Name: Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Färbung von Drosophila-Pupal-Eierstöcken für die Stammzellforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Stammzellnischenentwicklung mit anpassbaren Werkzeugen.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (RO1 GM079351, DK). Wir danken für ihre hilfreichen Ratschläge auf pupal Eierstock Sezierungen basierend auf ihrem ursprünglichen Protokoll Dorothea Godt. Wir danken auch Amy Reilein für ihre Hilfe und Kommentare auf das Manuskript.

(1) EggLaying
<ol><li>Kombinieren Sie etwa zehn männlichen und 15 weiblichen Erwachsenen Drosophila -fliegen des gewünschten Genotyps in ein Fläschchen mit normalen reichen fliegen Lebensmittel mit Hefe ergänzt. Um zu vermeiden, Überbelegung der Durchstechflasche, ermöglichen Sie begatteten Weibchen zur Eiablage nicht länger als 2 – 4 h14.</li>
	<li>Übertragen Sie die Erwachsenen aus dem Fläschchen in ein neues Fläschchen durch Tippen auf das Fläschchen öffnen gegen ein anderes Fläschchen mit fliegen Essen. Lassen Sie die Eiern, Larven bei Raumtemperatur für 3 – 4 Tage zu entwickeln.</li>
</ol>2. Auswahl der weiblichen Larven
<ol><li>Mit einem feuchten feinen Pinsel mit weichen Borsten, machen Sie eine rollende Bewegung mit dem Pinsel entlang der Wand des Röhrchens, wandernde dritte Instar Larven aus dem Fläschchen auf ein Glas gut gefüllt bis zum Rand mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen. Waschen Sie die Speisereste aus den Larven, indem Sie sie zu einem anderen gut gefüllt mit 1 X PBS übertragen.</li>
	<li>Die männlichen und weiblichen Larven mit Pinzette zu trennen. Identifizieren Sie die männlichen Larven durch ein paar große, Runde und transluzenten Hoden eingebettet in Fett Körper an der lateralen Seite des Körpers etwa zwei Drittel nach unten aus seiner vorderen Ende15. Weiblichen Larven sind durchschnittlich größer, weniger transparent als die Männchen und haben viel kleinere Gonaden, die schwieriger zu erkennen sind.</li>
	<li>Wählen Sie gegen männliche Larven, weiblichen Larven zu sammeln. Sammeln Sie mindestens zehn Frauen aus dem Brunnen. Legen Sie die weiblichen Larven in einem separaten, gut gefüllt mit 1 X PBS.</li>
	<li>Mit Hefe ergänzt Verwendung Zangen, die weiblichen Larven sanft in ein neues Fläschchen Fliege Frischkost zu übertragen.</li>
	<li>Platzieren Sie das Fläschchen mit den weiblichen Larven an einem dunklen Ort, Pupariation16zu erleichtern. Im Laufe des Tages überwachen Sie die Larven für Pupariation. Da jede Larve lähmt und entwickelt sich zu einem Prepupa, Kreis Prepupa gegen das Fläschchen und notieren Sie die ungefähre Zeit wenn es zuerst in ein Prepupa bildet. Prepupae durch die Vorwölbung des vorderen Luftlöcher und Timing der Puppenkammer Bildung17zu identifizieren. Lassen Sie die Prepupae, um den gewünschten Zeitpunkt (gemessen in Stunden nach Puppenkammer Bildung, APF) zu entwickeln. Hinweis: Jedes Tier, das Puppenkammer Bildung innerhalb eines ca. 10 h Intervalls unterziehen kann ein Prepupa betrachtet werden. Das Puppenstadium beginnt ca. 12 h nach der Puppenkammer Bildung nach einer internen Häutung stattgefunden hat.</li>
</ol>3. Vorbereitung Puppen Antikörper Färbung
<ol><li>
Bilden Sie ein dünnes Glas Pipettieren in späteren Schritten verwendet werden, für die pupal fetten Körper ausräumen.
	<ol>
<li>Schmelzen Sie die Glas-Tipp von einem Pasteur Pipettieren bei einem Bunsenbrenner. Als das Glas schmilzt, verwenden Sie Zange um die Spitze horizontal Weg vom Rest des Pipettieren eine dünnere Spitze bilden ziehen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen, brechen Sie einen kleinen Teil der Pipettieren Spitze, eine nette Runde Öffnung zu bilden. Legen Sie eine Glühbirne an das andere Ende der pipettieren.</li>
		<li>Laden Sie das Pipettieren mit 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Puppen zu ernten, die an der Wand des Röhrchens geklebt sind, wenden Sie einen kleinen Tropfen des Wassers entlang der Kontaktzone zwischen Puppe und Fläschchen. 1 – 2 min. warten, bis das Protein lassen Kleber auflösen bevor Sie die Puppe von der Wand mit einem feuchten, feinen Pinsel sanft anheben. Die Puppe mit einem Glas gut gefüllt mit 1 X PBS zu übertragen. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Während das hintere Ende der Puppe mit einem paar der Zange greifen, reißen Sie den vorderen Teil der pupal Fall mit einem anderen paar vorsichtig bis der Kopf der Puppe sichtbar ist.</li>
	<li>Greifen Sie anterior-die meisten Tipp des pupal Kopfes mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Puppe aus ihrer pupal Fall. Hinweis: Ein Teil des Körpers Fett kann während dieses Vorgangs ergießen.</li>
	<li>Trennen und entsorgen der vorderen Hälfte der Puppe aus der hinteren Hälfte, bis nur der Bauch Plünderung übrig bleibt.</li>
	<li>
Der Bauch Plünderung entziehen Sie die Zellen Fett.
	<ol>
<li>Erfassen der Abdominal-Plünderung gegen die Unterseite des Brunnens mit Zange in der Hand halten Sie das Dünnglas Pipettieren mit 1 X PBS in einer anderen Hand gefüllt.</li>
		<li>Ziel ist die dünne Pipettieren Spitze in Richtung der Öffnung der Sack und langsam Pipettieren 1 X PBS in den Bauch der fetten Körperzellen umgebenden pupal Eierstöcke abzuwaschen. Hinweis: Die Eierstöcke sind ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen, die im Inneren der Abdominal-Plünderung bleiben sollten.</li>
		<li>Waschen Sie ab, die fetten Körper Zellen bis mindestens zwei Drittel des Körpers Fett ist Weg oder die Eierstöcke nahe der Öffnung der Abdominal-Sack sichtbar sind. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt langsam ausführen um nicht die Eierstöcke aus dem Bauch durch Zufall zu waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prüfen Sie den Brunnen zu überprüfen, ob die Eierstöcke während der Zelle Fett Duschgel heraus verschüttet haben. Wenn die Eierstöcke nicht sichtbar innerhalb des Brunnens sind, sollten sie im Bauch geblieben sind. Wenn die Eierstöcke herausgekommen sind, legen Sie eine neue Puppe in den Brunnen und wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Übertragen Sie den Bauch in eine klare Deckglas Kammer gefüllt mit Fixierung-Puffer (1 X PBS, 4 % Paraformaldehyd) und setzen Sie den Deckel an der Spitze. Um zu gewährleisten eine ausreichende Anzahl von Eierstöcken widerstehen Färbung und Montageprozess, sezieren mehr Eierstöcke als nötig. Achtung: Die Fixierung Puffer enthält Paraformaldehyd, die giftig ist. Bitte tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille, etc..</li>
</ol>4. Immunhistochemie
<ol><li>Während der gesamten Färbung verwenden Sie Zange, um drücken Sie vorsichtig alle schwimmenden Eierstöcke an der Unterseite des Brunnens Deckglas um sicherzustellen, dass die Eierstöcke komplett in Antikörperlösung eingetaucht sind.</li>
	<li>Ortund Streifen doppelseitiges Klebeband auf die flache Oberfläche des einen Nutator, dann legen die gekammerten Deckglas auf der Klebefläche.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke im Fixierung Buffer Schritt 3.7 für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke dreimal in 1 X PBS mit 1 % Triton x-100 für 5, 10 und 45 min (1 h insgesamt), bzw. um gründliche Permeabilisierung zu ermöglichen.</li>
	<li>Blockieren die Eierstöcke bei 10 % normalem Ziegenserum mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 für 30 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht in 600 µL Primärantikörper Wahl verdünnt, um die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei 4 ° C.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke drei Mal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke für 2 h in 600 µL Sekundärantikörper Wahl auf die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei Raumtemperatur verdünnt.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke zweimal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 und einmal für 5 min in 1 X PBS.</li>
</ol>5. zerlegen und montieren Pupal Eierstöcke
<ol><li>Geben Sie einen kleinen Tropfen 1 X PBS auf einen Objektträger. Verwendung Zange übertragen der Abdominal-Plünderung von den Kammern Deckglas auf ein Glas gut gefüllt mit 1 X PBS. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Zerreißen der Abdominal-Plünderung und alle restlichen Fett mit der Pinzette. Hinweis: Die Eierstöcke, die ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen sind, sollten innerhalb des Brunnens sichtbar. Die Eierstöcke sind oft eng von den fetten Körper umgeben, so ist es wichtig, dass alle fetten Körper ist gründlich zerrissen auseinander.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eierstöcke aus dem Brunnen in den Tropfen 1 x PBS am Mikroskop schieben Sie durch das Zentrum der Eierstöcke zwischen den Spitzen der Zange greifen. Es ist sehr wichtig, einen festen Griff ohne zu quetschen die Eierstöcke zu verwenden, um nicht zu verlieren oder zerstören sie während der Übertragung. Fügen Sie ein paar Tropfen 1 X PBS zur Folie hinzu, wenn die Lösung im Laufe der Zeit austrocknet.</li>
	<li>Sobald alle Eierstöcke seziert und auf den Objektträger Pipettieren 40 µL Eindeckmedium auf einem Ort das Deckglas vorsichtig auf die Eierstöcke und 22 x 22 mm Deckglas übertragen wurden. Lassen Sie die Folie über Nacht trocknen vor der Bildgebung.</li>
</ol>

<ol><li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21763616">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li>
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<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Staining+of+Drosophila+Larval+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries.</a> J Vis Exp. (51), e2537(2011).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li>
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<li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bric+%C3%A0+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB%2FPOZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li>
<li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INSECT+FAT+BODY%3A+ENERGY%2C+METABOLISM%2C+AND+REGULATION%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/fat-body-development-and-its-function-in-energy-storage-and-nutrient-sensing-in-drosophila-melanogaster-2157-7552.1000141.php?aid=36443">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li>
<li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2504450/">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52(2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Der kritische und schwierige Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Vorbereitung der pupal Eierstöcke vor der Fixierung. Um sicherzustellen, dass die Eierstöcke, kleine und begraben durch Fett Körperzellen in den pupal Bauch ausreichend mit Antikörpern gefärbt sind, ist es wichtig, nicht nur eine große Öffnung in der abdominalen Plünderung mit der Pinzette zu reißen, sondern auch extrahieren die fetten Körperzellen, die behindern die Eierstöcke aus der Antikörper. Erfolgreiche Durchführung dieses Schritts erfordert die...

Stammzellenforschung mit Drosophila Eierstöcke hat seit der ersten Dokumentation einer Stammzelle Nische1,2,3,4weit ausgebaut. Nach der Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung genetische Werkzeuge, Drosophila Eierstock, die Sezierungen häufig verwendet wurden, um die Stammzell-Linien zu studieren und Signalwege, die Stammzell-Wartung, Verbreitung und Schicksal in der Stammzellnische regulieren. Kenntnisse über diese Signalwege kann Einblicke in mögliche Ursachen von Krebserkrankungen hervorbringen, die von aberranten Stammzell-Aktivität5,6,7stammen. Es hat auch vor kurzem gezeigt, dass somatische Stammzellen im Eierstock Drosophila , bekannt als follikelstimulierendes Stammzellen (FSCs), stark Säugetier-intestinale Stammzellen in vielerlei Hinsicht von ihrer Organisation8ähneln. Aus diesem Grund sind Drosophila Eierstöcke sehr nützlich Modellsystem für Stammzell-Verhalten zu studieren.
Während Larven und Erwachsenen Eierstöcke bzw. Hinweise auf frühe Stammzell-Entwicklung und endgültige Stammzell-Organisation in der Nische bieten, ist die pupal Eierstock eine Zwischenkonstruktion in die Keimbahn und somatischen Zellen zu reorganisieren und ihre Identitäten zu schaffen 9 , 10. Obwohl mehrere Studien Aspekte der Gewebeentwicklung in den pupal Eierstock10,11,12,13 untersucht, bleiben Fragen hinsichtlich der Differenzierung und der räumlichen Organisation der Eierstock Zelltypen während der pupal Entwicklung. Insbesondere erfolgt die Spezifikation des FSCs in diesem Zeitraum. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sezieren und Färbung pupal Eierstöcke zu gewünschten Zeitpunkten – eine Technik, die in Zeit Kurs Experimente verwendet werden kann, die pupal Eierstock Entwicklung im Detail von den Larven zu Erwachsenen Stadium zu analysieren.
Um die geringe Größe, Transluzenz und Unzugänglichkeit des pupal Eierstocks innerhalb pupal Abdomen berücksichtigen, nutzt dieses Protokoll-Tools wie eine maßgeschneiderte dünne Spitze Pasteur pipettieren, Abdominal-Fett Körpergewebe behindern Antikörper Zugang zu entfernen die Eierstöcke. Eine klare, gekammerten Deckglas verwendet, während die Antikörper Färbung bietet größere Sichtbarkeit der Puppen und ein sanfter Plattform für Schaukeln die Eierstöcke auf eine "Nutator." Basierend auf ein Protokoll für die Larven Eierstock Sezierungen von Maimon und Gilboa14, eine relativ hohe Konzentration von Triton x-100 noch beschäftigt waren bei den ersten Schritten der Färbeverfahren Zellmembran Permeabilisierung und Antikörper Zugang zu maximieren die Eierstockkrebs Zellen.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Pinzette, Biologie</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glas Spot Platten</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipettenbirne</td><td>Verschiedene Anbieter Bunsenbrenner</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Mikroskop Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Glas Deckgläser Nr. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feiner Pinsel #0, #3-#5</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Enthält p20, p200, p1000 Pipettierer</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 15710</td><td>Verdünnen auf 4% Paraformaldehyd in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Verdünnen auf 1x PBS</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Verdünnen auf 10% Normales Ziegenserum in PBST mit 0,5% Tritonkonzentration</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper (im Protokoll: 7G10 Anti-Fasciclin III verdünnt 1:250, Kaninchen Anti-Phosphohiston H3 verdünnt 1:1000)</td><td>Verschiedene Anbieter (im Protokoll: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Verdünnt in PBST mit 0,5% Tritonkonzentration</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper (im Protokoll: Alexa-546, FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-Serum)</td><td>Verschiedene Anbieter (im Protokoll: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Verdünnung in PBST mit 0,5 % Tritonkonzentration</td></tr><tr><td>Fläschchen</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Wattebällchen, für breite Fläschchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Hefe, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenfutter</td><td>Im Labor</td><td></td> <td>hergestelltGemisch aus Wasser, Bierhefe, Maismehl, Melasse, Agar, EtOH, Penicillin, Methyl-4-hydrobenzoat und Propionsäure</td></tr><tr><td>Männliche und weibliche Drosophila Fliegen (im Protokoll verwendeter Genotyp: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Lager Zentrum</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

präparation und färbung von drosophila pupal eierstöcke

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Im Gegensatz zu Erwachsenen Drosophila Eierstöcke pupal Eierstöcke sind relativ schwierig zu untersuchen, aufgrund ihrer geringen Größe, Transluzenz und einem pupal Fall umschließt. Die Herausforderung sezieren pupal Eierstöcke liegt auch in ihrem physischen Standort innerhalb der Puppe: die Eierstöcke sind umgeben von Fetten Körperzellen innerhalb der pupal Abdomen, und diese Fettzellen entleert werden, um korrekte Antikörper Färbung zu ermöglichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt dieses Protokolls angepasste Pasteur Mehrkanalpipette um Fett Körperzellen vom pupal Abdomen zu extrahieren. Darüber hinaus einer gekammerten Deckglas anstelle von einem Microcentrifuge Schlauch bei der Färbung dient zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Puppen. Trotz dieser und andere Vorteile der in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge, kann erfolgreiche Durchführung dieser Techniken noch mehrere Tage der Praxis aufgrund der geringen Größe der pupal Eierstöcke beinhalten. In diesem Protokoll beschriebenen Techniken könnte zur Zeit Kurs Experimente gelten in denen Eierstöcke in verschiedenen Entwicklungsstadien pupal analysiert werden.

Erfolgreiche Ausführung dieser Prozedur sollte führen klar Antikörper Färbung, die die Struktur und die zelluläre Organisation eine Drosophila pupal Eierstock offenbart. Immunohistochemistry dieses Protokolls lässt sich Zelltypen häufig gebeizt in Larven und Erwachsenen Eierstöcke zu identifizieren. Zellen des pupal Stiels abgeleitet Schwarm Zellen18 (beschrieben von Fasciclin III in weiß) sind in Abbildung 3dargestellt. Neben...

Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Eierstöcke der Puppe von Drosophila zu präparieren und zu färben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklung der Biologie zu beantworten, wie z.B. die der Stammzelldifferenzierung und der Gewebeentwicklung im Modellorganismus Drosophila. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass anpassbare Werkzeuge verwendet werden, um der geringen Größe und der durchscheinenden Beschaffenheit der Puppen-Eierstöcke gerecht zu werden, die sonst schwer zu isolieren sind.Wir hatten die Idee, seine Methode zu verwenden, als wir Zeitverlaufsexperimente durchführten, um die Stammzellteilung im Eierstock während der Entwicklung der Puppendrosophila zu verfolgen. Zu Beginn des Protokolls kombinieren Sie 10 männliche und 15 weibliche adulte Drosophila-Fliegen in einem Fläschchen mit normalem, reichhaltigem Fliegenfutter, das mit Hefe ergänzt wurde. Lassen Sie die Eier drei bis vier Tage lang bei Zimmertemperatur zu Larven heranwachsen.Verwenden Sie nach drei bis vier Tagen eine feuchte feine Bürste mit weichen Borsten, um mit der Bürste eine rollende Bewegung entlang der Wand des Fläschchens auszuführen, um wandernde Larven des dritten Stadiums aus dem Fläschchen in eine Glasmulde zu bringen, die bis zum Rand mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS gefüllt ist. Waschen Sie die Speisereste von den Larven ab, indem Sie sie in eine andere Wanne geben, die mit 1X PBS gefüllt ist. Trennen Sie die männlichen und weiblichen Larven mit einer Pinzette.Identifizieren Sie die männlichen Larven durch ein Paar großer, runder und durchscheinender Hoden, die auf der lateralen Seite zwei Drittel von seinem vorderen Ende entfernt in den Fettkörper eingebettet sind. Sammeln Sie dann mindestens 10 Weibchen aus der Vertiefung und setzen Sie die weiblichen Larven in eine separate Vertiefung, gefüllt mit 1X PBS. Setzen Sie die weiblichen Larven mit einer Pinzette vorsichtig in ein neues Fläschchen mit frischem Fliegenfutter um, das mit Hefe ergänzt wird.Stellen Sie das Fläschchen mit den weiblichen Larven an einen dunklen Ort, um die Verpuppung zu erleichtern. Überwachen Sie die Larven den ganzen Tag über auf Verpuppung. Während jede Larve lobalisiert und sich zu einer Prä-Puppe entwickelt, umkreisen Sie die Prä-Puppe gegen das Fläschchen und notieren Sie die ungefähre Zeit, zu der sie sich zum ersten Mal zu einer Prä-Puppe formt.Schmelzen Sie die Glasspitze einer Pesterpipette über einem Bunsenbrenner. Wenn das Glas schmilzt, ziehe die Spitze mit einer Pinzette horizontal vom Rest der Pipette weg, um eine dünnere Spitze zu bilden. Brechen Sie nach dem Abkühlen einen kleinen Teil der Pipettenspitze ab, um eine saubere kreisförmige Öffnung zu bilden.Befestigen Sie eine Glühbirne am anderen Ende der Pipette und beladen Sie die Pipette mit 1X PBS. Um die Puppen zu entnehmen, die an die Wand des Fläschchens geklebt sind, tragen Sie einen kleinen Tropfen Wasser entlang der Kontaktzone zwischen Puppe und Durchstechflasche auf. Nachdem du den Proteinkleber ein bis zwei Minuten lang aufgelöst hast, hebst du die Puppe vorsichtig mit einer feuchten, feinen Bürste von der Wand.Übertragen Sie eine einzelne Puppe pro Mulde, die mit 1X PBS gefüllt ist. Während Sie das hintere Ende der Puppe mit einer Pinzette greifen, reißen Sie vorsichtig den vorderen Teil der Puppenhülle mit einem anderen Paar ab, bis der Kopf der Puppe sichtbar ist. Fassen Sie die vorderste Spitze des Puppenkopfes mit einer Pinzette und ziehen Sie die Puppe vorsichtig aus ihrer Puppenhülle.Trennen und entsorgen Sie dann die vordere Hälfte der Puppe von der hinteren Hälfte, bis nur noch der Bauchsack übrig bleibt. Fassen Sie den Bauchsack mit einer Pinzette in der einen Hand gegen den Boden der Vertiefung, während Sie in der anderen Hand die dünne, mit 1X PBS gefüllte Glaspipette halten. Richten Sie die dünne Pipettenspitze auf die Öffnung des Sacks und pipettieren Sie langsam 1X PBS in den Bauch, um die Fettkörperzellen, die die Puppen-Eierstöcke umgeben, wegzuspülen.Waschen Sie die Fettkörperzellen weg, bis mindestens zwei Drittel des Fettkörpers verschwunden sind oder bis die Eierstöcke in der Nähe der Öffnung des Bauchsacks sichtbar sind. Wenn die Eierstöcke in der Vertiefung nicht sichtbar sind, sollten sie im Bauch geblieben sein. Wenn die Eierstöcke herausgekommen sind, legen Sie eine neue Puppe in die Vertiefung und wiederholen Sie diesen Schritt.Bringen Sie den Bauch in eine durchsichtige, abgedeckte Glaskammer, die mit Fixierungspuffer gefüllt ist, und legen Sie den Deckel darauf. Sezieren Sie mehr Eierstöcke als nötig, um sicherzustellen, dass genügend Eierstöcke beim Färbe- und Einbettungsprozess stehen. Verwenden Sie während des Färbeprozesses eine Pinzette, um alle schwimmenden Eierstöcke vorsichtig auf den Boden der abgedeckten Glasvertiefung zu drücken, um sicherzustellen, dass die Eierstöcke vollständig in Antikörperlösung eingetaucht sind.Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die ebene Oberfläche des neuen Titers und legen Sie dann das gekammerte Deckglas mit den Eierstöcken und dem Fixierungspuffer auf die Klebefläche. Inkubieren Sie die Eierstöcke 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in Fixationspuffer. Spülen Sie anschließend die Eierstöcke dreimal in 1X PBS mit 1% Triton X-100 oder 1% PBST für fünf, 10 bzw. 45 Minuten, um eine gründliche Permeabilisierung zu ermöglichen.Verschließen Sie die Eierstöcke 30 Minuten lang mit 10 % normalem Ziegenserum in 0,5 % PBST. Dann inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht in 600 Mikrolitern Primärantikörper in 0,5 % PBST bei 4 % Celsius. Spülen Sie die Eierstöcke am nächsten Tag dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,5 % PBST.Inkubieren Sie die Eierstöcke zwei Stunden lang in 600 Mikrolitern Sekundärantikörper, verdünnt in 0,5 % PBST bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Eierstöcke nach der Inkubation zweimal für fünf Minuten in 0,5 % PBST und einmal für fünf Minuten in 1X PBS. Geben Sie einen kleinen Tropfen 1X PBS auf einen Objektträger.Übertragen Sie den Bauchsack mit einer Pinzette aus dem gekammerten Deckglas in ein Glas, das mit 1x PBS gefüllt ist. Reißen Sie den Bauchsack und den restlichen Fettkörper mit einer Pinzette auseinander. Übertragen Sie die Eierstöcke aus der Vertiefung in einen Tropfen von 1x PBS auf den Objektträger, indem Sie die Mitte der Eierstöcke zwischen den Spitzen der Pinzette greifen.Geben Sie ein paar Tropfen 1X PBS auf den Objektträger, wenn die Lösung trocknet. Nachdem alle Eierstöcke präpariert und auf den Objektträger übertragen wurden, pipettieren Sie 40 Mikroliter Eindeckmedium auf ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas und legen Sie das Deckglas vorsichtig auf die Eierstöcke. Lassen Sie den Objektträger schließlich über Nacht trocknen, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen.Immunhistochemie, die spezifisch für die Zellproliferation ist, wie z. B. die Phospho-Histon-H3-Färbung, kann verwendet werden, um Zellteilungsmuster von Stammzellen und anderen mitotisch aktiven Zelltypen zu untersuchen. Puppenstielzellen, die aus Schwarmzellen gewonnen werden, können mit Fasciclin III-Färbung umrissen werden. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es am besten, mehr PB zu ernten und zu sezieren, als für das Experiment benötigt wird, da einige Eierstöcke während der Fettkörperextraktion oder des immunhistochemischen Prozesses verloren gehen können.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg beim Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wie Nischen und Stammzellen während der Entwicklung bilden eine wichtige Frage mit praktischen Auswirkungen.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

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Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

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