Verhaltens- und reproduktive Langzeitfolgen der embryonalen Exposition gegenüber niedrig dosierte Giftstoffe

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, die Langzeiteffekte einer niedrig dosierten BPA-Exposition in der frühen Embryogenese zu untersuchen. C.elegans-Embryonen werden für einen begrenzten Zeitraum BPA ausgesetzt und im Erwachsenenalter auf Fruchtbarkeit und Lernverhalten getestet. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu den langfristigen Entwicklungseffekten der Exposition gegenüber Giftstoffen wie Bisphenolen und anderen endokrin wirksamen Verbindungen zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, langfristige und subtile Auswirkungen von Giftstoffen auf die Entwicklung durch quantitative Verhaltensassays an einem einfach zu bedienenden Labormodell für wirbellose Tiere zu testen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf das Verständnis der entwicklungsbedingten und neuronalen Grundlagen schädlicher gesundheitlicher Auswirkungen der Exposition gegenüber Giftstoffen selbst bei niedrigen Dosen. Die Idee zu diesen Experimenten kam uns, als wir feststellten, dass eine Reihe komplexer oder multifaktorieller Störungen die eine oder andere Entwicklungskomponente zu haben scheinen.

Dies kann seinen Einfluss zum Teil durch anomale Expression kritischer Gene ausüben. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, die Schritte zur Gewöhnung an die innere Berührung allein durch textbasierte Anweisungen zu erlernen. Am Tag vor der Synchronisation werden die N2-Würmer auf 100-Millimeter-Platten mit NGM-Medien übertragen, die mit E.coli OP50 bestrichen werden.

Durch das Aufteilen einer Platte von etwa einem Quadratzentimeter. Lassen Sie die Würmer drei Tage lang bei 20 Grad Celsius wachsen. Nach drei Tagen, wenn die Platten mit gut genährten, reifen Erwachsenen mit sichtbaren Embryonen bestückt sind, beginnen Sie mit der Synchronisation, indem Sie zuerst jede Platte mit fünf Millimetern M9-Puffer waschen und die Flüssigkeit in ein steriles konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Bei 3.000-facher Schwerkraft vier Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zertigung mit einer Zehn-Milliliter-Pipette vorsichtig den Überstand von jedem losen Pellet erwachsener Würmer. Geben Sie dann 5 Milliliter frisch zubereitete Hypochloritlösung zu jedem Wurmpellet und mischen Sie vorsichtig.

Vier Minuten lang bei 3.000-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur zentrifugieren. Es ist wichtig, synchronisierte Populationen zu erhalten. Die Zubereitung einer frischen Hypochloritlösung hilft bei der Vermeidung von Kontamination und unsynchronisierten Tieren.

Verwenden Sie dann eine Zehn-Milliliter-Pipette, um den Überstand zu entfernen, und waschen Sie die sieben Milliliter M9-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Nach dem letzten Waschen ca. 100 Mikroliter M9-Puffer zu den Eiern geben.

Übertragen Sie dann etwa 50 Mikroliter Eier in zwei Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen, die BPA enthalten, verdünnt in S-Puffer. Passen Sie die Menge an S-Puffer an, um die richtige Endkonzentration von BPA pro Tube zu gewährleisten, wie in der Tabelle gezeigt. Legen Sie die Röhrchen vier Stunden lang bei 20 Grad Celsius auf einen Schaukel- oder Drehschüttler, der sich mit 25 Neigungen pro Minute oder 25 U/min bewegt.

Legen Sie die Röhrchen nach vier Stunden in Röhrchenhalter und lassen Sie die Würmer sich absetzen. Entsorgen Sie den Überstand und übertragen Sie die Würmer auf NGM-Platten, die mit OP50 E.coli besiedelt sind. Lassen Sie die Würmer 60 Stunden bei 20 Grad Celsius wachsen.

Untersuchen Sie die Platten jeden Tag auf Verunreinigungen. Kontaminierte NGM-Platten sind in der Regel verfärbt und werden von einzelnen Kolonien begleitet. Überprüfen Sie Würmer unter dem Mikroskop auf Überfüllung.

Verwenden Sie zunächst einen feuersterilisierten 30-Gauge-Platindrahtpickel, um etwa zehn synchronisierte junge erwachsene Würmer auf neue, nicht ausgesäte NGM-Platten zu übertragen. Lassen Sie die Würmer fünf Minuten lang ungestört, damit sie Zeit haben, sich an die neue Platte zu gewöhnen. Sterilisieren Sie dann ein Augenbrauenhaar, das am Ende eines Holzspießes oder Zahnstochers befestigt ist, indem Sie es in 70%iges Ethanol tauchen.

Wischen Sie mit einem sauberen, fusselfreien Tuch ab und warten Sie eine Minute, bis das Ethanol verdampft ist. Berühren Sie den Wurm sanft mit den Augenbrauenhaaren auf dem Kopf. Wiederhole die Berührungen und lass zwischen den Berührungen zehn Sekunden liegen, damit sich der Wurm erholen kann.

Berühren Sie weiter, warten Sie zehn Sekunden Interstimulus-Intervalle, bis sich der Wurm nicht mehr rückwärts bewegt. Notieren Sie die Anzahl der Berührungen, die für diese Gewöhnung erforderlich sind. Es ist wichtig, ein Intervall von zehn Sekunden zwischen den Berührungen einzulegen, da dies dem Tier Erholungszeit ermöglicht und dazu beiträgt, konsistente Gewöhnungsverhaltenstests zu erhalten.

Erwachsene Tiere, die embryonal einer mikromolaren oder höheren Konzentration von BPA ausgesetzt waren, legten signifikant weniger Eier im Vergleich zu der durch die horizontale Linie dargestellten Kontrolle. Erwachsene Tiere, die aus Embryonen stammen, die BPA-Konzentrationen von nur 0,1 Mikromolaren ausgesetzt waren, weisen nicht-assoziative Defizite auf, die auf der erhöhten Anzahl von Frontberührungen basieren, die für ihre Gewöhnung erforderlich sind. Bei der Vorbereitung von Embryonen auf die BPA-Exposition ist es wichtig, eine Platte mit gut genährten erwachsenen C.elegans mit reifen Eizellen zu wählen, die unter dem Präpariermikroskop sichtbar sind, um eine ausreichende Probengröße zu erhalten.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Umwelttoxikologie den Weg, um die Auswirkungen von Toxinen und anderen endokrin wirksamen Verbindungen auf das Verhalten zu bewerten und mechanistische Experimente zu planen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man C.elegans-Embryonen im Frühstadium BPA aussetzt und wie man das Gewöhnungsverhalten bei den resultierenden Erwachsenen testet, die aus den BPA-exponierten Embryonen stammen.