Name: Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Erfahren Sie, wie Reporter-Enzym-Fluoreszenz-Imaging zur sensiblen Detektion von Mycobacterium tuberculosis in präklinischen Mausmodellen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht Langzeitstudien zur Pathogenese und Therapieentwicklung.

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Tierexperimentellen Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften, die durch die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee of Texas A & M University durchgeführt. Prüfung und Genehmigung von Biohazard Sicherheitsbeauftragten oder Ausschuss in Ihrer Institution sein erforderlich.
Achtung: Alle Verfahren erfordern BSL3 Containment. Die Mitarbeiter sind verpflichtet, persönlichen Schutzausrüstung zu allen Zeiten zu tragen. Alle Manipulationen sind innen Biosafety Cabinet (BSC) durchgeführt und alle Kleie in Sharps Container entsorgt werden. Arbeit Oberflächen und BSC werden vor Beginn der Arbeit und nach der Arbeit mit gepuffertem Phenol und 70 % Ethanol gereinigt. Verfahren würde normalerweise auf Sicherheitsstufe 3 mit Mycobacterium Tuberculosiserfolgen, sondern für Illustration und Dreharbeiten Zwecke, veranschaulichen die Autoren diese Verfahren auf Biosafety Niveau 2 mit weniger virulenten Bakterien.
(1) Stämme und Kultur Bedingungen
Hinweis: M. Tuberculosis Stamm CDC1551 wird in dieser Studie verwendet, aber jede M. Tuberculosis -Belastung kann auf die gleiche Weise verwendet werden.
<ol><li>Wachsen die Bakterien in M-OADC-TW (7H 9 Brühe ergänzt mit 0,5 % Glycerin, 10 % Ölsäure Traubenzucker komplexe ohne Katalase und 0,05 % Tween-80) mittlere stehen bei 37 ° C auf einem OD-600 von 0,5 (~ 0,2 x 107 KBE).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Kultur in M-OADC-TW (Reihe von 01:10 Verdünnungen der Bakterien). Platte die Verdünnungen der Bakterien (105, 106107108) in dreifacher Ausfertigung auf selektive 7 H 11 Platten erlauben die Bestimmung der KBE.</li>
	<li>Vier Wochen bei 37 ° C oder bis Kolonien genau gezählt werden können inkubieren Sie die Platten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das bakterielle Inokulum 8.534 x g für 5 min um eine Kugel zu erhalten. Waschen Sie die Tablette einmal mit 10 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und wieder auszusetzen das Pellet in 15 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).</li>
</ol>(2) Aerosol Infektion der Mäuse mit einer Madison-Kammer
<ol><li>Können Sie Mäuse, für eine Woche an die neue Umgebung gewöhnen.</li>
	<li>Wiegen Sie die Mäuse vor dem Laden sie in die Kammer.</li>
	<li>Drei Kabel in die Steckerleiste anschließen: die Hauptkammer macht, die Vakuumpumpe und der Luft-Kompressor, in dieser Reihenfolge.</li>
	<li>Schrauben Sie vorsichtig das Glasgefäß. Bringen das Glasgefäß zum Schrank Biosafety und fügen Herausforderung Inokulum ausgesetzt in 15 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) zu erreichen ~ 104 - 106 KBE von Bakterien in der Lunge.</li>
	<li>Schließen Sie den Deckel von Glas im Kabinett der Biosicherheit. Legen Sie das Glas auf die Verneblereinheit und stellen Sie das vertikale Edelstahlrohr so ein, dass das untere Ende (Intake) etwa ein Viertel eines Zoll unter dem Niveau der Flüssigkeit im Glas ist.</li>
	<li>Laden Sie alle Tiere, die notwendig für das Experiment (Saal fasst bis zu 90 Mäuse) in die Kammer und schließen Sie die Riegel an der Tür.</li>
	<li>Überprüfen Sie die wichtigsten (Raum) air-Flow-Meter. Stellen Sie sicher, dass das Zentrum des Schwimmers (Kugel) ca. 50 L/min, gemessen auf der Skala auf der linken Seite betreibt.</li>
	<li>Drücken Sie die Schaltfläche "Start" auf dem Bedienfeld der Kammer. Legen Sie die Luftmenge durch den Kompressor Luft Durchflussmesser (die kleineren m links) als 4 L/min auf die Waage. Überprüfen Sie visuell, um sicherzustellen, dass die Herausforderung Inokulum vernebelt wird.</li>
	<li>Nach 15 min Wenn das rote Licht an der Vorderseite des Bedienfelds angezeigt wird und ein akustisches Signal das Ende des Laufs zeigt, Taste Reset auf der unteren rechten Ecke des Bedienfelds um den Timer zurückzusetzen.</li>
	<li>Halten Sie den kleinen roten Knopf an der Tür der Kammer, das Vakuum zu lösen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Tür und entfernen Sie die Tiere. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihren Käfigen.</li>
	<li>Zerstäuber Glas zu entfernen und in einem geschlossenen, auslaufsicheren Behälter legen. Stellen Sie den Behälter in die Bio-Sicherheit-Schrank und entsorgen Sie die Herausforderung-Suspension in einen dafür vorgesehenen Abfallbehälter.</li>
	<li>Legen Sie das gebrauchte Vernebler Glas innen ein Biohazard Beutel und Verschließen der Tasche für den Transport zu den Autoklaven.</li>
	<li>Am Ende des Verfahrens Infektion sprühen Sie das Innere der Kammer mit gepuffertem Phenol und 70 % Ethanol und lassen Sie die Kammer für 10 min sitzen.</li>
	<li>Dann wischen Sie alle zugänglichen Innenflächen sehr gründlich. Entsorgen Sie alle kontaminierten Papierhandtücher, etc.. in den Biohazard-Papierkorb. Autoklaven den Papierkorb, Abfallbehälter und Vernebler Gläser verwendet.</li>
	<li>Platziere die Tiere zurück in das Containment-Zimmer bis zu den bildgebenden Zeit-Punkt.</li>
	<li>Am Tag der Bildgebung übertragen Sie die Tiere in einem sekundären Container auf den bildgebenden Raum.</li>
</ol>3. Tier Anästhesie
<ol><li>Die Mäuse mit Isofluran verwenden eine benutzerdefinierte Gasanlage Anästhesie zu betäuben.</li>
	<li>Wiegen Sie jedes der zwei Aktivkohlefilter Kanister befindet sich oben auf die Anästhesie-Einheit.</li>
	<li>Ersetzen Sie durch einen neuen Kanister, wenn das Gewicht 50 g über das Ausgangsgewicht ist.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Vaporizer Gerät dafür ausreichend Isofluran für das Verfahren.</li>
	<li>Platzhalter in der bildgebenden Kammer Bugnase. Legen Sie die Anzahl der Nase Kegel für das Verfahren erforderlichen und verschließen Sie die verbleibenden Öffnungen mit der Nase Kegel-Blocker.</li>
	<li>Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr aus dem Hochdruck-Zylinder und 55 Psi festgesetzt.</li>
	<li>Die Evakuierung-Pumpe befindet sich vor dem Anästhesie-Gerät einschalten und auf 8 L/min eingestellt.</li>
	<li>Schalten Sie den Sauerstoff-Schalter befindet sich vor der Anästhesie-Einheit.</li>
	<li>Schalten Sie den Gasstrom der Anästhesie Induktion Kammer die Strömung des Gases bei 1,5 L/min drehen den Gasstrom aufzubrechen.</li>
	<li>Schalten Sie den Gasstrom der bildgebenden Kammer der Strömung des Gases in 0,25 L/min drehen den Gasstrom aufzubrechen.</li>
	<li>Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane und setzen Sie ihn auf 2-2,5 %. Passen Sie den Isofluran nach Anzahl und Gewicht der Tiere durch Drehen des Knopfes auf dem Verdampfer Isoflurane (2-2,5 % für eine Maus mit einem Gewicht von ~ 20 g; 4 % für ein Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300 g) für das Experiment verwendet wird.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse in der Anästhesie-Kammer und schließen Sie den Deckel. Schalten Sie die Gaszufuhr an der Anästhesie Induktion Kammer.</li>
	<li>Verlassen Sie die Mäuse in der Anästhesie Induktion Kammer für 5-10 min bis vollständig betäubt.</li>
	<li>Sobald die Mäuse betäubt sind, gelten Sie eine optische Salbe für die Augen, sie während der Bildgebung zu schützen.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse in ventralen oder sternale liegen, so dass ihre Nasen in die Bugnase Anästhesie von Mäusen während der bildgebenden Verfahren zu erleichtern platziert werden.</li>
</ol>(4) Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) Bildgebung
<ol><li>Injizieren Sie das Substrat (20 µM, 2,5 µL/g Gewicht) durch intraperitoneale Injektion in den infizierten sowie der Kontroll-Mäusen. Die Mäuse sind unter Narkose in der bildgebenden Kammer für weniger als 1 min.</li>
	<li>Starten Sie die imaging-System.</li>
	<li>Initialisieren Sie das System durch Anklicken initialisieren. Warten Sie, bis die Temperatur Bar auf grün wechselt. Hinweis: Die bildgebende Kammer besteht aus einer beheizten Plattform auf Körpertemperatur des Tieres während der Bildgebung.</li>
	<li>Für imaging-Erwerb Einstellung, wählen Sie Leuchtstofflampen | Trans-Beleuchtung für ganze Tier oder Epi-Beleuchtung für Lungengewebe, Struktur und Overlay in Übernahme der Systemsteuerung.</li>
	<li>B Sichtfeld für einzelne Maus und Lampe Niveau zu hoch gesetzt.</li>
	<li>Belichtungszeit auf Auto, mittlere binning, 2-3 für die f/Stop und Erregung Filter bei 745 nm und Emission Filter festgelegt, von 780 nm bis 840 nm.</li>
	<li>Klicken Sie für Sequenz-Setup auf Reihenfolge-Setup, wählen Sie 9-12 Trans-Beleuchtung Punkte im Bereich der Lunge.</li>
	<li>Klicken Sie auf erfassen, für die Bildaufnahme.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in den Käfig Post-Bildgebung.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse bis vollständig erholt oder zur Quantifizierung KBE, wenn zu einem Zeitpunkt des Experiments imaging zu opfern. Führen Sie einen modifizierten Karnofsky-Score um das Wohlergehen von Mäusen, die Post-imaging zu überwachen.</li>
</ol>5. Analyse der REF imaging
<ol><li>Öffnen Sie die imaging-Software.</li>
	<li>Laden Sie Bilddateien durch durchsuchen anklicken.</li>
	<li>Klicken Sie für spektrale Entmischung in der Werkzeugpalette auf Spectral Unmixing und klicken Sie auf die Spektren unmix verpflichtet. Klicken Sie auf Start zu entmischen.</li>
	<li>Klicken Sie für optische Flächenrückführung auf Oberfläche Topographie.</li>
	<li>Wählen Sie Ausrichtung, dorsal, je nach Fell Maus, und klicken Sie auf Generate Oberfläche.</li>
	<li>Zeichnen Sie Bild zuschneiden und Schwelle Bild für eine Region von Interesse. Klicken Sie auf fertig.</li>
	<li>Gehen Sie für Orgel Registrierung zur Registerkarte Registrierung 3D optische Werkzeuge im Dropdown-Menü.</li>
	<li>Organe des Interesses an einer Orgel-Atlas zu registrieren.</li>
	<li>Passen Sie Orgel Größe oder Lage, um die generierten Oberflächentopographie mit Werkzeug "transformieren" ein-/befindet sich auf der Panel-Registrierung Tools an.</li>
	<li>Rufen Sie fluoreszierende Tomographie 3D-Rekonstruktion (FLIT), und wählen Sie analysieren tab. Wählen Sie die Bilder für die Analyse einbezogen werden, Bildtyp, normalisiert Übertragung Fluoreszenz (NTF) Effizienz, klicken Sie auf Start.</li>
	<li>Überprüfen Sie auf alle auswählen und in der Registerkarte "Datenvorschau" zu rekonstruieren.</li>
	<li>Gehen Sie für die Quantifizierung der Fluoreszenz Region von Interesse (ROI)-Tools, ROI Cube, die Orgel von Interesse hinzuzufügen und passen Sie Cube Größe zur Deckung die Orgel von Interesse. Klicken Sie auf 3D ROIs zu messen.</li>
	<li>Im Fenster ROI Messungen zur ROI 3D-Messungen, wählen Sie Datentyp an Quelle Voxel-Messungen-Einheit auf PmolM-1cm-1.</li>
	<li>Sichern Sie und exportieren Sie das Ergebnis der FLIT 3D-Rekonstruktion Analyse in einer Abbildung oder Daten-Datei.</li>
</ol>(6) Quantifizierung der Bakterien von KBE
<ol><li>Die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium 0,1 mL (390 mg/mL) einschläfern.</li>
	<li>Suchen Sie nach Pedal Reflex durch Zusammendrücken der Pads der Füße von Mäusen um sicherzustellen, dass keine reflex Reaktion.</li>
	<li>Explant das Lungengewebe von Mäusen, die mit einer sterilen Pinzette und Schere. Homogenisieren des Lungengewebes in 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>10-divisibel serielle Verdünnungen der Lunge Homogenat in sterilen 1 X PBS zu machen.</li>
	<li>Vor Ort für Beschichtung, drei Aliquote von 20 µL der jeweiligen Verdünnung auf der Agarplatte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C und Monitor für Bakterienwachstum.</li>
	<li>Anzahl der Kolonien in den einzelnen vor Ort nach der Inkubationszeit und express als KBE / mL durch Korrektur der Lautstärke und Verdünnung mit folgender Gleichung: KBE / mL = (C/V) x M Wo C = Kolonie zählt pro Spot, V = Volumen der Probe inokuliert auf jeder Platte (mL), und M = Multiplikationsfaktor (Kehrwert der Verdünnung verwendet). Hinweis: Wenn an einer Stelle für ein Probenvolumen von 0,002 mL bei einer Probenverdünnung von 10-411 Kolonien gezählt werden, werden unter Verwendung der Gleichung, die Anzahl der Kolonie berechnet (11/0.02) X 104 = 5,5 x 106 KBE / mL</li>
</ol>

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Bei der Verwendung von bildgebender Verfahren, wie z. B. REF, gibt es Schlüsselstrategien, die Generierung von stabilen und konsistenten Daten zu ermöglichen. Optische Verfahren erzeugt Streulicht im Gewebe, die die Tiefe der Penetration, auswirken können, da es schwierig ist, in alle Richtungen emittierte Licht einzufangen. Verwendung von einem in der Nähe von Infrarot-Fluorophor (NIR) Substrat für REF Bildgebung mit einer Anregung und Emission Wellenlänge in der Querange von 700-900 nm ermöglicht minimale Absorption das Fluoreszenzsignal durch Säugetier-Gewebe. Die benutzerdefinierten gestaltete Substrat wurde durch die Verknüpfung einer NIR Fluorophor, IRDye 800Cw einen Quencher gebaut IRDye QC-1, von einem Lactam-Ring ermöglicht Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-basierte abschrecken. IRDye hat ausgezeichnete Gewebe eindringen und Licht Streuung Eigenschaften und hat keinen keine offensichtlich schädliche Wirkung auf Säugetiere36, aus dem Blut und Organe durch 24 h. Fluoreszenz ausgeglichen signalisieren deutlich erhöht, ab 4 h nach Substrat-Verwaltung erreichen maximale Ebenen 6 h nach Verabreichung.
Die bakterielle infektiöse Dosis, die Art der Verwaltung von infektiöse Dosis und das Substrat sowie Zeitpunkte der imaging-Post-Infektion durch Pilotstudien durchführen sollten standardisiert werden, vor dem Einschiffen auf großen, komplexen, Experimente. Pilotstudien können erheblich reduzieren, Zeit und Kosten, wenn eine große Anzahl von Tieren imaging, weil ein Standardverfahren vor dem Ausführen der wichtigsten Experiment optimiert werden kann. Bakterielle Belastungen sollte ermittelt werden, in den Organen/Geweben von Interesse nach Ganzkörper-Bildgebung mit Trans-Beleuchtung und ex Vivo Lunge Bildgebung mit Epi-Beleuchtung um die Quelle des Signals zu überprüfen und bestimmen die Qualität der Korrelation mit bakteriellen Zahlen vorhanden8. Pilot-Studien bieten einen Einblick in die Schwelle der Erkennung, dynamischen Bereich der Technik sowie die Bestimmung der optimalen Versuchsbedingungen für die Bildgebung.
Die Hauptvorteile der Verwendung von REF Bildgebung im Vergleich zu anderen fluoreszenten und biolumineszenten Strategien sind seine hohe Sensibilität und die Fähigkeit zur natürlichen M. Tuberculosis Bild Stämme. REF imaging nutzt das katalytisch robuste Enzym BlaC, die in allen klinischen Isolaten von M. Tuberculosis und Tuberkulose-Komplex Stämme konserviert ist. Die große Empfindlichkeit des REF imaging ist aufgrund der raschen katalytische Rate von BlaC in Kombination mit Eigentumsvorbehalt gespalten fluoreszierende Produkts durch die Wirtszelle. Signalisieren Sie kontinuierlich erhöht, solange das Substrat zur Verfügung, wodurch nahezu unbegrenzte Aufbau des Signals innerhalb der infizierten Zellen und Gewebe ist. Diese erhöhte Empfindlichkeit des REF Bildgebung im Vergleich zu alternativen Ansätzen der Bildgebung ermöglicht spezifische Erkennung von M. Tuberculosis sowohl in Vitro und in Vivo8,23,24, 29.
REF imaging einsetzbar für bakterielle Erkennung ohne gentechnische Veränderungen ermöglichen die direkte Anwendung Infektionsmodell, entweder Labor Tiere8,37 oder menschlichen klinischen Materials29,38 . REF kann verwendet werden, zu erkennen und eine Vielzahl von Krankheitserregern39,40, Bild, da Fluorogenic Substrate für zahlreiche enzymatische Ziele außer BlaC wie Proteasen, Kinasen, Ureases und β-Galactosidases entwickelt werden können. Zeigt jedoch vorsichtig sein, dass das Ziel nachgedacht werden sollte um sicherzustellen es optimale Eigenschaften für die Bildgebung. BlaC stellt ein gutes Modell Enzym für Merkmale, die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie sicherstellt. REF imaging bietet eine sofortige auslesen auf bakterielle Last in Lunge bei Infektionen, die stark Fortschritte beschleunigt im Studium der Tuberkulose Pathogenese, da die Bestimmung der bakteriellen Zahlen erfordert in der Regel drei bis sechs Wochen, aber auch in mehr schnellsten wachsenden Organismen, die diese Vorgehensweise sehr viel spart Zeit. REF kann auch verwendet werden, Karzinome an Tuberkulose, ein zentrales Problem bei der Diagnose von nodulären Läsionen in Patienten41,42zu unterscheiden. "REF" dient als neuartige Werkzeug, translationale Tuberkulose Bildgebung zu beschleunigen und kann auch für den Menschen potenziell ermöglicht schnellen Vorhersage von therapeutischen Ergebnissen angewendet werden.

Die langsame Wachstumsrate von M. Tuberculosis ist ein Haupthindernis in schnelle Diagnose von Tuberkulose1,2,3. Während Kultur Diagnose dauert es Wochen basierte, Ergebnisse zu erzielen, hat säurefeste Abstrich diagnostische Einschränkungen4 Kinder5 und Patienten mit humanen Immundefizienz-Virus6,7. Optical imaging-Technologien wurden kürzlich als Alternative zu herkömmlichen Diagnoseverfahren für Tuberkulose8,9anerkannt. Fluoreszenz und Biolumineszenz können verwendet werden, um optisch M. Tuberculosis mit lebenden Tieren in Echtzeit-10,11,12,13,14Bild, 15,16,17,18,19. Optische Verfahren hat den Vorteil einer schnellen und spezifischen Beurteilung einer Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis20,21,22.
Wir skizzieren Details für optische Bildgebung von M. Tuberculosis in live Mäuse mit REF. Diese Methode ist sehr spezifisch und sensitiv23,24 , und ähnlich wie bei anderen optischen Methoden ist weniger teuer als andere Methoden der Tuberkulose (TB) imaging25, einschließlich Computertomographie (CT)26, magnetische Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)27und F-FDG-Positronen-Emissions-Tomographie/CT (F-FDG-PET/CT)28. REF nutzt benutzerdefinierte fluoreszierende oder biolumineszenten Substrate, die bei der Spaltung durch eine bakterielle Enzym eine fluoreszierende Produkt8,29zu produzieren. Daher hat es den Vorteil, dass eine rekombinante mykobakteriellen Reporter Belastung30,31. Der Bund Substrat beschrieben besteht aus einem Fluorochrom und einen Durstlöscher, verbunden durch ein β-Lactam-Ring, der durch BlaC (β-Lactamase), natürlich konstitutiv durch Tuberkulose-Komplex Mycobacterium8, ausgedrückt hydrolysiert 32. die Bakterien erzeugen direkt Signal durch REF katalytische Aktivität, die Verstärkung von vielen Größenordnungen und empfindliche Detektion von M. Tuberculosisermöglicht.
In dieser Studie verwendeten REF-Substrat hat ausgezeichnete Gewebe eindringen in lebenden Tieren und Hintergrund aufgrund seiner langen Wellenlänge reduziert. Mit dieses langwellige Substrat ist es möglich, einen Schwellenwert von Erkennung für M. Tuberculosis von fast 100 zu erreichen Koloniebildenden Einheiten (KBE) in Vitro und < 1000 KBE in den Lungen von Mäusen in Vivo (ganze Tier)8, 33. REF kann als ein Diagnosetool für Auswurf, klinischen Materials und sogar direkt bei Patienten mit Mikro endoskopische Systeme16,32,33,34 aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität verwendet werden. REF kann auf jede klinische Belastung von Tuberkulose angewendet werden, weil es ein natürlich produzierten bakterielle Enzym, BlaC, für die Erkennung in allen Sorten vorhanden verwendet. Diese Eigenschaften machen REF imaging ein wertvolles Werkzeug in der präklinischen Tuberkuloseforschung im allgemeinen therapeutischen Erleichterung sowie Impfstoff Auswertung und Analyse der Pathogenese, aber letztlich auch zur Diagnose Tuberkulose angewandt werden Patienten.

<table><tbody><tr><td>Isofluran-VETONE</td><td></td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>kundenspezifische synthetisierte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fatal Plus-Lösung</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Middlebrook-Bouillon</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Middlebrook-Anreicherung</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-Gas Anästhesiesystem</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging Software</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparente Nasenkegel</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis Stamm CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weibliche BALB/C-Mäuse, 5-7 Wochen</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis in mäusen mit reporter enzym fluoreszenz imaging

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter-Enzym-Fluoreszenz (REF) nutzt Substrate, die spezifisch für Enzyme zur Bildgebung oder Aufdeckung von Fluoreszenz und Biolumineszenz in Zielorganismen von Interesse sind. Wir nutzen BlaC, ein Enzym, das konstitutiv durch alle M. Tuberkulose -Stämme ausgedrückt. REF ermöglicht schnelle Quantifizierung von Bakterien in der Lunge von infizierten Mäusen. Die gleiche Gruppe von Mäusen kann abgebildet werden, zu vielen Zeitpunkten, erheblich Kosten reduzieren, Auflisten von Bakterien schneller ermöglicht neuartige Beobachtungen in Wirt-Pathogen Interaktionen und statistische Aussagekraft zu erhöhen, da mehr Tiere pro Gruppe leicht gepflegt werden . REF ist extrem katalytische aufgrund der BlaC enzymatische Reporter sensitiver und spezifischer aufgrund der benutzerdefinierten Flourescence Resonanz Energietransfer (FRET) oder Fluorogenic Substrate verwendet. REF erfordert keine rekombinante Stämme, normale Wirt-Pathogen Interaktionen zu gewährleisten. Wir beschreiben die Bildgebung von M. Tuberkulose -Infektion mit einem Bund Substrat mit maximalen Emission bei 800 nm. Die Wellenlänge des Substrates ermöglicht empfindliche Tiefengewebe-Bildgebung bei Säugetieren. Wir skizzieren Aerosol-Infektion von Mäusen mit M. Tuberculosis, Anästhesie von Mäusen, Verwaltung der REF Substrat und optische Bildgebung. Diese Methode wird erfolgreich angewendet, zur Bewertung von Wirt-Pathogen Interaktionen und Wirksamkeit der Antibiotika gezielt M. Tuberculosis.

REF Bildgebung von Mäusen zusammen mit nicht infizierten Kontrolle Maus mit M. Tuberculosis infiziert sind in Abbildung 1Adargestellt. Infizierte Mäuse produziert ein signifikant (P = 0,0057) höheren Fluoreszenzsignal aus der Lunge in 6 Wochen nach der Infektion im Vergleich zur Kontrolle auf Substrat Verwaltung. Ein typischen zeitlichen Verlauf der therapeutischen Wirksamkeit gegen M. Tuberculosis mit REF studieren konnte imaging bei Woche, 1, 2, 4, 6, 15, 24 nach der Infektion. Fluoreszenzintensität wird quantifiziert mit Epi-Beleuchtung für Lungengewebe (Abbildung 1B). Das ständig zunehmende Signal von Woche 2 Woche 6 in Lungen von infizierten Mäusen legt nahe, dass REF erfolgreich M. Tuberculosis in-vivoerkennen kann. Ein Tropfen in das Hintergrundsignal des Kontroll-Mäusen zu einem späteren Zeitpunkt (Abbildung 1B) könnte der Anstieg der Körper zugeschrieben werden Masse und Volumen von Mäusen über einen Zeitraum von 6 Wochen, wodurch die Erregung Wellenlänge Eindringen. FLIT 3D-Rekonstruktion von Fluoreszenz Quellen bei Mäusen mit M. Tuberculosis infiziert ist in Abbildung 2Avertreten. Die Bildsequenzen werden an mehreren Punkten der Trans-Beleuchtung in der Maus mit dem gleichen Anregung und Emission Filter-Serie erworben. Diese Bildsequenzen werden dann für FLIT 3D-Rekonstruktion für fluoreszierende Source-Distribution innerhalb der tierischen Thema verwendet. Abbildung 2 A-D zeigt die verschiedenen Richtungen (koronalen, sagittale und 2D-Einzelschicht) der Maus-Tomographie mit Lunge Orgel Registrierung. NTF-Effizienz Karten für die Überprüfung die Wiederaufbau-Qualität sind in Abbildung 2Evertreten. NTF ermöglicht Subtraktion der Hintergrund Lichtverlust von Trans-Beleuchtung Bilder durch ein zusätzliches Bild mit Graufilter eingefangen. Die Aufnahme mit dem spezifischen Erregung Filter (Abbildung 2E gemessen) ist auf das Getriebe Bild gemessen mit der gleichen Emission und eine offene Erregung Filter (Abbildung 2E - simuliert) geben normalisiert. das Signal durch das Substrat allein produziert. Die ähnliche gemessen und simuliert NTF Effizienz Profil sowohl horizontal (Abbildung 2F) und vertikale (Abbildung 2G) Profile mit fast 0 % prozentualen Fehler (Abbildung 2E % Fehler) bietet Hinweise auf eine gute Qualität 3D-Rekonstruktion mit reduzierten Artefakten und verbesserte Signal-Lokalisierung und Empfindlichkeit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Abbildung 1 . Bildgebung des M. Tuberculosis mit ref (A) in-Vivo Bildgebung von Mäusen nicht infizierten und bei 2, 4 und 6 Wochen nach der Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis infiziert. Die Farbleiste stellt die Intensität der das Fluoreszenzsignal in Photonen pro Sekunde pro cm2 von Low (gelb), hoch (rot). (B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von Mäusen mit M. Tuberculosisinfiziert. Fluoreszenz-Werte für beide Kontrolle (schwarz) und infizierte (rot) sind zusammen mit der Standardfehler für jeden Zeitpunkt vertreten. Die Bedeutung der Ergebnisse wurden ermittelt, indem Schüler t-test, p -Werte der &lt; 0,05 wurden als bedeutende. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Abbildung 2 . FLIT 3D-Rekonstruktion von Fluoreszenz Quellen bei Mäusen mit M. Tuberculosisinfiziert. Maus-Tomographie in verschiedene Richtungen vertreten; (A) koronalen, (B) sagittale, und (C) 2D-Einzelschicht mit (D) Lunge Orgel Registrierung. Die 3D Region of Interest (ROI) wird als eine rote Würfel in der Lunge für Quelle Messungen dargestellt. (E) NTF Effizienz Karten der gemessenen und simulierten für die Überprüfung der Wiederaufbau-Qualität. Die gemessenen und simulierte NTF-Effizienz-Profil wurde verglichen, die gute Qualität der 3D-Rekonstruktion (ähnliche gemessenen und simulierten NTF Effizienz). F) Horizontal "und" G) vertikale Signal Profile repräsentieren gemessenen (blau) und simuliert (rot) NTF Effizienzkurve. Die horizontalen und vertikalen roten Balken zeigen die Quellposition. Die Farbleiste stellt die Intensität der das Fluoreszenzsignal in Photonen pro Sekunde pro cm2 von Low (blau) zu hoch (rot). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Das übergeordnete Ziel dieses Reporterenzym-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahrens ist es, den sensitiven und spezifischen Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapeutika und Impfstoffforschung zu erleichtern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Tuberkulose zu beantworten, einschließlich der Virulenzmechanismen von Bakterienarten sowie der Entwicklung von Therapeutika und des Verständnisses von Impfstoffen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass sie es ermöglicht, dieselbe Gruppe von Tieren zu mehreren Zeitpunkten abzubilden.Dies reduziert die Kosten erheblich, ermöglicht es uns, die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Erreger zu untersuchen, und erhöht auch die statistische Aussagekraft, da eine größere Anzahl von Tieren gleichzeitig aufrechterhalten werden kann. Zu Beginn züchten Sie alle M.tuberculosis-Bakterien in MOADCTW-Medium bei 37 Grad Celsius auf eine optische Dichte von 0,5, gemessen bei 600 Nanometern. Alle Verfahren, bei denen infektiöses Material manipuliert wird, müssen in Biosicherheitswerkbänken oder anderen zugelassenen physischen Sicherheitsbehältern durchgeführt werden.Sobald Sie fertig sind, nehmen Sie eine Reihe von ein bis 10 Verdünnungen der Kultur im selben Medium vor. Anschließend werden die Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung auf selektive 7H11-Platten plattiert, um eine genaue Bestimmung der KBE vorzunehmen. Inkubieren Sie die Platten vier Wochen lang bei 37 Grad Celsius oder bis die Bienenvölker genau gezählt werden können, um die KBE zu bestimmen.Vergewissern Sie sich vor dem Einrichten einer Impfung immer, dass die Biosicherheitshaube Luft mit 50 Litern pro Minute strömt. Um ein Inokulum herzustellen, das bis zu 90 Mäuse infizieren kann, misst man die gewünschte KBE in einem 15-Milliliter-Falkenröhrchen ab. In der Regel werden zwischen 10.000 und 1 Million KBE verwendet.Pelletieren Sie dann die Bakterien. Als nächstes waschen Sie die Bakterien einmal mit 10 Millilitern Kochsalzlösung. Hängen Sie sie dann in 15 Millileter Kochsalzlösung auf.Laden Sie dann das Inokulum in eine Biosicherheitswerkbank, die an einem Vernebler befestigt werden kann. Schließen Sie als nächstes die Verneblereinheit an und stellen Sie das vertikale Edelstahlrohr so ein, dass das untere Ende etwa einen Viertelzoll unter dem Meniskus der Aufhängung liegt. Übergeben Sie nun die Baugruppe in einem auslaufsicheren Transportbehälter in die Impfkammer.Um fortzufahren, laden Sie Tiere mit bekanntem Gewicht in die eingeschaltete Impfkammer. Die Kammer bietet Platz für bis zu 90 Mäuse. Schließen Sie dann alle Riegel an der Tür.Schließen Sie dann den Vernebler mit einer Stahlklemme an. Drücken Sie dann den Startknopf an der Kammer. Und stellen Sie den Luftdurchsatz auf drei bis fünf Liter pro Minute ein.Die Druckluft strömt mit etwa 22 bis 26 Pfund pro Quadratzoll und vor allem sollte es möglich sein, den Nebel des Inokulums in der Kammer zu sehen. Nach 15 Minuten leuchtet ein rotes Licht an der Vorderseite des Bedienfelds auf und ein akustisches Signal zeigt das Ende des Laufs an. Drücken Sie dann die Reset-Taste, um die Timer zurückzusetzen.Um das Vakuum zu lösen, drücken Sie den kleinen roten Knopf an der Tür der Kammer. Öffnen Sie dann die Kammertür und bringen Sie die Mäuse in ihre Heimatkäfige zurück. Halten Sie die Tiere in Zukunft im Sicherheitsraum.Stellen Sie anschließend das Glas und den Transportbehälter wieder in die Biosicherheitswerkbank ein. Entsorgen Sie dort die restliche Bakteriensuspension in einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter. Legen Sie dann das gebrauchte Verneblerglas in einen Biohazard-Beutel und verschließen Sie den Beutel für den Transport zum Autoklaven.Um die Kammer zu reinigen, besprühen Sie die Innenflächen mit gepuffertem Phenol und 70%igem Ethanol. Lassen Sie diese Lösungen 10 Minuten lang auf diesen Oberflächen einwirken. Wischen Sie sie dann gründlich ab.Entsorgen Sie alle Tücher im Müll für biologische Gefahren. Autoklavieren Sie dann den Müll, den Abfallbehälter und die gebrauchten Verneblergläser. Bringen Sie die Tiere in den Bildgebungsraum.Dort wird ein Tier nach dem Textprotokoll betäubt und durch intraperitoneale Injektion mit Kontrastsubstrat injiziert. Initialisieren Sie in der Software für Bildgebungssysteme das System und fahren Sie fort, wenn der Temperaturbalken grün wird. Platzieren Sie die Maus nach der Initialisierung des Systems in der Bildgebungskammer.Stellen Sie sicher, dass sich die Nasenlöcher innerhalb des Nasenkegels befinden, damit er während der Bildgebung betäubt wird. Kehren Sie nun zum Computer zurück. Wählen Sie im Bedienfeld für die Erfassung entweder Fluoreszenz, Transillumination für die Visualisierung am ganzen Tier oder Epi-Illumination für die Anzeige von Lungengewebe.Stellen Sie für eine einzelne Maus das Sichtfeld auf B und die Lampenstärke auf hoch ein. Verwenden Sie für die Belichtung die automatische Zeit, das mittlere Binning und zwei oder drei für die Blende. Stellen Sie dann den Anregungsfilter auf 745 Nanometer und die Emissionsfilter auf 780 bis 840 Nanometer ein.Gehen Sie dann zum Einrichten der Sequenz und wählen Sie neun bis 12 Transilluminationspunkte im Interessenbereich aus. Drücken Sie nun die Acquire-Taste, um Bilder zu sammeln. Die Bildanalyse wird im Textprotokoll behandelt.Um das Ausmaß der Infektion zu analysieren, euthanasieren Sie die Maus mit Natrium-Pentobarbital. Achten Sie darauf, dass ein Pedalreflex vorhanden ist, um sicherzustellen, dass das Tier eingeschläfert wird. Und dann explantieren Sie die Lunge mit einer Standarddissektion.Als nächstes homogenisieren Sie das Lungengewebe in einem Milliliter PBS. Nehmen Sie dann eine zehnfache serielle Verdünnung des Homogenyns mit PBS vor. Die verdünnte Homogenität wird in dreifacher Ausfertigung plattiert und bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis die Kolonien gezählt werden können.Verwenden Sie dann den CFU-Score, um den Schweregrad der Infektion zu messen. Mäuse wurden wie beschrieben behandelt. Ein REF-Substrat wurde verwendet, um das Fortschreiten von M. tuberculosis zu betrachten.Die Fluoreszenz wurde mittels Transillumination quantifiziert. Und sie stieg bei den infizierten Mäusen von Woche zwei auf Woche sechs an. Der leichte Signalabfall bei den Kontrollmäusen könnte auf die Zunahme der Körpermasse und des Körpervolumens über den Zeitraum von sechs Wochen zurückgeführt werden.Die 3D-FLIT-Rekonstruktion von Fluoreszenzquellen wurde von mehreren Transilluminationspunkten unter Verwendung der gleichen Anregung und Serie von Emissionsfiltern durchgeführt. Es wurden NTF-Effizienzkarten erstellt, um die Rekonstruktionsqualität zu überprüfen. Das Bild, das von dem spezifischen Anregungsfilter aufgenommen wurde, wurde auf das Transmissionsbild normiert, das mit demselben Emissionsfilter und einem offenen Anregungsfilter aufgenommen wurde.Dadurch wird ein Signal bereitgestellt, das allein vom Substrat erzeugt wird. Bei der Rekonstruktion gab es fast keinen Fehler. Die Untersuchung der NTF-Effizienz der Daten sowohl in der horizontalen als auch in der vertikalen Ansicht zeigte eine enge Korrelation.So wies die 3D-Rekonstruktion nur wenige Artefakte auf, verbesserte die Signallokalisierung und eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen Methoden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Tuberkulose den Weg, um die therapeutische Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse über den Aerosolweg mit Mycobacterium tuberculosis infiziert, mit anschließender optischer Bildgebung unter Verwendung des REF-Substrats.

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung...

Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Quelle: Valentine, M. E. et al., Erzeugung von In-Frame-Gen-Deletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Anwendung eines biolumineszenzbasierten Bildgebungsansatzes zur Überwachung bakterieller Infektionen in einem Live-Mausmodell. Sequentielle biolumineszente und Röntgenbildgebung ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und anatomische Lokalisierung der Infektion, die...

Echtzeitbildgebung bakterieller Infektionen in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Quelle: Behera, R. K. et al. Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Untersuchung der bakteriellen Genregulation in infizierten Geweben. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert eine Methode zur Herstellung infizierter Mausnieren, zur DNA-Färbung und zur Erkennung bakterieller Genexpression mittels dualer fluoreszierender Reporter. Rot markiert alle Bakterien, und Grün hebt infektionsempfindliche Zellen hervor.

Fluoreszenzbildgebung der bakteriellen Besiedlung im Nierengewebe der Maus

Dieses Video zeigt die Reporterenzym-Fluoreszenz (REF) Bildgebung für den in vivo Nachweis von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen. Den infizierten Mäusen wird intraperitoneal ein Substrat für die REF-Bildgebung injiziert. Nach der Hydrolyse durch ein bakterielles β-Lactamase-Enzym emittiert das Substrat Fluoreszenz, deren Nachweis die Bewertung der Infektion erleichtert.

Reporter-Enzym-Fluoreszenz-Bildgebung für die In-vivo-Verfolgung bakterieller Infektionen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung von Virusinfektionen in Mausmodellen mit einem rekombinanten Luciferase- und Fluoreszenzprotein-exprimierenden bi-Reporter-Influenza-A-Virus. Diese Methode ermöglicht sowohl in vivo- als auch ex vivo-Studien, die es den Forschern ermöglichen, Einblicke in die virale Dynamik und die Auswirkungen von Interventionen zu gewinnen.

Ein Luziferase-fluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Verfolgung von Virusinfektionen

Multi-Bildgebung ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung bakterieller Besiedlung in kleinen Tiermodellen. Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit...

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

Kombinierte optische und μCT Bildgebung in einem Mausmodell der orthopädischen Implantatinfektion unter Verwendung eines Biolumineszenz-engineered Stamm von Staphylococcus aureus, sofern die Möglichkeit, die Dynamik der bakteriellen Infektion, sowie die entsprechende Entzündungsreaktion und anatomische Veränderungen in den nichtinvasiven und in Längsrichtung zu überwachen Knochen.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Influenza-A-Viren (IAVs) sind ansteckende Atemwegserreger, die jährliche Epidemien und gelegentliche Pandemien verursachen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Verfolgung viraler Infektionen in vivo mit einer neuartigen rekombinanten Luziferase und fluoreszenz-exzierenden Bi-Reporter IAV (BIRFLU). Dieser Ansatz bietet Forschern ein ausgezeichnetes Werkzeug, um IAV in vivo zu studieren.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Erfahren Sie, wie Reporter-Enzym-Fluoreszenz-Imaging zur sensiblen Detektion von Mycobacterium tuberculosis in präklinischen Mausmodellen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht Langzeitstudien zur Pathogenese und Therapieentwicklung.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

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