Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Kalziumerhöhungen in neuronalen Dendriten als Reaktion auf verschiedene Stimulationsparadigmen zu untersuchen, indem Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen in neuronalen Soma parallel zur Zwei-Photonen-Kalziumbildgebung in Dendriten verwendet werden. Diese Methode kann zur Überwachung des Kalzium-Signalwegs in kleinen dendritischen Kompartimenten eingesetzt werden, was eine genaue Beobachtung der Prozesse ermöglicht, die in dendritischen Ästen während der Integration synaptischer Inputs ablaufen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, Kalzium-Signalmuster in hoher räumlich-zeitlicher Auflösung und Spezifität zu beobachten.

Legen Sie das Gehirn der Maus auf eine Petrischale, die kontinuierlich sauerstoffreiche, kalte ACSF-Saccharose enthält. Um Hippocampus-Schnitte aus dem extrahierten Gehirn zuzubereiten, lassen Sie das Gehirn etwa zwei Minuten lang abkühlen. Legen Sie anschließend ein Stück Filterpapier auf eine eisgefüllte Petrischale und übertragen Sie das Gehirn auf das Filterpapier.

Zerlege dann das Gehirn in zwei Hemisphären. Kleben Sie die präparierten Halbkugeln auf eine Vibratom-Schnittplattform und tauchen Sie sie in die mit eiskalter, sauerstoffhaltiger ACSF-Saccharose gefüllte Schnittschale. Anschließend schneiden Sie 300 Mikrometer dicke Scheiben bei einem Grad Celsius mit einem Vibratomkühler oder legen das Eis um die Vibrationsschale.

Übertragen Sie die Scheiben, die den Hippocampus enthalten, mit einem Pinsel in ein auf 37 Grad Celsius erhitztes Bad mit sauerstoffhaltiger ACSF-Rückgewinnung. In diesem Schritt wird eine Hippocampus-Scheibe in ein Bad unter dem Objektiv eines Laser-Scanning-Zwei-Photonen-Mikroskops überführt. Perfundieren Sie das Bad kontinuierlich mit sauerstoffhaltigem ACSF-Normal.

Verwenden Sie dann die Infrarot-Differenzinterferenz-Kontrastmikroskopie, um eine interessierende Zelle anhand ihrer Größe, Form und Position zu lokalisieren. Füllen Sie danach eine stimulierende Pipette mit einer ACSF-Normallösung, die das rote Fluorophor enthält. Senken Sie es auf das Segment, sodass sich die Spitze im selben Bereich wie die gewünschte Zelle befindet.

Füllen Sie anschließend die Patch-Pipette mit Patch-Lösung und befestigen Sie sie am Kopftisch. Platzieren Sie es so über dem Segment, dass sich seine Spitze direkt über der gewünschten Zelle befindet. Setzen Sie anschließend eine Spritze in den Dreiwege-Absperrhahn ein und verbinden Sie sie durch ein Kunststoffröhrchen mit der Patchpipette.

Injizieren Sie konstanten Überdruck in die Patch-Pipette und halten Sie den Absperrhahn in enger Position. Öffnen Sie als Nächstes das Softwaremodul für die MultiClamp-Verstärkersteuerung und wechseln Sie in den Voltage Clamp-Modus, indem Sie auf die VC-Schaltfläche klicken. Öffnen Sie die elektrophysiologische Datenerfassungssoftware Clampex zur Aufzeichnung elektrophysiologischer Signale und klicken Sie auf das Symbol Membrantest, um einen Impuls mit konstanter Rechteckspannung zur Überwachung von Änderungen des Pipettenwiderstands auszusenden.

Senken Sie nun die Patch-Pipette ab, bis sie sich direkt auf der Zielzelle befindet. Bei Kontakt mit der Zellmembran den Druck durch Drehen des Absperrhahns in die offene Stellung nehmen. Üben Sie dann mit einer leeren Spritze, die in den Absperrhahn eingesetzt wird, einen leichten Unterdruck auf die Patch-Pipette aus, bis der Pipettenwiderstand ein Gigaohm erreicht.

Klemmen Sie die Zelle im Fenster Membrantest der Datenerfassungssoftware bei minus 60 Millivolt ein. Üben Sie weiterhin Unterdruck aus, bis der Pipettenwiderstand abnimmt und die Ganzzellkonfiguration erreicht ist. Stellen Sie im MultiClamp-Verstärkersteuerungssoftwaremodul die Patch-Konfiguration auf Stromzangen ein, indem Sie auf die IC-Schaltfläche klicken, und zeichnen Sie die Membraneigenschaften als Reaktion auf somatische Injektionen von hyperpolarisierenden und depolarisierenden Strömen auf.

Warten Sie mindestens 30 Minuten, bis die Zelle mit den in der Pflasterlösung vorhandenen Indikatoren gefüllt ist. Um Bilder aufzunehmen, lokalisieren Sie einen Dendriten von Interesse mithilfe des roten Fluoreszenzsignals. Stellen Sie eine sichtbare Reaktion sicher, indem Sie einen proximalen Dendriten wählen, der kürzer als 50 Mikrometer ist, da die Effizienz der AP-Backpropagation mit zunehmender Entfernung in GABAergen Interneuronen erheblich abnehmen kann, und wechseln Sie in den xt-Modus.

Stellen Sie den Zwei-Photonen-Laser mit den Laserintensitätsreglern auf eine minimale Leistung ein, bei der die grüne Fluoreszenz der Grundlinie nur leicht sichtbar ist, um Phototoxizität zu vermeiden. Erstellen Sie anschließend im Protokollfenster der Elektrophysiologie-Datenerfassungssoftware Clampex und in der Bilderfassungssoftware einen Aufzeichnungsversuch mit der gewünschten Dauer, der eine somatische Strominjektion in der gewünschten Amplitude enthält. Klicken Sie danach auf die Schaltfläche Aufnahme starten und erfassen Sie die Fluoreszenz kontinuierlich für ein bis zwei Sekunden.

Wiederholen Sie die Bildaufnahme drei- bis zehnmal. Warten Sie zwischen den einzelnen Scans mindestens 30 Sekunden, um Lichtschäden zu vermeiden. Um dendritische Kalziumtransienten aufzuzeichnen, die durch elektrische Stimulation induziert werden, lokalisieren Sie einen Dendriten von Interesse anhand des roten Fluoreszenzsignals.

Setzen Sie die stimulierende Pipette auf die Oberfläche der Scheibe über dem gewünschten Dendriten. Senken Sie die Stimulationspipette langsam 10 bis 15 Mikrometer vom Dendriten ab, um die Bewegung zu minimieren, um eine Störung der Ganzzellkonfiguration zu vermeiden. Um die Position synaptischer Mikrodomänen in stacheligen Neuronen zu visualisieren, wechseln Sie in der Bilderfassungssoftware in den xt-Modus und positionieren Sie die Linie entlang des dendritischen Zweigs von Interesse.

Erstellen Sie im Protokollfenster einen Aufnahmeversuch, der die Stimulation auslöst. Scannen Sie mit der Erfassungssoftware ein bis zwei Sekunden lang kontinuierlich entlang des Dendriten. Wiederholen Sie die Erfassung drei- bis fünfmal und warten Sie zwischen den Scans 30 Sekunden, um Lichtschäden zu vermeiden.

Um vorläufige Informationen über die Morphologie der Zelle zu erhalten und die Position der Stimulationspipette zu protokollieren, erfassen Sie einen Z-Stapel der Zelle im roten Kanal. Legen Sie mit der Erfassungssoftware im xyz-Modus die obere und untere Stapelgrenze fest, um die gesamte Zelle mit allen eingeschlossenen Prozessen abzubilden. Stellen Sie dann die Schrittweite auf ein Mikrometer ein und starten Sie die Stack-Erfassung mit der Schaltfläche "Aufnahme starten".

Wenn die Z-Stapel-Erfassung abgeschlossen ist, verwenden Sie die Option Maximale Projektion in der Software, um alle Fokuspläne des Stapels zu überlagern und die Qualität der Erfassung zu überprüfen. Ziehen Sie dann die Patch-Pipette langsam aus der Scheibe zurück. Um die Scheibe für die nachträgliche morphologische Identifizierung zu fixieren, nehmen Sie die Scheibe schnell mit einem Pinsel aus dem Bad und legen Sie sie zwischen zwei Filterpapiere in eine mit ACSF gefüllte Petrischale.

Ersetzen Sie ACSF durch eine 4%ige Paraformaldehydlösung und lassen Sie das Gericht über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. In dieser Abbildung zeigt die maximale Projektion eines Zwei-Photonen-Z-Stapels ein gepatchtes Interneuron, das mit Alexa-594 gefüllt ist. Weiße Pfeilspitzen zeigen auf die Position der axonalen Enden innerhalb der Pyramidenschicht, was darauf hindeutet, dass es sich bei dem Interneuron um eine Korbzelle handelt.

Diese Abbildung zeigt den dendritischen Ast, in dessen Nähe die Stimulationselektrode positioniert wurde. Die gestrichelte Linie zeigt die Position des Zeilenscans. Die Bilder hier veranschaulichen das Ergebnis eines Zeilenscan im Rot- und Grünkanal.

Der Anstieg der grünen Fluoreszenz zum Zeitpunkt der Stimulation deutet auf einen Anstieg der Kalziumkonzentration in diesem Bereich hin. Die Bilder können in kleinere Segmente unterteilt werden, was die Analyse der Ausbreitung der Reaktion ermöglicht. Die hier zu sehenden Spuren zeigen die Kalziumtransienten, die in verschiedenen Segmenten als Reaktion auf elektrische Stimulation hervorgerufen wurden, die während des bildgebenden Versuchs auf somatischer Ebene aufgezeichnet wurden.

Die Amplitude der Kalziumtransienten nimmt mit zunehmender Entfernung vom zentralen Hotspot ab, was darauf hindeutet, dass die Reaktion räumlich lokalisiert ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die spannungssensitive Farbstoffbildgebung oder die Optogenetik durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. lokale Veränderungen des Gedächtnispotentials innerhalb dendritischer Äste oder die Integration spezifischer Inputs. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie aktivitätsabhängige Kalziumschwankungen in neuronalen Dendriten mit einer Kombination optophysiologischer Techniken überwachen können, die nützlich sein werden, um die Feinheiten der dendritischen Eingangsintegration und Plastizität zu untersuchen.