Quantitative Messung der γ-Sekretase-vermittelten Amyloid-Precursor-Protein und Notch Spaltung in zellbasierten Luciferase Reporter Assay Plattformen

Das übergeordnete Ziel dieses quantitativen zellbasierten Reportergen-Assays für Gamma-Sekretase ist es, die unterschiedliche Wirkung von putativen Gamma-Sekretase-Modulatoren auf die Gamma-Sekretase-vermittelte Spaltung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Alzheimer-Krankheit zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung neuer Gamma-Sekretase-Modulatoren für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein hocheffizientes Assay-System handelt, mit dem Gamma-Sekretase-Modulatoren leicht identifiziert werden können.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie der Alzheimer-Krankheit durch die potenzielle Entdeckung von Anti-AD-Medikamenten mit minimalen Nebenwirkungen. Diese Methode kann Aufschluss über die Substratselektivität der Gamma-Sekretase geben. Es kann auch auf die Untersuchung anderer Krankheiten, wie z. B. des Neuroblastoms, angewendet werden.

Personen, die neu in dieser Methode sind, können Schwierigkeiten haben, das Zellkulturmedium vorsichtig zu entfernen und zu 96 Mikroplatten hinzuzufügen, da zu viel Störung das Endergebnis verkomplizieren kann. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von NG- und CG-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Zählen Sie NG- oder CG-Zellen mit einem Hämozytometer.

Anschließend säen Sie die Zellen mit 20.000 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well-Mikroplatten mit einem Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung in Wachstumsmedium aus. Bringen Sie die Mikrotiterplatten in einen befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht 100 Mikroliter Wachstumsmedium aus jeder Vertiefung.

Fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung Wachstumsmedium hinzu, das zwei Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin mit entweder 0,2 % Dimethylsulfoxid, zwei mikromolaren CL-387, 785, zwei mikromolaren DAPT oder anderen verwandten ErbB1/ErbB2-Inhibitoren enthält. Inkubieren Sie die behandelten Zellen und Mikrotiterplatten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation 150 Mikroliter Wachstumsmedium pro Vertiefung aus den Mikrotiterplatten.

Fügen Sie dann 50 Mikroliter Luciferase-Assay-Reagenz pro Vertiefung hinzu. Übertragen Sie dann die Mikroplatten in einen Lumineszenz-Mikroplatten-Reader und halten Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Bestimmen Sie die von Glühwürmchen emittierte Luziferase emittierte Lumineszenz mit einem vordefinierten Programm, das im Lumineszenz-Mikroplatten-Reader gespeichert ist.

Öffnen Sie zunächst die Gerätesteuerungssoftware. Wählen Sie dann im Menü "Werkzeug" die Option "Luminometrie" aus. Wählen Sie unter der Einstellung Parameter die Option Kein Filter für Emissionsfilter, aktivieren Sie Normal für die Emissionsblende, geben Sie eine für die Zählzeit ein und klicken Sie auf OK, um die Lumineszenzmessung einzurichten.

Scrollen Sie auf der Registerkarte Gerätesteuerung durch die Liste der aktiven Protokolle und wählen Sie das vorgespeicherte Protokoll zum Lesen der Lumineszenz aus. Definieren Sie auf der Registerkarte Live-Anzeige den Maßstab aus dem Pulldown-Menü, und wählen Sie Logarithmus oder Linear als Typ aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Temperatur die Option Aus für Plattenheizung aus.

Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Start, um die Lumineszenzmessung durchzuführen. Exportieren Sie die Ergebnisse in ein Tabellenkalkulationsformat mit dem Explorer, der in die Steuerungssoftware eingebettet ist. Schätzen Sie die Hintergrundlumineszenz von CG- oder NG-Zellen, die mit Wachstumsmedium behandelt wurden, das kein Tetracyclin enthält.

Definieren Sie ein Lumineszenzsignal, das von CG- oder NG-Zellen emittiert wird, die mit 0,1 % DMSO in einem Wachstumsmedium behandelt wurden, das nur ein Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin enthält, als 100 % relative Gamma-Sekretase-Aktivität. Normalisieren Sie schließlich Luciferase-Signale von CG- oder NG-Zellen, die mit Wachstumsmedium kultiviert wurden, das Tetracyclin und entweder CL-387, 785 oder DAPT enthält, auf das Luciferase-Signal, das von DMSO-behandelten CG- oder NG-Zellen emittiert wird. Hier sind repräsentative Ergebnisse zu sehen, die die quantitativen Messungen der Gamma-Sekretase-Spaltung von APP-C99 in den CG-Zellen demonstrieren.

Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit einem Mikromolar CL-387, 785 oder DAPT in Gegenwart von einem Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin bei 37 Grad Celsius behandelt. Die Lumineszenz, die aus der Gamma-Sekretase-vermittelten Proteolyse von C99-GV stammt, wurde nach Zugabe von 100 Mikrolitern pro Vertiefung des Luciferase-Assay-Reagenzes quantifiziert. Das Luciferase-Signal, das von Zellen ausgesendet wird, die nur mit Vehikel behandelt wurden, wurde auf 100% relative Lumineszenz festgelegt.

Repräsentative Ergebnisse, die die quantitativen Messungen der Gamma-Sekretase-Spaltung von N-delta-E in den NG-Zellen demonstrieren, sind hier dargestellt. In ähnlicher Weise wurden die Zellen 24 Stunden lang mit einem Mikromolar CL-387, 785 oder DAPT in Gegenwart von einem Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin bei 37 Grad Celsius behandelt. Die Lumineszenz, die aus der Gamma-Sekretase-vermittelten Proteolyse von N-delta-E-GV abgeleitet wurde, wurde nach Zugabe von 100 Mikrolitern pro Vertiefung des Luciferase-Assay-Reagenzes quantifiziert.

Das Luciferase-Signal, das von Zellen ausgesendet wird, die nur mit Vehikel behandelt wurden, wurde auf 100% relative Lumineszenz festgelegt. Einmal gemeistert, erfordert diese Technik nur eine praktische Zeit von ein bis zwei Stunden, abhängig von der Anzahl der zu untersuchenden Verbindungen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik dem Forscher auf dem Gebiet der Alzheimer-Krankheit den Weg, den genetischen und chemischen Modifikator der Gamma-Sekretase zu erforschen, um neuartige Therapeutika für die Alzheimer-Krankheit zu entwickeln.