartikel zurückzugewinnen, tauen Sie die gefrorenen Röhrchen schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.

Wirbeln Sie dann die Röhren eine Minute lang kräftig ein, um die Rückgewinnung von AAV aus den Zellen zu maximieren. Pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3.700 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann werden 200 Mikroliter des Überstands aus jedem Röhrchen in markierte Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen für den Dot-Blot-Assay überführt.

Um die Proben mit Serratia marcescens Endonukompaktase zu behandeln, bereiten Sie die Reagenzien von Mischung A und Mischung B vor. Geben Sie 10 Mikroliter jedes Reagenzes in jedes Probenröhrchen. Wirbeln Sie die Proben fünf Sekunden lang und drehen Sie sie kurz, um die Flüssigkeit auf dem Boden der Röhrchen zu sammeln.

Dann inkubieren Sie die Röhrchen mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie nach kurzem Schleudern der Proben eine Proteinase-K-Behandlung durch, indem Sie das Reagenz der Mischung C vorbereiten und 180 Mikroliter in jedes Röhrchen geben. Nach dem Vortexen und erneuten kurzen Schleudern der Röhrchen wird sie eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius inkubiert.

Sobald die Proben wieder Raumtemperatur erreicht haben, fügen Sie 200 Mikroliter Phenol-Chloroform hinzu und wirbeln Sie die Röhrchen eine Minute lang durch. Anschließend werden die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 16, 100 G und Raumtemperatur mindestens fünf Minuten lang geschleudert. Übertragen Sie 320 Mikroliter der wässrigen Schicht oder 80 % des wässrigen Flüssigkeitsvolumens in ein neues Standard-Mikrozentrifugenröhrchen.

Dieser Transferschritt ist von entscheidender Bedeutung, da das gleiche Volumen aus der Probe entnommen werden muss, um die Genauigkeit für die AAV-Quantifizierung zu erhalten. Es sollte darauf geachtet werden, dass die organische Phase beim Entfernen der wässrigen Schicht vermieden wird. Bereiten Sie das Reagenz der Mischung D vor und geben Sie 833 Mikroliter in jedes Probenröhrchen.

Nachdem Sie die Röhrchen vortexiert haben, inkubieren Sie sie mindestens 20 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren den Überstand abgießen und die Röhrchen einmal auf einem sauberen Papiertuch abtupfen. Pipettieren Sie etwa 500 Mikroliter 70%iges Ethanol in jedes Röhrchen und wirbeln Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang durch.

Nachdem Sie die Proben erneut geschleudert haben, gießen Sie den Überstand ab und tupfen Sie die Röhrchen einmal auf einem sauberen Papiertuch ab. Trocknen Sie die Pellets dann bei 65 Grad Celsius, bevor Sie sie in TE-Puffer resuspendieren. Um den Dot-Blot-Assay durchzuführen, bereiten Sie Plasmid-DNA-Standards vor, indem Sie AAV-vektorisierte Genomplasmid-DNA auf 10 Nanogramm pro Mikroliter in Wasser oder Tris-HCL-Puffer verdünnen.

Übertragen Sie ein 25-Mikroliter-Aliquot der verdünnten Plasmid-DNA in ein frisches Röhrchen und linearisieren Sie es mit einem geeigneten Restriktionsenzym in einem Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern für eine Stunde. Geben Sie 450 Mikroliter Wasser oder TE in das Röhrchen mit dem verdauten Plasmid-DNA-Standard und mischen Sie es gründlich. Übertragen Sie dann 70 Mikroliter dieser Mischung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1.330 Mikrolitern Wasser oder TE, um einen verdünnten Plasmidstandard herzustellen.

Um das Dot-Blot-Gerät einzurichten, schneiden Sie die Blotting-Membran mit einer Schere auf eine für die Anzahl der Proben und Standards geeignete Größe zu. Weichen Sie die Membran 10 Minuten lang mit Wasser ein, bevor Sie sie auf das Dot-Blot-Gerät legen. Decken Sie dann die ungenutzten Vertiefungen ab.

Geben Sie Wasser in die Brunnen, in die die Proben geladen werden. Legen Sie ein Vakuum an, ziehen Sie das Wasser durch die Brunnen, prüfen Sie, ob Fehler vorhanden sind, und ziehen Sie dann die Schrauben wieder fest. Wiederholen Sie den Test, falls erforderlich.

Tragen Sie 400 Mikroliter jedes verdünnten Plasmid-DNA-Standards auf jede Vertiefung auf und führen Sie vier Spuren mit Standardverdünnungen durch. Verwenden Sie zwei separate Aliquots des Standard-Digests, und laden Sie jedes in doppelter Ausführung. Tragen Sie dann 200 Mikroliter pro Vertiefung jeder viralen DNA-Probe auf.

Wenden Sie ein sanftes Vakuum an, um die DNA-Lösungen durch die Vertiefungen zu ziehen. Sobald alle Vertiefungen geleert sind, lassen Sie das Vakuum ab, indem Sie das Dreiwegeventil einstellen. Geben Sie 400 Mikroliter einer X alkalischen Lösung in jede Vertiefung

Warten Sie dann fünf Minuten, bevor Sie das Vakuum erneut anwenden, um die Vertiefungen zu leeren. Wenden Sie das Vakuum erneut an und zerlegen Sie das Dot-Blot-Gerät. Entfernen Sie dann die Membran und spülen Sie sie mit zwei X SSC ab.

Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben auf ein sauberes Papiertuch, um den überschüssigen Puffer zu entfernen. Verwenden Sie einen geeigneten UV-Vernetzer, um die geblotte DNA mit der Membran zu vernetzen. Die Membran ist nun bereit für die Hybridisierung.

Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche. Spülen Sie die Membran mit fünf bis 10 Millilitern vorgewärmtem Hybridisierungspuffer und verwerfen Sie den Puffer. Fügen Sie dann 10 Milliliter vorgewärmten Hybridisierungspuffer hinzu und stellen Sie die Flasche in einen rotierenden Hybridisierungsofen, der auf 65 Grad Celsius eingestellt ist.

Drehen Sie die Flasche mindestens fünf Minuten lang. Geben Sie schnell die denaturierte Spermien-DNA und die radioaktive Sonde in den Hybridisierungspuffer in der Flasche und schütteln Sie ihn 10 Sekunden lang, um ihn zu mischen. Stellen Sie die Flasche wieder in den 65 Grad Celsius heißen Ofen und inkubieren Sie sie mindestens vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius.

Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, stoppen Sie die Rotation. Entfernen Sie die Hybridisierungsflasche und gießen Sie dann die radioaktive Sondenlösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit einem auslaufsicheren Stopfenverschluss. Um die Membran zu waschen, geben Sie 20 bis 30 Mikroliter vorgewärmten Waschpuffer in die Hybridisierungsflasche und drehen Sie sie fünf Minuten lang.

Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen die Membran aus der Hybridisierungsflasche und entfernen Sie mit Küchenpapier den überschüssigen Puffer von der Membran. Legen Sie dann die Membran in einen durchsichtigen Papierhalter aus Kunststoff.

Überprüfen Sie mit einem Geigerzähler die radioaktiven Signale auf der Membran. Nachdem Sie den gelöschten Phosphorbildschirm der Membran ausgesetzt haben, scannen Sie den Bildschirm mit einem Phosphorbild-Scansystem und erhalten Sie die Daten zur Signalintensität jedes Punkts. Führen Sie eine Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.

Dieser quantitative Dot-Blot für die AAV-2G9-Vektortitration besteht aus zwei Sätzen von Standards und drei verschiedenen Mengen eines AAV-Vektorpräparats, einschließlich 0,3, 0,1 und 0,03 Mikroliter in doppelter Ausführung. Die Mengen, die auf dem Blot untersucht werden sollen, werden empirisch oder auf Basis eines vorläufigen Assays bestimmt. Es wurde durch Interpolation bestimmt, dass 0,3, 0,1 und 0,03 Mikroliter Aliquots des AAV-2G9-Vektors im Durchschnitt einen Titer von 5,16, 0,27 Nanogramm äquivalenten Mikrolitern aufwiesen.

Alle möglichen verwandten und heterologen Serotyp-Kombinationen von VP3 cas-pid und AAP-Proteinen aus AAV5, AAV9 und Schlangen-AAV wurden mittels eines quantitativen Dot-Blot-Assays auf Kapsidassemblierung untersucht. Die Ergebnisse dieses Diagramms zeigen, dass AAV5 VP3 assembliert, unabhängig davon, ob AAP in trans bereitgestellt wurde. Darüber hinaus können AAP5 und AAP9 die Assemblierung von AAV9 VP3-Kapsidn fördern, obwohl AAP5 weniger effektiv funktioniert als AAP9.

Weder AAP5 noch AAP9 zeigen eine Assemblierung, die die Aktivität auf Schlangen-AAV VP3 fördert, und Schlangen-AAP fördert nur die Assemblierung von Schlangen-AAV VP3. Eine Dot-Blot-Analyse wurde angewendet, um die Nukleaseaktivität von drei kommerziell erhältlichen Nukleasen unter nicht optimierten Bedingungen zu bewerten, die aus Zell- und Kulturmedien gewonnene Verunreinigungen enthielten. Es wurde festgestellt, dass Enzym A nicht so aktiv ist wie die beiden anderen Enzyme, was zeigt, dass die Wahl der Nuklease die Auslesung des Dot-Blot-Assays signifikant beeinflussen kann.

Diese Technik ist für die Quantifizierung von AAV-Vektoren einfach und hilfreich bei der Bewertung der Rolle von AAP bei der Förderung der Assemblierung von AAV-Kapsiden, die von verwandten und heterologen Serotypen abgeleitet sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem Tag durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, sobald die Assay-Proben in Zellkulturexperimenten gewonnen wurden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das richtige Flüssigkeitsvolumen sorgfältig zu pipettieren, um die quantitative Genauigkeit zu gewährleisten.

Nach seiner Entwicklung hat die Anwendung des quantitativen Dot-Blot-Assays zur Untersuchung von AAP den Weg für Forscher auf dem Gebiet der AAV-Biologie geebnet, um den Mechanismus der AAV-Kapsidassemblierung besser zu verstehen. Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen, viralen Wirkstoffen, Phenol-Chloroform und radioaktiven Materialien äußerst gefährlich sein kann. Und die Verwendung von Laborkitteln, Handschuhen und Schutzbrillen ist erforderlich, um die Exposition zu begrenzen.

Diese Materialien sollten nur in zugelassenen Bereichen gehandhabt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Dot-Blot-Proben für die AAV-Quantifizierung vorbereiten, Dot-Blot-Geräte einrichten, AAV-Titer bestimmen und das Verfahren auf das Studium der AAV-Biologie anwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Assays wie AAV-Vektortransduktionsassays in Kulturzellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. den funktionellen Titer des vektorisierten im Vergleich zum physikalischen Partikeltiter, der durch den Dot-Blot-Assay bestimmt wird.