Name: Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Färbung von Drosophila-Pupal-Eierstöcken für die Stammzellforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Stammzellnischenentwicklung mit anpassbaren Werkzeugen.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (RO1 GM079351, DK). Wir danken für ihre hilfreichen Ratschläge auf pupal Eierstock Sezierungen basierend auf ihrem ursprünglichen Protokoll Dorothea Godt. Wir danken auch Amy Reilein für ihre Hilfe und Kommentare auf das Manuskript.

(1) EggLaying
<ol><li>Kombinieren Sie etwa zehn männlichen und 15 weiblichen Erwachsenen Drosophila -fliegen des gewünschten Genotyps in ein Fläschchen mit normalen reichen fliegen Lebensmittel mit Hefe ergänzt. Um zu vermeiden, Überbelegung der Durchstechflasche, ermöglichen Sie begatteten Weibchen zur Eiablage nicht länger als 2 – 4 h14.</li>
	<li>Übertragen Sie die Erwachsenen aus dem Fläschchen in ein neues Fläschchen durch Tippen auf das Fläschchen öffnen gegen ein anderes Fläschchen mit fliegen Essen. Lassen Sie die Eiern, Larven bei Raumtemperatur für 3 – 4 Tage zu entwickeln.</li>
</ol>2. Auswahl der weiblichen Larven
<ol><li>Mit einem feuchten feinen Pinsel mit weichen Borsten, machen Sie eine rollende Bewegung mit dem Pinsel entlang der Wand des Röhrchens, wandernde dritte Instar Larven aus dem Fläschchen auf ein Glas gut gefüllt bis zum Rand mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen. Waschen Sie die Speisereste aus den Larven, indem Sie sie zu einem anderen gut gefüllt mit 1 X PBS übertragen.</li>
	<li>Die männlichen und weiblichen Larven mit Pinzette zu trennen. Identifizieren Sie die männlichen Larven durch ein paar große, Runde und transluzenten Hoden eingebettet in Fett Körper an der lateralen Seite des Körpers etwa zwei Drittel nach unten aus seiner vorderen Ende15. Weiblichen Larven sind durchschnittlich größer, weniger transparent als die Männchen und haben viel kleinere Gonaden, die schwieriger zu erkennen sind.</li>
	<li>Wählen Sie gegen männliche Larven, weiblichen Larven zu sammeln. Sammeln Sie mindestens zehn Frauen aus dem Brunnen. Legen Sie die weiblichen Larven in einem separaten, gut gefüllt mit 1 X PBS.</li>
	<li>Mit Hefe ergänzt Verwendung Zangen, die weiblichen Larven sanft in ein neues Fläschchen Fliege Frischkost zu übertragen.</li>
	<li>Platzieren Sie das Fläschchen mit den weiblichen Larven an einem dunklen Ort, Pupariation16zu erleichtern. Im Laufe des Tages überwachen Sie die Larven für Pupariation. Da jede Larve lähmt und entwickelt sich zu einem Prepupa, Kreis Prepupa gegen das Fläschchen und notieren Sie die ungefähre Zeit wenn es zuerst in ein Prepupa bildet. Prepupae durch die Vorwölbung des vorderen Luftlöcher und Timing der Puppenkammer Bildung17zu identifizieren. Lassen Sie die Prepupae, um den gewünschten Zeitpunkt (gemessen in Stunden nach Puppenkammer Bildung, APF) zu entwickeln. Hinweis: Jedes Tier, das Puppenkammer Bildung innerhalb eines ca. 10 h Intervalls unterziehen kann ein Prepupa betrachtet werden. Das Puppenstadium beginnt ca. 12 h nach der Puppenkammer Bildung nach einer internen Häutung stattgefunden hat.</li>
</ol>3. Vorbereitung Puppen Antikörper Färbung
<ol><li>
Bilden Sie ein dünnes Glas Pipettieren in späteren Schritten verwendet werden, für die pupal fetten Körper ausräumen.
	<ol>
<li>Schmelzen Sie die Glas-Tipp von einem Pasteur Pipettieren bei einem Bunsenbrenner. Als das Glas schmilzt, verwenden Sie Zange um die Spitze horizontal Weg vom Rest des Pipettieren eine dünnere Spitze bilden ziehen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen, brechen Sie einen kleinen Teil der Pipettieren Spitze, eine nette Runde Öffnung zu bilden. Legen Sie eine Glühbirne an das andere Ende der pipettieren.</li>
		<li>Laden Sie das Pipettieren mit 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Puppen zu ernten, die an der Wand des Röhrchens geklebt sind, wenden Sie einen kleinen Tropfen des Wassers entlang der Kontaktzone zwischen Puppe und Fläschchen. 1 – 2 min. warten, bis das Protein lassen Kleber auflösen bevor Sie die Puppe von der Wand mit einem feuchten, feinen Pinsel sanft anheben. Die Puppe mit einem Glas gut gefüllt mit 1 X PBS zu übertragen. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Während das hintere Ende der Puppe mit einem paar der Zange greifen, reißen Sie den vorderen Teil der pupal Fall mit einem anderen paar vorsichtig bis der Kopf der Puppe sichtbar ist.</li>
	<li>Greifen Sie anterior-die meisten Tipp des pupal Kopfes mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Puppe aus ihrer pupal Fall. Hinweis: Ein Teil des Körpers Fett kann während dieses Vorgangs ergießen.</li>
	<li>Trennen und entsorgen der vorderen Hälfte der Puppe aus der hinteren Hälfte, bis nur der Bauch Plünderung übrig bleibt.</li>
	<li>
Der Bauch Plünderung entziehen Sie die Zellen Fett.
	<ol>
<li>Erfassen der Abdominal-Plünderung gegen die Unterseite des Brunnens mit Zange in der Hand halten Sie das Dünnglas Pipettieren mit 1 X PBS in einer anderen Hand gefüllt.</li>
		<li>Ziel ist die dünne Pipettieren Spitze in Richtung der Öffnung der Sack und langsam Pipettieren 1 X PBS in den Bauch der fetten Körperzellen umgebenden pupal Eierstöcke abzuwaschen. Hinweis: Die Eierstöcke sind ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen, die im Inneren der Abdominal-Plünderung bleiben sollten.</li>
		<li>Waschen Sie ab, die fetten Körper Zellen bis mindestens zwei Drittel des Körpers Fett ist Weg oder die Eierstöcke nahe der Öffnung der Abdominal-Sack sichtbar sind. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt langsam ausführen um nicht die Eierstöcke aus dem Bauch durch Zufall zu waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prüfen Sie den Brunnen zu überprüfen, ob die Eierstöcke während der Zelle Fett Duschgel heraus verschüttet haben. Wenn die Eierstöcke nicht sichtbar innerhalb des Brunnens sind, sollten sie im Bauch geblieben sind. Wenn die Eierstöcke herausgekommen sind, legen Sie eine neue Puppe in den Brunnen und wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Übertragen Sie den Bauch in eine klare Deckglas Kammer gefüllt mit Fixierung-Puffer (1 X PBS, 4 % Paraformaldehyd) und setzen Sie den Deckel an der Spitze. Um zu gewährleisten eine ausreichende Anzahl von Eierstöcken widerstehen Färbung und Montageprozess, sezieren mehr Eierstöcke als nötig. Achtung: Die Fixierung Puffer enthält Paraformaldehyd, die giftig ist. Bitte tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille, etc..</li>
</ol>4. Immunhistochemie
<ol><li>Während der gesamten Färbung verwenden Sie Zange, um drücken Sie vorsichtig alle schwimmenden Eierstöcke an der Unterseite des Brunnens Deckglas um sicherzustellen, dass die Eierstöcke komplett in Antikörperlösung eingetaucht sind.</li>
	<li>Ortund Streifen doppelseitiges Klebeband auf die flache Oberfläche des einen Nutator, dann legen die gekammerten Deckglas auf der Klebefläche.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke im Fixierung Buffer Schritt 3.7 für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke dreimal in 1 X PBS mit 1 % Triton x-100 für 5, 10 und 45 min (1 h insgesamt), bzw. um gründliche Permeabilisierung zu ermöglichen.</li>
	<li>Blockieren die Eierstöcke bei 10 % normalem Ziegenserum mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 für 30 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht in 600 µL Primärantikörper Wahl verdünnt, um die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei 4 ° C.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke drei Mal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke für 2 h in 600 µL Sekundärantikörper Wahl auf die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei Raumtemperatur verdünnt.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke zweimal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 und einmal für 5 min in 1 X PBS.</li>
</ol>5. zerlegen und montieren Pupal Eierstöcke
<ol><li>Geben Sie einen kleinen Tropfen 1 X PBS auf einen Objektträger. Verwendung Zange übertragen der Abdominal-Plünderung von den Kammern Deckglas auf ein Glas gut gefüllt mit 1 X PBS. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Zerreißen der Abdominal-Plünderung und alle restlichen Fett mit der Pinzette. Hinweis: Die Eierstöcke, die ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen sind, sollten innerhalb des Brunnens sichtbar. Die Eierstöcke sind oft eng von den fetten Körper umgeben, so ist es wichtig, dass alle fetten Körper ist gründlich zerrissen auseinander.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eierstöcke aus dem Brunnen in den Tropfen 1 x PBS am Mikroskop schieben Sie durch das Zentrum der Eierstöcke zwischen den Spitzen der Zange greifen. Es ist sehr wichtig, einen festen Griff ohne zu quetschen die Eierstöcke zu verwenden, um nicht zu verlieren oder zerstören sie während der Übertragung. Fügen Sie ein paar Tropfen 1 X PBS zur Folie hinzu, wenn die Lösung im Laufe der Zeit austrocknet.</li>
	<li>Sobald alle Eierstöcke seziert und auf den Objektträger Pipettieren 40 µL Eindeckmedium auf einem Ort das Deckglas vorsichtig auf die Eierstöcke und 22 x 22 mm Deckglas übertragen wurden. Lassen Sie die Folie über Nacht trocknen vor der Bildgebung.</li>
</ol>

<ol><li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21763616">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li>
<li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ovary%3A+an+active+stem+cell+community%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li>
<li>Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Germline+Stem+Cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Germline Stem Cells in Drosophila.</a> Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).</li>
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<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+myeloid+leukemia%3A+proving+ground+for+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells.</a> Cell. 119 (3), 314-316 (2004).</li>
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<li>Irizarry, J., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+supports+Drosophila+fertility+by+regulating+development+of+ovarian+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues.</a> Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Staining+of+Drosophila+Larval+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries.</a> J Vis Exp. (51), e2537(2011).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li>
<li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).</li>
<li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bric+%C3%A0+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB%2FPOZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li>
<li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INSECT+FAT+BODY%3A+ENERGY%2C+METABOLISM%2C+AND+REGULATION%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/fat-body-development-and-its-function-in-energy-storage-and-nutrient-sensing-in-drosophila-melanogaster-2157-7552.1000141.php?aid=36443">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li>
<li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2504450/">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52(2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Der kritische und schwierige Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Vorbereitung der pupal Eierstöcke vor der Fixierung. Um sicherzustellen, dass die Eierstöcke, kleine und begraben durch Fett Körperzellen in den pupal Bauch ausreichend mit Antikörpern gefärbt sind, ist es wichtig, nicht nur eine große Öffnung in der abdominalen Plünderung mit der Pinzette zu reißen, sondern auch extrahieren die fetten Körperzellen, die behindern die Eierstöcke aus der Antikörper. Erfolgreiche Durchführung dieses Schritts erfordert die...

Stammzellenforschung mit Drosophila Eierstöcke hat seit der ersten Dokumentation einer Stammzelle Nische1,2,3,4weit ausgebaut. Nach der Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung genetische Werkzeuge, Drosophila Eierstock, die Sezierungen häufig verwendet wurden, um die Stammzell-Linien zu studieren und Signalwege, die Stammzell-Wartung, Verbreitung und Schicksal in der Stammzellnische regulieren. Kenntnisse über diese Signalwege kann Einblicke in mögliche Ursachen von Krebserkrankungen hervorbringen, die von aberranten Stammzell-Aktivität5,6,7stammen. Es hat auch vor kurzem gezeigt, dass somatische Stammzellen im Eierstock Drosophila , bekannt als follikelstimulierendes Stammzellen (FSCs), stark Säugetier-intestinale Stammzellen in vielerlei Hinsicht von ihrer Organisation8ähneln. Aus diesem Grund sind Drosophila Eierstöcke sehr nützlich Modellsystem für Stammzell-Verhalten zu studieren.
Während Larven und Erwachsenen Eierstöcke bzw. Hinweise auf frühe Stammzell-Entwicklung und endgültige Stammzell-Organisation in der Nische bieten, ist die pupal Eierstock eine Zwischenkonstruktion in die Keimbahn und somatischen Zellen zu reorganisieren und ihre Identitäten zu schaffen 9 , 10. Obwohl mehrere Studien Aspekte der Gewebeentwicklung in den pupal Eierstock10,11,12,13 untersucht, bleiben Fragen hinsichtlich der Differenzierung und der räumlichen Organisation der Eierstock Zelltypen während der pupal Entwicklung. Insbesondere erfolgt die Spezifikation des FSCs in diesem Zeitraum. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sezieren und Färbung pupal Eierstöcke zu gewünschten Zeitpunkten – eine Technik, die in Zeit Kurs Experimente verwendet werden kann, die pupal Eierstock Entwicklung im Detail von den Larven zu Erwachsenen Stadium zu analysieren.
Um die geringe Größe, Transluzenz und Unzugänglichkeit des pupal Eierstocks innerhalb pupal Abdomen berücksichtigen, nutzt dieses Protokoll-Tools wie eine maßgeschneiderte dünne Spitze Pasteur pipettieren, Abdominal-Fett Körpergewebe behindern Antikörper Zugang zu entfernen die Eierstöcke. Eine klare, gekammerten Deckglas verwendet, während die Antikörper Färbung bietet größere Sichtbarkeit der Puppen und ein sanfter Plattform für Schaukeln die Eierstöcke auf eine "Nutator." Basierend auf ein Protokoll für die Larven Eierstock Sezierungen von Maimon und Gilboa14, eine relativ hohe Konzentration von Triton x-100 noch beschäftigt waren bei den ersten Schritten der Färbeverfahren Zellmembran Permeabilisierung und Antikörper Zugang zu maximieren die Eierstockkrebs Zellen.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Pinzette, Biologie</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glas Spot Platten</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipettenbirne</td><td>Verschiedene Anbieter Bunsenbrenner</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Mikroskop Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Glas Deckgläser Nr. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feiner Pinsel #0, #3-#5</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Enthält p20, p200, p1000 Pipettierer</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 15710</td><td>Verdünnen auf 4% Paraformaldehyd in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Verdünnen auf 1x PBS</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Verdünnen auf 10% Normales Ziegenserum in PBST mit 0,5% Tritonkonzentration</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper (im Protokoll: 7G10 Anti-Fasciclin III verdünnt 1:250, Kaninchen Anti-Phosphohiston H3 verdünnt 1:1000)</td><td>Verschiedene Anbieter (im Protokoll: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Verdünnt in PBST mit 0,5% Tritonkonzentration</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper (im Protokoll: Alexa-546, FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-Serum)</td><td>Verschiedene Anbieter (im Protokoll: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Verdünnung in PBST mit 0,5 % Tritonkonzentration</td></tr><tr><td>Fläschchen</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Wattebällchen, für breite Fläschchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Hefe, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenfutter</td><td>Im Labor</td><td></td> <td>hergestelltGemisch aus Wasser, Bierhefe, Maismehl, Melasse, Agar, EtOH, Penicillin, Methyl-4-hydrobenzoat und Propionsäure</td></tr><tr><td>Männliche und weibliche Drosophila Fliegen (im Protokoll verwendeter Genotyp: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Lager Zentrum</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

präparation und färbung von drosophila pupal eierstöcke

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Im Gegensatz zu Erwachsenen Drosophila Eierstöcke pupal Eierstöcke sind relativ schwierig zu untersuchen, aufgrund ihrer geringen Größe, Transluzenz und einem pupal Fall umschließt. Die Herausforderung sezieren pupal Eierstöcke liegt auch in ihrem physischen Standort innerhalb der Puppe: die Eierstöcke sind umgeben von Fetten Körperzellen innerhalb der pupal Abdomen, und diese Fettzellen entleert werden, um korrekte Antikörper Färbung zu ermöglichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt dieses Protokolls angepasste Pasteur Mehrkanalpipette um Fett Körperzellen vom pupal Abdomen zu extrahieren. Darüber hinaus einer gekammerten Deckglas anstelle von einem Microcentrifuge Schlauch bei der Färbung dient zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Puppen. Trotz dieser und andere Vorteile der in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge, kann erfolgreiche Durchführung dieser Techniken noch mehrere Tage der Praxis aufgrund der geringen Größe der pupal Eierstöcke beinhalten. In diesem Protokoll beschriebenen Techniken könnte zur Zeit Kurs Experimente gelten in denen Eierstöcke in verschiedenen Entwicklungsstadien pupal analysiert werden.

Erfolgreiche Ausführung dieser Prozedur sollte führen klar Antikörper Färbung, die die Struktur und die zelluläre Organisation eine Drosophila pupal Eierstock offenbart. Immunohistochemistry dieses Protokolls lässt sich Zelltypen häufig gebeizt in Larven und Erwachsenen Eierstöcke zu identifizieren. Zellen des pupal Stiels abgeleitet Schwarm Zellen18 (beschrieben von Fasciclin III in weiß) sind in Abbildung 3dargestellt. Neben...

Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Eierstöcke der Puppe von Drosophila zu präparieren und zu färben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklung der Biologie zu beantworten, wie z.B. die der Stammzelldifferenzierung und der Gewebeentwicklung im Modellorganismus Drosophila. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass anpassbare Werkzeuge verwendet werden, um der geringen Größe und der durchscheinenden Beschaffenheit der Puppen-Eierstöcke gerecht zu werden, die sonst schwer zu isolieren sind.Wir hatten die Idee, seine Methode zu verwenden, als wir Zeitverlaufsexperimente durchführten, um die Stammzellteilung im Eierstock während der Entwicklung der Puppendrosophila zu verfolgen. Zu Beginn des Protokolls kombinieren Sie 10 männliche und 15 weibliche adulte Drosophila-Fliegen in einem Fläschchen mit normalem, reichhaltigem Fliegenfutter, das mit Hefe ergänzt wurde. Lassen Sie die Eier drei bis vier Tage lang bei Zimmertemperatur zu Larven heranwachsen.Verwenden Sie nach drei bis vier Tagen eine feuchte feine Bürste mit weichen Borsten, um mit der Bürste eine rollende Bewegung entlang der Wand des Fläschchens auszuführen, um wandernde Larven d

dissection-and-staining-of-drosophila-pupal-ovaries

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wie Nischen und Stammzellen während der Entwicklung bilden eine wichtige Frage mit praktischen Auswirkungen.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Das Ziel dieser Technik ist es, Forschern die Möglichkeit zu geben, Puppenaugenscheiben jeden Alters zu dissektionieren, Immunfärbung  und Montage von Puppenaugenscheiben durchzuführen.

Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

Die in diesem Protokoll beschriebene aufrechte Bildgebungsmethode ermöglicht die detaillierte Visualisierung der Pole eines sich entwickelnden Drosophila melanogaster-Eies.  Diese End-on-Ansicht bietet eine neue Perspektive auf die Anordnungen und Morphologien mehrerer Zelltypen im follikulären Epithel.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Es wird ein Protokoll der Ganzbett-Immunfärbung an Blattlausembryonen vorgestellt, in dem kritische Bedingungen für die Verringerung der Hintergrundfärbung und die Erhöhung der Gewebepermeabilität behandelt werden. Diese Bedingungen wurden speziell für den effektiven Nachweis der Proteinexpression im embryonalen Gewebe von Blattläusen entwickelt.

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Präparation, Fixierung und Immunfärbung von steroidogenen Organen in Drosophila - Larven und erwachsenen Frauen Steroidhormon - Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus zu studieren. Neben steroidogenen Organe visualisieren wir die Innervation steroidogenen Organe sowie steroidogenen Zielzellen wie Keimbahn-Stammzellen.

Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Das Ziel dieses Protokolls ist es, live Bildgebung zu verwenden, um die Auswirkungen von oxidativen Schäden auf die Lokalisierung und Dynamik subzellulärer Strukturen in Drosophila-Ovarien zu visualisieren.

Visualisierung der Auswirkungen oxidativer Schäden auf Drosophila-Eierkammern mit Live Imaging

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell, um die grundlegenden Mechanismen der Myogenese zu verstehen. Dieses Protokoll für die Dissektion und Präparation von Thorax-Hemisektionen ermöglicht die mikroskopische Analyse des indirekten Flugmuskels sowohl im Puppen- als auch im Erwachsenenstadium. Dieses Protokoll ermöglicht die konfokale Bildgebung der zellulären Morphologie, der Proteinlokalisierung, der Muskelstruktur und mehrerer anderer Aspekte der Myogenese.

Dissektion von Drosophila melanogaster Indirekte Flugmuskulatur für Mikroskopie-Ansätze

Lernen Sie die Präparation und Färbung von Drosophila-Pupal-Eierstöcken für die Stammzellforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Stammzellnischenentwicklung mit anpassbaren Werkzeugen.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

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