Name: Verhaltens- und reproduktive Langzeitfolgen der embryonalen Exposition gegenüber niedrig dosierte Giftstoffe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie embryonale Exposition gegenüber Bisphenol A Langzeitfolgen für Fruchtbarkeit und Verhalten bei C. elegans verursacht. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung toxischer Entwicklungseffekte.

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Unterstützung durch NSF (EPSCoR EPS-0814251) und NIH (1P20GM103653-01A1) MKT und HSD, Delaware State University institutionelle Studienförderung MDM (Titel III HBGI) und KRS (NIH-INBRE) dankbar anerkannt. Dank der C. Elegans genetischen Zentrum (unterstützt von NIH Büro der Forschung Infrastruktur Programme P40 OD010110) für C. Elegans Wildtyp N2 belasten.

Protokolle, die unten gegeben um zu testen, die Auswirkungen von BPA-Exposition in der frühen Embryogenese standardisiert wurden und für die Verwendung mit BPS, BPF oder andere endokrine Disruptoren und Giftstoffe an C. Elegans Embryos geändert werden können.
1. materielle Setup
<ol><li>Bereiten Sie 500 mL Nematoden Wachstum Medien (NGM)18 Medien durch 1,5 g NaCl, 1,25 g Pepton und 8,5 g Agar in 500 mL Wasser auflösen. Nach dem Autoklavieren (121 ° C, 15 PSI, 20 min.) fügen Sie 0,5 mL des Cholesterins (5 mg/mL in Ethanol) hinzu, 0,5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL 1 M CaCl2 und 12,5 mL 1 M Phosphatpuffer Kalium, pH-Wert 7,4 (108,3 g KH2PO4 35,6 g K2HPO4, 1 L Wasser).</li>
	<li>Bereiten Sie Hypochlorit-Lösung durch das Mischen von 25 mL 1 N KOH, 4 mL Bleichmittel und 71 mL Wasser vor. Machen Sie diese Lösung frisch.</li>
	<li>Bereiten Sie M9 Puffer durch Mischen, 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 5 mL 1 M MgSO4und Wasser bis 1 L.</li>
	<li>Bereiten Sie durch Mischen von 129 mL 0,02 M K2HPO4, 871 mL KH2PO4und 5,85 g NaCl S Puffer18 vor .</li>
	<li>M9 und S Puffer durch Autoklavieren zu sterilisieren.</li>
	<li>Wachsen einer übernachten-Kultur von Escherichia coli (OP 50-Stamm) in 20 mL von Luria Brühe (LB).</li>
	<li>Lösen Sie BPA in 10 % Ethanol zu einer Stammlösung 1 mM auf. Spätere Verdünnungen von 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM und 10 µM in S Puffer zu machen. Hinweis: Verdünnung im wässrigen S Puffer reduziert die Konzentration von Ethanol; zum Beispiel bei der höchsten BPA-Konzentration in diesem Protokoll (10 µM) beschrieben, ist die Konzentration von Ethanol 0,1 % V/V.</li>
</ol>2. C. Elegans Culturing und Synchronisation
<ol><li>Die NGM-Medien in 100 mm Platten (ca. 25 mL/Platte) gießen und erstarren lassen. Sobald verfestigt, Samen der Platten durch die Verbreitung von 150 µL des E. Coli OP50 aus der Flüssigkultur über Nacht gewachsen. Über Nacht inkubieren Sie Platten bei 37 ° C.</li>
	<li>Am nächsten Tag transfer N2 Würmer auf die neuen Platten mit chunking eine ungefähre Platte von 1 cm im Quadrat. Können Sie Würmer wachsen für 3 Tage bei 20 ° C, bis die Platte mit gut genährte reife Erwachsene mit sichtbaren Embryonen aufgefüllt wird.</li>
	<li>Um zu synchronisieren, waschen Sie jede Platte pipettieren bis 5 mL der M9 Puffer auf den Teller legen. Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine sterile 15 mL konische Zentrifugenröhrchen. Hinweis: Synchronisierung erfolgt zum Erwachsenen Würmer töten und sammeln von Embryonen, die der gleichen Stufe relativ sind.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g für 4 min bei Raumtemperatur um eine lose Pellets der Erwachsenen Würmer zu erhalten.</li>
	<li>Mit einer 10 mL-Pipette, entfernen Sie vorsichtig den Überstand um das Pellet intakt zu lassen. 5 mL der Hypochlorit-Lösung hinzufügen und vorsichtig mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 3.000 X g bei Raumtemperatur für 4 Minuten.</li>
	<li>Überstand mit einer 10 mL-Pipette entfernen und waschen mit 7 mL M9 Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.</li>
</ol>(3) freilegen Würmer BPA
<ol><li>Aussetzen Sie nach der letzten Wäsche aus Schritt 2.7 über etwa 100 µL von Eiern mit M9 Puffer. Übertragen Sie etwa 50 µL von Eiern auf 2 mL Microfuge Röhren bereits die entsprechende Konzentration von die BPA in S-Puffer verdünnt. Passen Sie die Höhe der S-Puffer, um die korrekte Endkonzentration von BPA (0,0 µM, 0,1 µM 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM und 10 µM) pro Röhre zu gewährleisten. Tabelle 1 zeigt eine Möglichkeit, diese Verdünnungen zu machen.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Für die endgültige BPA-Konzentration</td>
			<td>BPA auf Lager (100 μM)</td>
			<td>S-Puffer</td>
			<td>Synchronisierte Worms</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Lager BPA, S Puffer und synchronisierte Würmer verwendet, um die gewünschten Konzentrationen verwendet für unsere Studie zu erreichen.
<ol start="2"><li>Rohre auf einem Boston-Shaker und 4 h bei 20° C, 25 u/min für einen Dreh Shaker oder 25 kippt/min für einen rockigen Shaker schütteln.</li>
	<li>Nach 4 h Rohre in Schlauchhalter und Würmer zu begleichen.</li>
	<li>Überstand verwerfen und Würmer auf gesetzte Platten (NGM Platten mit OP50 E. Coli) übertragen. Machen Sie die Flüssigkultur OP50 E. Coli zu, wie in 1,5 und Samen Sie die Platten wie in 2.1 angegeben.</li>
	<li>Lassen Sie die Würmer wachsen für 60 h bei 20 ° C. Platten täglich auf Verschmutzung zu prüfen. Kontaminierte NGM-Platten sind in der Regel verfärbt und begleitet von einzelnen Kolonien. Überprüfen Sie die Würmer unter dem Mikroskop für Überfüllung. Ein Mangel an OP50 E. Coli Rasen und konzentrierte Würmer in kleinen Flecken bedeuten Überbelegung.</li>
</ol>4. vordere Touch Gewöhnung Assay
<ol><li>Transfer ca. 10 synchronisierte jungen Erwachsenen Würmer zu neuen ungesetzte NGM-Platten mit einem Feuer-sterilisiert 30 G Platin Draht zu wählen. Würmer für 5 min, sie können ungestört lassen Zeit zum akklimatisieren auf die neue Platte.</li>
	<li>Verwenden Sie für die Gewöhnung Antwort eine Augenbraue Haare am Ende von einem Holzstäbchen oder Zahnstocher und sterilisieren durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol. Mit einem sauberen fusselfreien Tuch wischen Sie ab und warten Sie 1 min für Ethanol aus verdunsten. Sanft berühren den Wurm auf dem Kopf (anterior der pharyngealen Birne) mit den Augenbrauen. Wiederholen Sie den Schliff, so dass 10 s zwischen berührt damit den Wurm zu erholen können.</li>
	<li>Weiter zu berühren (so dass interstimulus Intervallen von 10 s), bis sich der Wurm nicht mehr nach hinten bewegt. Zu diesem Zeitpunkt hat der Wurm an den Reiz gewöhnt. Notieren Sie die Anzahl der Berührungen, die notwendig für den Wurm zu gewöhnen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Differenz zwischen der mittleren Gewöhnung der behandelten und unbehandelten Kontrollen mit One-Way ANOVA gefolgt von Tukey post-hoc-Test.</li>
</ol>(5) Wurm Fruchtbarkeit Assay
<ol><li>Übertragen Sie einzelne L3 Würmer auf einen frisch und ausgesät Teller mit einem Platin-Pick. Stellen Sie sicher, dass nur ein Wurm pro Platte gelegt wird. Hinweis: nach dem Larvenstadium L3 Würmer entwickeln in L4 Larvenstadium und im Erwachsenenalter. Sammeln sie früh ist bequem, sie sind groß genug für die Übertragung einzelner Tiere gleichzeitig sicherzustellen, dass sie nicht bereits eine Eiablage haben die sonst bei der Zählung entgehen lassen würde.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der Eiablage alle 12 – 24 h. Nach Auszählung, übertragen des übergeordneten Wurms auf eine neue Platte. Wiederholen Sie, bis der Wurm stoppt der Eiablage, in der Regel nach 5 Tagen bei 20 ° c inkubiert Hinweis: im Durchschnitt kann ein Wildtyp-Wurm bis zu 300 Eiern legen; daher verhindert Übertragung von den Eltern auf eine neue Platte täglich Überbelegung.</li>
	<li>Analysieren Sie die Differenz zwischen der durchschnittlichen Anzahl der Eiablage durch die behandelten und unbehandelten Kontrollen mit One-Way ANOVA gefolgt von Tukey post-hoc-Test.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie nichts preisgeben.

Phasen des schnellen Wachstums und Entwicklung z. B. Embryogenese sind besonders anfällig für die nachteiligen Auswirkungen der verschiedenen endokrinen Störung Verbindungen, einschließlich BPA. Wir bieten detaillierte Protokolle für die Untersuchung der Auswirkungen der Exposition gegenüber BPA oder anderen Schadstoffen im C. Elegans Wirbellosen-Modell ermöglicht bequeme Titration der unterschiedlichsten Konzentrationen zu beurteilen, seine Wirkung auf den Embryo Lebensfähigkeit (Abbildung 2) . Follow-up Verhaltensexperimente auf die Überlebenden Erwachsenen, die aus Embryonen entwickeln, dass wurden ausgesetzt niedrige Dosen von BPA ermöglichen langfristige Auswirkungen auf die neuronale Funktion (Abbildung 3) prüfen. Die zentrale Idee dieses Papiers soll detaillierte Protokolle für das Verfügbarmachen von Embryonen zu verschiedenen Schadstoffen während der frühen Embryogenese Periode in C. Elegans -Modell; die erste 4 h Fenster der Embryonalentwicklung seine 11,5 Stunden (bei 20 ° C) entspricht der Verbreitung Periode, gefolgt von Organogenese. Zu diesem Zweck haben wir Validierung der Endpunkte durch Fruchtbarkeit und nicht-assoziativen Lernens Assays zur Verfügung gestellt. Während die mechanistische Grundlage des Handelns der BPA und andere Bisphenole der Heilige Gral die Forschung auf diesem Gebiet ausgerichtet ist ist, haben wir nicht versucht eine mechanistische Erklärung für die Wirkung von BPA bei dieser Methodik konzentriert Artikel bieten. Allerdings möchten wir darauf hinweisen, dass das C. Elegans -Modell ein ideales System bietet, um weiter den Wirkmechanismus zu sezieren. Zum Beispiel, in der künftigen Arbeit auf Entschlüsselung Wirkmechanismen BPA C. Elegans Mutanten erzeugt werden können und geschirmt für eine Resistenz gegen die Auswirkungen von BPA und somit ebnen den Weg für die Entschlüsselung des Weges. Darüber hinaus beschäftigt sich unser Begleiter-Papier mit der Wirkung von BPA Ebene der neuronalen Netzes Synchronität bei Wirbeltieren, bietet eine weitere Möglichkeit um zu verstehen, die Grundlage für die Untersuchung von möglichen Mechanismen für die giftigen Effekte19.
In der Methodik, die detailliert in diesem Papier, einige wichtige Schritte, die sein sollte hingerichtet Extra sorgfältig gehören die folgenden: wählen eine Platte mit wohlgenährten C. Elegans Erwachsene mit reife Eizellen unter dem Mikroskop Dissektion sichtbar ist entscheidend, und Nichtbefolgen dieser Schritt führt eine unzureichende Stichprobengröße von Embryonen für die EDC-Exposition-Experiment. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Hypochlorit-Lösung um zu vermeiden, erhalten eine nicht synchronisierte Bevölkerung, die die Fähigkeit zur BPA-Exposition in der frühen Embryogenese stören wird frisch zubereitet wird. Waschen Sie Pellets mit M9 (nach Hypochlorit Exposition) ist auch ein sehr wichtiger Schritt. Wenn nicht richtig gemacht, kann die hohe Konzentration der Bleichmittel Toten Embryonen führen. Darüber hinaus sollten Embryonen nach 4 h auf gesetzte NGM Platten übertragen werden. Wenn die BPA-Lösung für längere Zeit verließ, dürften die Embryonen in die langlebigen Dauer Larven entwickeln. Dies wird deutlich Fruchtbarkeit Assay und Verhaltensstörungen Assays stören. Wenn einer dieser Schritte ist verpasst haben, ist es ratsam, den Vorgang von Anfang an starten. Wenn aus irgendeinem Grund die NGM-Platte mit Würmern verschmutzt ist oder verfügt nicht über genug zu essen, wird es Stress auf die Würmer dabei neigen die gesammelten Daten hinzufügen. Solche Platten sollten entsorgt werden und nicht im Experiment verwendet werden.
Früher eine bemerkenswerte Studie erfolgreich das C. Elegans -Modell um zu zeigen, dass BPA Ergebnis durch den Abbau der DNA-Reparatur-Mechanismus in der Keimbahn14Chromosomenanomalien zurückzuführen. Es ist jedoch bemerkenswert, dass das Design der oben genannten Studie BPA Dauerbelastung von C. Elegans , hohe Dosen von BPA während seiner Lebensdauer genutzt hatte. Unsere Methodik wurde entwickelt, um niedrige Dosen von BPA-Exposition in der frühen Embryogenese, um seine Auswirkungen auf die embryonale Lebensfähigkeit und subtiler Langzeiteffekte auf die Überlebenden assay zu studieren. Nach unserer Kenntnis wurde keine Methodik entwickelt um frühen Embryonen zu sehr niedrigen Dosen von BPA beschränkt auf einen bestimmten Zeitraum aussetzen; damit die Methode hier vorgestellten Roman.
Darüber hinaus Protokolle zur Verfügung, hier lässt sich die Untersuchung der Auswirkungen von anderen EDZ während der Embryogenese der Proliferationsphase leicht anpassen. Allerdings erfordert das Protokoll um späten embryonalen Stadien zu studieren, wesentliche Änderungen an der kritischen Zeitfenster der Entwicklung im Fokus. Darüber hinaus wird unser Protokoll nicht für Experimente erfordern längere Zeiten der vergiftendes Exposition, geeignet als es eröffnet die Möglichkeit, die Alternative Entwicklung Weg, wodurch die langlebigen Dauer Verhaftung an der zweiten Häutung Zyklus, der beständig ist auf rauen Bedingungen20. Weitere Änderungen und Verbesserungen für längere Belichtungszeiten durch Ergänzung mit eine Nahrungsquelle, die keinen Potenzial, die Schlüpfzeit oder EDC z.B. verstoffwechseln benötigt werden autoklaviert E. Coli. Zusammenfassend unsere Methodik genutzt werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Chemikalien auf die Fruchtbarkeit und neuronale Funktion endokriner im Wirbellosen Modellsystem beurteilen C. Elegans.

Belastung durch Umweltgifte, Verbindungen insbesondere diejenigen, die dazu neigen, mit Entwicklung stören, wurde in den letzten Jahren unter sorgfältigen wissenschaftlichen Prüfung. Mehr als 1000 Chemikalien im Alltag werden als endokriner Verbindungen (EDC)1eingestuft. Perioden des schnellen Wachstums und Entwicklung, darunter embryonalen, Säuglings und Phasen der Kindheit, worden besonders anfällig für die schädlichen Wirkungen, auch niedrig dosierte EDC gemerkt. Ihre Wirkung haben gezeigt, dass Fortpflanzungs- und Entwicklungsstörungen Störungen2verursachen. Richtlinien der US Environmental Protection Agency und uns National Toxicology Program Panel kann eine niedrige Dosis als jede Dosis unter dem Niveau einer definiert werden, die gemeldet wurden, verursachen eine beobachtbare biologische Veränderung oder beschädigen3. Neben Wirkungen niedriger Dosen von einzelnen EDZ haben Mischungen aus verschiedenen EDZ in geringen Konzentrationen in der Umwelt gefunden das Potenzial, inhaltliche Kumulationseffekte4verursachen.
Bisphenol A (BPA oder 4,4'-(propane-2,2-diyl)) ist ein polymerisierenden Agent gefunden in häufig verwendete Elemente wie Wasserflaschen, Shop Einnahmen, dental Dichtstoffe und die Auskleidungen der Getränke und Essen5Dosen. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit mit 17-β-Estradiol (E2) und seine Affinität zu ERα und ERβ Östrogen-Rezeptoren hat BPA als ein endokriner chemische (EDC)5,6eingestuft. Obwohl schwächer, nachweislich BPA Affinität zu Östrogen-Rezeptoren beeinflussen die Reproduktionssystems beider Geschlechter und neuronale Funktionen bei Dosen, die sicher7,8gelten zu stören. Änderungen in der DNA-Methylierung über epigenetisch regulierten Mechanismen sind beobachtet worden, um langfristige neuronale Defekte bei Mäusen ausgesetzt BPA9verursachen. Insbesondere hat BPA auch als eine mögliche Täter für erhöhten Raten von Hyperaktivität, Aufmerksamkeit Defizit und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten aufgrund eines Anstiegs in D1 Dopamin-Rezeptoren in der Maus limbische Vorderhirn nach chronischer Exposition gesehen verwickelt 9 , 10. wesentliche Erkenntnisse über die schädlichen Wirkungen des EDZ auf die menschliche Gesundheit basiert auf Korrelation Studien mit Schwerpunkt auf chronische Exposition der Bevölkerung um Umweltgifte auch bei niedrigen Dosen5; jedoch sind Beschränkungen im Schlüsse aus Humanstudien und experimentelle Kontrollen zu manipulieren angenommen worden, womit Kritik unbegründet Hype11,12.
Soll die Erhaltung von Caenorhabditis Elegans Gene in Bezug auf Säugetiere, einschließlich haben seine Steroid-Hormon-Rezeptor-Gene, Forscher diese genetisch gefügig Lab-Modell um die Funktions- und mechanistische Effekte des EDZ zu entwirren genutzt. 13. Experimente mit C. Elegans haben gezeigt, dass diese Verbindungen wie BPA und BPS in die doppelsträngige DNA Bruch Reparaturmechanismen und neuronale Funktion14,15 Apoptose, embryonale Tödlichkeit, Störung verursachen können ,16.
Unser Labor hat bisher gezeigt, dass sogar Niedrigdosis Belichtung beschränkt auf frühen Embryogenese, abgesenkten Fruchtbarkeit mit Verhaltensstörungen Defizite in der Überlebende Erwachsene15führt. Gewöhnung an eine wiederholte Anregung ist eine Form des assoziativen Lernens in Modellsystemen, einschließlich C. Elegans, und unsere Methodik verwendet diese Form des assoziativen Lernens als Verhaltens-Ausgang, um die langfristigen Auswirkungen der embryonalen Exposition gegenüber assay die Giftstoffe17 konkret bieten wir ausführliche Protokolle für das Studium der BPA-Exposition auf C. Elegans, einschließlich seine unmittelbaren Auswirkungen auf die embryonale Tödlichkeit und langfristigen Auswirkungen auf Erwachsene Verhalten, mit einer allgemeinen Schaltplan dargestellt in Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse von Fruchtbarkeit und nicht-assoziativen Lernens Assays werden bereitgestellt, um die Effektivität unserer Methode markieren.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Fisher</td><td>S25761B</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P286-1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>7758-11--4</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>BPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239658-250g</td><td></td></tr><tr><td>BPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>103039-100g</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>E.coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td>Repository an der U of Minnesota</td></tr><tr><td>N2 (Wildtyp C. elegans) Würmer</td><td>CGC</td><td></td><td>Repository an der U von Minnesota</td></tr><tr><td>Platin-Draht-Pickel</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-AWP</td><td></td></tr><tr><td>Petriplatten</td><td>Fisher</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>AmScope</td><td>SM-2TYY</td><td></td></tr></tbody></table>

verhaltens- und reproduktive langzeitfolgen der embryonalen exposition gegenüber niedrig dosierte giftstoffe

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenole, wie Bisphenol A (BPA) und Bisphenol S (BPS) sind Agenten am meisten benutzt in der Produktion von Kunststoffen und jeden Tag zahlreiche Produkte dadurch. Aufgrund ihrer chemischen Struktur und Estradiol-ähnliche biologische Eigenschaften, sind sie als endokriner Verbindungen (EDC) eingestuft worden. Langzeitexposition gegenüber EDZ, selbst bei niedriger Dosierung ist mit verschiedenen gesundheitlichen Mängel einschließlich Krebs, Verhaltensstörungen und Unfruchtbarkeit, mit größere Anfälligkeit in frühen Entwicklungs-Zeiten angegeben verbunden worden. Zelluläre und molekulare Studien mit dem genetisch gefügig Fadenwurm Caenorhabditis Elegans haben gezeigt, dass BPA-Exposition verursacht Apoptosis, embryonale Tödlichkeit und Störungen in der DNA-Reparaturmechanismen. Wir haben vorher, dass die Exposition von C. Elegans Embryos zu niedrigen Dosen von verschiedenen Bisphenole verringert Fruchtbarkeit berichtet. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Auswirkungen der Exposition in den sehr frühen Phasen der Entwicklung bis ins Erwachsenenalter fortbestehen wie durch Quantifizierung Gewöhnung Verhalten, eine Form des assoziativen Lernens untersucht. Hier bieten wir ausführliche Protokolle für die embryonale Exposition gegenüber niedrig dosierte EDCs sowie der damit verbundenen Fruchtbarkeit und vorderen Gewöhnung Assays, sowie repräsentative Ergebnisse berühren.

Frühere Studien mit C. Elegans haben berichtet, dass kontinuierliche Exposition gegenüber hohen BPA-Konzentrationen (≥1 mM) in der gesamten Entwicklung des Embryos und Erwachsenenalter Fruchtbarkeit14verringert. Nachfolgende Studien berichteten von unserem Labor haben gezeigt, dass Embryonen, die BPA für einen begrenzten Zeitraum von 4 h in der Anfangsphase ihrer Entwicklung zeigte einen Rückgang der Anzahl der lebensfähigen Eiern wurden ausgesetzt als Erwachsene15 (Abbildung 2) gelegt. Zwei wesentliche Merkmale der Methode waren, dass (i) die BPA-Konzentrationen verwendet deutlich wurden niedriger (0,1 µM bis 10 µM-Bereich) und (Ii) die Belichtung war in der frühen embryonalen begrenzt. Neben der verminderten Fruchtbarkeit auch bei niedrigeren Dosen ergab unsere Gewöhnung Assays, dass Fahrzeug allein15 (Abbildung 3) Würmern ausgesetzt BPA Bedarf Embryonen mehr Reize zu gewöhnt werden, im Vergleich zu Würmern ausgesetzt. Diese Effekte sind bemerkenswert, sie auf niedrig dosierte BPA-Exposition beruhen, nach der Begründung, dass die subtileren Effekte auf neuronale Funktion, die möglicherweise nicht morphologisch deutlich erkennbar durch Verhaltensänderungen sein dürften. Kurz gesagt, die repräsentativen Ergebnisse hier vorgestellten unterstrich die Tatsache, dass die schädlichen Auswirkungen von BPA-Exposition zu einem Embryo beeinflusst seine Entwicklung, einschließlich der neuronalen Funktion, die durch Erwachsene Verhaltens Assays in C. Elegansbeurteilt werden kann. Protokolle, die hier zur Verfügung gestellten können niedrig dosierte sowie langfristige Effekte von anderen möglichen Schadstoffen einschließlich endokrine störende Verbindungen zu Testzwecken verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Versuchsanordnung. Reifen Würmer wurden gesammelt und Hypochlorit-Lösung ausgesetzt, um synchronisierte Embryonen zu sammeln. Die Embryonen wurden dann verschiedene Konzentrationen von BPA für 4 h ausgesetzt. Die exponierten Embryonen wurden auf gesetzte NGM Platten übertragen wo durften sie wachsen für 60 h bei 20 ° C. Um die Wirksamkeit der Einwirkung während der frühen Stadien der Entwicklung zu testen, die L4-Würmer auf einzelnen Platten übertragen und für Fruchtbarkeit getestet wurden, und junge Erwachsene mit vorderen Touch Gewöhnung getestet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Abbildung 2: Fruchtbarkeit sinkt durch BPA. Einwirkung von 1 µM und höhere Konzentrationen von BPA verringert deutlich die Anzahl der gelegten Eiern im Vergleich zu der Kontrolle (vertreten durch die horizontale Linie; n = 10, *p &lt; 0,05). Fehlerbalken kennzeichnen SEM Analyse erfolgt mit ANOVA, Tukey post-hoc-Test. Diese Zahl wurde von Mersha Et Al., 201515geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Abbildung 3: Langzeitwirkungen der embryonalen BPA-Exposition spiegeln sich in Erwachsene Verhalten. Embryonen, die BPA-Konzentrationen so niedrig wie 0,1 µM nicht assoziativ anterior Touch Gewöhnung bei Erwachsenen betrifft ausgesetzt (n = 60, *p &lt; 0,05). Fehlerbalken bezeichnen SEM; ANOVA, Tukey post-hoc-Test. Diese Zahl wurde von Mersha Et Al., 201515geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Belastung durch Umweltgifte kann akut Entwicklung mit Langzeitwirkung auswirken. Ausführliche Protokolle werden bereitgestellt, um eine Strategie mit einem wirksamen Labormodell um die Wirkung der frühen embryonalen Exposition gegenüber Bisphenol A. untersuchen zu veranschaulichen Wir bieten Fruchtbarkeit und Verhaltens-Assays, die Wirksamkeit unserer vergiftendes Exposition Bio-Assays zu überwachen.

Verhaltens- und reproduktive Langzeitfolgen der embryonalen Exposition gegenüber niedrig dosierte Giftstoffe

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, die Langzeiteffekte einer niedrig dosierten BPA-Exposition in der frühen Embryogenese zu untersuchen. C.elegans-Embryonen werden für einen begrenzten Zeitraum BPA ausgesetzt und im Erwachsenenalter auf Fruchtbarkeit und Lernverhalten getestet. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu den langfristigen Entwicklungseffekten der Exposition gegenüber Giftstoffen wie Bisphenolen und anderen endokrin wirksamen Verbindungen zu beantworten.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, langfristige und subtile Auswirkungen von Giftstoffen auf die Entwicklung durch quantitative Verhaltensassays an einem einfach zu bedienenden Labormodell für wirbellose Tiere zu testen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf das Verständnis der entwicklungsbedingten und neuronalen Grundlagen schädlicher gesundheitlicher Auswirkungen der Exposition gegenüber Giftstoffen selbst bei niedrigen Dosen. Die Idee zu diesen Experimenten kam uns, als wir feststellten, dass eine Reihe komplexer oder multifaktorieller Störungen die eine oder andere Entwicklungskomponente zu haben scheinen.Dies kann seinen Einfluss zum Teil durch anomale Expression kritischer Gene ausüben. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, die Schritte zur Gewöhnung an die innere Berührung allein durch textbasierte Anweisungen zu erlernen. Am Tag vor der Synchronisation werden die N2-Würmer auf 100-Millimeter-Platten mit NGM-Medien übertragen, die mit E.coli OP50 bestrichen werden.Durch das Aufteilen einer Platte von etwa einem Quadratzentimeter. Lassen Sie die Würmer drei Tage lang bei 20 Grad Celsius wachsen. Nach drei Tagen, wenn die Platten mit gut genährten, reifen Erwachsenen mit sichtbaren Embryonen bestückt sind, beginnen Sie mit der Synchronisation, indem Sie zuerst jede Platte mit fünf Millimetern M9-Puffer waschen und die Flüssigkeit in ein steriles konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.Bei 3.000-facher Schwerkraft vier Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zertigung mit einer Zehn-Milliliter-Pipette vorsichtig den Überstand von jedem losen Pellet erwachsener Würmer. Geben Sie dann 5 Milliliter frisch zubereitete Hypochloritlösung zu jedem Wurmpellet und mischen Sie vorsichtig.Vier Minuten lang bei 3.000-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur zentrifugieren. Es ist wichtig, synchronisierte Populationen zu erhalten. Die Zubereitung einer frischen Hypochloritlösung hilft bei der Vermeidung von Kontamination und unsynchronisierten Tieren.Verwenden Sie dann eine Zehn-Milliliter-Pipette, um den Überstand zu entfernen, und waschen Sie die sieben Milliliter M9-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Nach dem letzten Waschen ca. 100 Mikroliter M9-Puffer zu den Eiern geben.Übertragen Sie dann etwa 50 Mikroliter Eier in zwei Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen, die BPA enthalten, verdünnt in S-Puffer. Passen Sie die Menge an S-Puffer an, um die richtige Endkonzentration von BPA pro Tube zu gewährleisten, wie in der Tabelle gezeigt. Legen Sie die Röhrchen vier Stunden lang bei 20 Grad Celsius auf einen Schaukel- oder Drehschüttler, der sich mit 25 Neigungen pro Minute oder 25 U/min bewegt.Legen Sie die Röhrchen nach vier Stunden in Röhrchenhalter und lassen Sie die Würmer sich absetzen. Entsorgen Sie den Überstand und übertragen Sie die Würmer auf NGM-Platten, die mit OP50 E.coli besiedelt sind. Lassen Sie die Würmer 60 Stunden bei 20 Grad Celsius wachsen.Untersuchen Sie die Platten jeden Tag auf Verunreinigungen. Kontaminierte NGM-Platten sind in der Regel verfärbt und werden von einzelnen Kolonien begleitet. Überprüfen Sie Würmer unter dem Mikroskop auf Überfüllung.Verwenden Sie zunächst einen feuersterilisierten 30-Gauge-Platindrahtpickel, um etwa zehn synchronisierte junge erwachsene Würmer auf neue, nicht ausgesäte NGM-Platten zu übertragen. Lassen Sie die Würmer fünf Minuten lang ungestört, damit sie Zeit haben, sich an die neue Platte zu gewöhnen. Sterilisieren Sie dann ein Augenbrauenhaar, das am Ende eines Holzspießes oder Zahnstochers befestigt ist, indem Sie es in 70%iges Ethanol tauchen.Wischen Sie mit einem sauberen, fusselfreien Tuch ab und warten Sie eine Minute, bis das Ethanol verdampft ist. Berühren Sie den Wurm sanft mit den Augenbrauenhaaren auf dem Kopf. Wiederhole die Berührungen und lass zwischen den Berührungen zehn Sekunden liegen, damit sich der Wurm erholen kann.Berühren Sie weiter, warten Sie zehn Sekunden Interstimulus-Intervalle, bis sich der Wurm nicht mehr rückwärts bewegt. Notieren Sie die Anzahl der Berührungen, die für diese Gewöhnung erforderlich sind. Es ist wichtig, ein Intervall von zehn Sekunden zwischen den Berührungen einzulegen, da dies dem Tier Erholungszeit ermöglicht und dazu beiträgt, konsistente Gewöhnungsverhaltenstests zu erhalten.Erwachsene Tiere, die embryonal einer mikromolaren oder höheren Konzentration von BPA ausgesetzt waren, legten signifikant weniger Eier im Vergleich zu der durch die horizontale Linie dargestellten Kontrolle. Erwachsene Tiere, die aus Embryonen stammen, die BPA-Konzentrationen von nur 0,1 Mikromolaren ausgesetzt waren, weisen nicht-assoziative Defizite auf, die auf der erhöhten Anzahl von Frontberührungen basieren, die für ihre Gewöhnung erforderlich sind. Bei der Vorbereitung von Embryonen auf die BPA-Exposition ist es wichtig, eine Platte mit gut genährten erwachsenen C.elegans mit reifen Eizellen zu wählen, die unter dem Präpariermikroskop sichtbar sind, um eine ausreichende Probengröße zu erhalten.Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Umwelttoxikologie den Weg, um die Auswirkungen von Toxinen und anderen endokrin wirksamen Verbindungen auf das Verhalten zu bewerten und mechanistische Experimente zu planen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man C.elegans-Embryonen im Frühstadium BPA aussetzt und wie man das Gewöhnungsverhalten bei den resultierenden Erwachsenen testet, die aus den BPA-exponierten Embryonen stammen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Artikel werden Zebrafischembryonen für das Screening chemischer Toxizität verwendet. Die chemische Toxizität korreliert mit den Phänotyp-Messwerten. Das Probenprotokoll zeigt einen methodischen Ansatz zur Durchführung des chemischen Toxizitätsscreenings.

Embryobasiertes chemisches Toxizitätsscreen: Bewertung der Auswirkungen auf die Entwicklung von Zebrafischembryonen

Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, Verfahren zu beschreiben, um Ratten während der pränatalen Gehirnentwicklung moderaten Alkoholmengen auszusetzen und die daraus resultierenden Veränderungen im Sozialverhalten im Erwachsenenalter zu quantifizieren.

Moderate Pränatale Alkoholexposition und Quantifizierung von Sozialverhalten bei erwachsenen Ratten

Belastung durch Umweltgifte kann akut entwickelnde Embryonen auswirken. Endokriner Chemikalien wie Bisphenole bekannt sind, um das Nervensystem beeinträchtigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem in-vitro- Wirbeltier (Chick Embryo) neuronale Netzwerkmodell, um die funktionellen Auswirkungen der Toxin-Belastung am frühen Embryo zu studieren.

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Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

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