Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Reporterenzym-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahrens ist es, den sensitiven und spezifischen Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapeutika und Impfstoffforschung zu erleichtern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Tuberkulose zu beantworten, einschließlich der Virulenzmechanismen von Bakterienarten sowie der Entwicklung von Therapeutika und des Verständnisses von Impfstoffen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass sie es ermöglicht, dieselbe Gruppe von Tieren zu mehreren Zeitpunkten abzubilden.

Dies reduziert die Kosten erheblich, ermöglicht es uns, die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Erreger zu untersuchen, und erhöht auch die statistische Aussagekraft, da eine größere Anzahl von Tieren gleichzeitig aufrechterhalten werden kann. Zu Beginn züchten Sie alle M.tuberculosis-Bakterien in MOADCTW-Medium bei 37 Grad Celsius auf eine optische Dichte von 0,5, gemessen bei 600 Nanometern. Alle Verfahren, bei denen infektiöses Material manipuliert wird, müssen in Biosicherheitswerkbänken oder anderen zugelassenen physischen Sicherheitsbehältern durchgeführt werden.

Sobald Sie fertig sind, nehmen Sie eine Reihe von ein bis 10 Verdünnungen der Kultur im selben Medium vor. Anschließend werden die Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung auf selektive 7H11-Platten plattiert, um eine genaue Bestimmung der KBE vorzunehmen. Inkubieren Sie die Platten vier Wochen lang bei 37 Grad Celsius oder bis die Bienenvölker genau gezählt werden können, um die KBE zu bestimmen.

Vergewissern Sie sich vor dem Einrichten einer Impfung immer, dass die Biosicherheitshaube Luft mit 50 Litern pro Minute strömt. Um ein Inokulum herzustellen, das bis zu 90 Mäuse infizieren kann, misst man die gewünschte KBE in einem 15-Milliliter-Falkenröhrchen ab. In der Regel werden zwischen 10.000 und 1 Million KBE verwendet.

Pelletieren Sie dann die Bakterien. Als nächstes waschen Sie die Bakterien einmal mit 10 Millilitern Kochsalzlösung. Hängen Sie sie dann in 15 Millileter Kochsalzlösung auf.

Laden Sie dann das Inokulum in eine Biosicherheitswerkbank, die an einem Vernebler befestigt werden kann. Schließen Sie als nächstes die Verneblereinheit an und stellen Sie das vertikale Edelstahlrohr so ein, dass das untere Ende etwa einen Viertelzoll unter dem Meniskus der Aufhängung liegt. Übergeben Sie nun die Baugruppe in einem auslaufsicheren Transportbehälter in die Impfkammer.

Um fortzufahren, laden Sie Tiere mit bekanntem Gewicht in die eingeschaltete Impfkammer. Die Kammer bietet Platz für bis zu 90 Mäuse. Schließen Sie dann alle Riegel an der Tür.

Schließen Sie dann den Vernebler mit einer Stahlklemme an. Drücken Sie dann den Startknopf an der Kammer. Und stellen Sie den Luftdurchsatz auf drei bis fünf Liter pro Minute ein.

Die Druckluft strömt mit etwa 22 bis 26 Pfund pro Quadratzoll und vor allem sollte es möglich sein, den Nebel des Inokulums in der Kammer zu sehen. Nach 15 Minuten leuchtet ein rotes Licht an der Vorderseite des Bedienfelds auf und ein akustisches Signal zeigt das Ende des Laufs an. Drücken Sie dann die Reset-Taste, um die Timer zurückzusetzen.

Um das Vakuum zu lösen, drücken Sie den kleinen roten Knopf an der Tür der Kammer. Öffnen Sie dann die Kammertür und bringen Sie die Mäuse in ihre Heimatkäfige zurück. Halten Sie die Tiere in Zukunft im Sicherheitsraum.

Stellen Sie anschließend das Glas und den Transportbehälter wieder in die Biosicherheitswerkbank ein. Entsorgen Sie dort die restliche Bakteriensuspension in einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter. Legen Sie dann das gebrauchte Verneblerglas in einen Biohazard-Beutel und verschließen Sie den Beutel für den Transport zum Autoklaven.

Um die Kammer zu reinigen, besprühen Sie die Innenflächen mit gepuffertem Phenol und 70%igem Ethanol. Lassen Sie diese Lösungen 10 Minuten lang auf diesen Oberflächen einwirken. Wischen Sie sie dann gründlich ab.

Entsorgen Sie alle Tücher im Müll für biologische Gefahren. Autoklavieren Sie dann den Müll, den Abfallbehälter und die gebrauchten Verneblergläser. Bringen Sie die Tiere in den Bildgebungsraum.

Dort wird ein Tier nach dem Textprotokoll betäubt und durch intraperitoneale Injektion mit Kontrastsubstrat injiziert. Initialisieren Sie in der Software für Bildgebungssysteme das System und fahren Sie fort, wenn der Temperaturbalken grün wird. Platzieren Sie die Maus nach der Initialisierung des Systems in der Bildgebungskammer.

Stellen Sie sicher, dass sich die Nasenlöcher innerhalb des Nasenkegels befinden, damit er während der Bildgebung betäubt wird. Kehren Sie nun zum Computer zurück. Wählen Sie im Bedienfeld für die Erfassung entweder Fluoreszenz, Transillumination für die Visualisierung am ganzen Tier oder Epi-Illumination für die Anzeige von Lungengewebe

Stellen Sie für eine einzelne Maus das Sichtfeld auf B und die Lampenstärke auf hoch ein. Verwenden Sie für die Belichtung die automatische Zeit, das mittlere Binning und zwei oder drei für die Blende. Stellen Sie dann den Anregungsfilter auf 745 Nanometer und die Emissionsfilter auf 780 bis 840 Nanometer ein.

Gehen Sie dann zum Einrichten der Sequenz und wählen Sie neun bis 12 Transilluminationspunkte im Interessenbereich aus. Drücken Sie nun die Acquire-Taste, um Bilder zu sammeln. Die Bildanalyse wird im Textprotokoll behandelt.

Um das Ausmaß der Infektion zu analysieren, euthanasieren Sie die Maus mit Natrium-Pentobarbital. Achten Sie darauf, dass ein Pedalreflex vorhanden ist, um sicherzustellen, dass das Tier eingeschläfert wird. Und dann explantieren Sie die Lunge mit einer Standarddissektion.

Als nächstes homogenisieren Sie das Lungengewebe in einem Milliliter PBS. Nehmen Sie dann eine zehnfache serielle Verdünnung des Homogenyns mit PBS vor. Die verdünnte Homogenität wird in dreifacher Ausfertigung plattiert und bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis die Kolonien gezählt werden können.

Verwenden Sie dann den CFU-Score, um den Schweregrad der Infektion zu messen. Mäuse wurden wie beschrieben behandelt. Ein REF-Substrat wurde verwendet, um das Fortschreiten von M. tuberculosis zu betrachten.

Die Fluoreszenz wurde mittels Transillumination quantifiziert. Und sie stieg bei den infizierten Mäusen von Woche zwei auf Woche sechs an. Der leichte Signalabfall bei den Kontrollmäusen könnte auf die Zunahme der Körpermasse und des Körpervolumens über den Zeitraum von sechs Wochen zurückgeführt werden.

Die 3D-FLIT-Rekonstruktion von Fluoreszenzquellen wurde von mehreren Transilluminationspunkten unter Verwendung der gleichen Anregung und Serie von Emissionsfiltern durchgeführt. Es wurden NTF-Effizienzkarten erstellt, um die Rekonstruktionsqualität zu überprüfen. Das Bild, das von dem spezifischen Anregungsfilter aufgenommen wurde, wurde auf das Transmissionsbild normiert, das mit demselben Emissionsfilter und einem offenen Anregungsfilter aufgenommen wurde.

Dadurch wird ein Signal bereitgestellt, das allein vom Substrat erzeugt wird. Bei der Rekonstruktion gab es fast keinen Fehler. Die Untersuchung der NTF-Effizienz der Daten sowohl in der horizontalen als auch in der vertikalen Ansicht zeigte eine enge Korrelation.

So wies die 3D-Rekonstruktion nur wenige Artefakte auf, verbesserte die Signallokalisierung und eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen Methoden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Tuberkulose den Weg, um die therapeutische Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse über den Aerosolweg mit Mycobacterium tuberculosis infiziert, mit anschließender optischer Bildgebung unter Verwendung des REF-Substrats.