Name: Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Lernen Sie FISH-Probenherstellung und Visualisierung meiotischer Arm-Kohäsion in Drosophila-Oozyten während Prometaphase und Metaphase. Diese Methode ermöglicht Forschern, den Zustand der Schwesterchromatidenkohäsion zu untersuchen.

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Diese Arbeit wurde von NIH Grant GM59354 an Sharon E. Bickel vergeben unterstützt. Wir danken für die Unterstützung bei der Ausarbeitung des Protokolls für die Erzeugung von fluoreszierenden Arm Sonden, Ann Lavanway Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie und J. Emiliano Reed für technische Hilfe Huy Nguyen q. Wir danken auch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen in der Drosophila-Community für hilfreiche Gespräche und Beratung.

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Verwendung von Fisch-Sonden zur Bewertung des Zustands der Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen ist eine deutliche Weiterentwicklung im Bereich der Drosophila Meiose. In der Vergangenheit wurden Drosophila Forscher zu Gentests zu vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt in reifen Eizellen11,18,19folgern beschränkt. Nun kann mit der hier vorgestellten Methoden d...

Angemessene Trennung der Chromosomen während der Mitose und Meiose erfordert, dass Schwester Chromatids Zusammenhalt werden eingerichtet, gepflegt und veröffentlicht in koordinierter Form1,2. Zusammenhalt ist in S Phase etabliert und wird durch die Cohesin komplexe, die physischen Verbindungen bildet, die die Schwester halten vermittelt Chromatiden zusammen. In Meiose, Zusammenhalt distal zu einer Überschneidung auch Funktionen zum rekombinanten homologe zusammen zu halten und diese körperliche Vereinigung gewährleistet korrekte Ausrichtung der Bivalent auf der Metaphase ich Spindel (Abbildung 1)3,4, 5. Freisetzung von Arm Zusammenhalt auf Anaphase ich ermöglicht die homologe zu den entgegengesetzten Polen der Spindel zu trennen. Jedoch wenn Arm Zusammenhalt ist verloren vorzeitig, rekombinante homologe verlieren ihre physische Verbindung und zufällig, zu trennen, was aneuploiden Keimzellen (Abbildung 1) führen kann.
In der menschlichen Eizellen Fehler im Chromosom Trennung sind die häufigste Ursache für Fehlschläge und Geburtsschäden, wie z. B. Down-Syndrom-6, und ihre Häufigkeit steigt exponentiell mit der mütterlichen Alter7. Schwester Chromatids Zusammenhalt entsteht in der fetalen Eizellen und meiotischen Rekombination erfolgt vor der Geburt. Eizellen dann verhaften in Mitte Prophase ich bis zum Eisprung und während dieser Festnahme, die weiterhin körperliche Vereinigung der rekombinanten homologe setzt auf Schwester Chromatids Zusammenhalt. Daher genaue Trennung während der Meiose und normale Schwangerschaft Ergebnisse erfordern, dass Zusammenhalt für bis zu fünf Jahrzehnte intakt bleiben.
Vorzeitiger Verlust der Zusammenhalt während der verlängerten meiotische Festnahme von menschlichen Eizellen zu der mütterlichen Alter Wirkung beitragen soll und mehrere Textzeilen Beweise unterstützen diese Hypothese8,9. Jedoch angesichts der Herausforderungen des Studiums meiotische Zusammenhalt in der menschlichen Eizellen, viel von unserem Verständnis für dieses Phänomen beruht auf der Verwendung von Modell Organismen5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila Melanogaster Eizellen bieten zahlreiche Vorteile für die Studie der meiotischen Zusammenhalt und Chromosom Segregation. Eine einfache genetische Test erlaubt es, Nachkommen von aneuploiden Keimzellen erholen und messen die Treue des X-Chromosom Segregation auf einer großen Skala11,16,17. Darüber hinaus kann man auch bestimmen, ob Chromosom Abtrennung Fehler entstehen, weil rekombinante homologe missegregate während der Meiose I, einem Phänotyp, der vorzeitige Verlust der Arm Zusammenhalt11,18, entspricht 19. direkte Beobachtung des Bundesstaates meiotische Zusammenhalt in Drosophila Eizellen ist auch möglich mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH). Obwohl fluoreszierende Oligonukleotiden, die sich wiederholende Sat-Sequenzen hybridisieren wurden für mehr als ein Jahrzehnt zur Chromosomenregion Zusammenhalt in Reife Drosophila Eizellen4,20, Analyse der Arm überwachen Zusammenhalt ist viel schwieriger gewesen. Visualisierung des Bundesstaates Arm Zusammenhalt erfordert eine Sonde, die ein großes Gebiet der Urschrift umfasst Sequenzen und ist hell genug, um sichtbare Signale für einzelne Schwester Chromatiden entstehen, wenn Arm Zusammenhalt fehlt. Darüber hinaus müssen die Eizelle Fixierung Bedingungen und Größe der beschrifteten DNA eindringen21 in der großen Reifen Drosophila Eizelle (200 µm Breite von 500 µm lang) erleichtern. Vor kurzem wurde eine Arm-Sonde erfolgreich genutzt, Drosophila Eizelle Chromatiden während Anaphase zu visualisieren, ich, aber die Autoren erklärt, dass sie nicht ein Signal im prometaphase erkennen könnte oder Metaphase ich verhaftet Eizellen22. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Generation von X-Chromosom Arm FISH-Sonden und Eizelle Herstellungsbedingungen, die uns für den vorzeitigen Verlust der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase assay ich und Metaphase erlaubt haben, ich Eizellen. Diese Techniken, die es uns ermöglicht haben, Genprodukte zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung der meiotischen Zusammenhalt erforderlich sind, damit andere assay für Schwester Chromatids Zusammenhalt Mängel an Reifen Drosophila Eizellen der verschiedenen Genotypen.

<table><tbody><tr><td>Kits</td>Midi Vorbereitungskit Qiagen 12143 Vorbereitung BAC-Klon DNA GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC-Klon-DNA ARES Alexa Fluor 647 DNA-Markierungskit <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Markierung BAC-Klon-DNA-PCR-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Entfernen Sie den nicht konjugierten Farbstoff nach der Markierung der BAC-Klon-DNA</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Chemikalien & Lösungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hinweis: Alle Lösungen werden mit sterilem Reinstwasser hergestellt und sollten entweder durch Autoklaven- oder Filtersterilisation sterilisiert werden.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>10% Stock Aliquoten einfrieren</td></tr><tr><td></td><td>Calciumchlorid Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td><stark>giftig: </stark> tragen Sie angemessenen Schutz. Bereiten Sie 100&micro; g/ml Brühe in 100% Ethanol, in Aliquoten bei -20 °C lagern. Vorbereiten 1 & Mikro; g/ml Lösung in 2X SSCT vor der Anwendung.</td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>Sigma</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>Drierit</td><td>Drierit Company</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td>Bereiten Sie 10 mM Stamm</td></tr><tr><td>dTTP (10 & Mikro; mol, 100 & micro; l)</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>Aufbereitung von 1 mM Stamm</td></tr><tr><td>EDTA (Dinatriumethylendiamintetraessigsäure)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>Aufbereitung von 250 mM Stamm</td></tr><tr><td>100% Ethanol (Molekularqualität, 200 Proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Ethylenbis(oxyethylenenitrilo)tetraessigsäure)</td><td>Sigma</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td><stark>Giftig: </stark> Verschleiß angemessener Schutz</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342<</td><td>stark>Giftig: </stark>Verschleiß angemessener Schutz</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4</td><td><stark>Giftig: </stark> tragen Sie angemessenen Schutz.</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Millipore</td><td>HX0603-4</td><td><stark>Giftig: </stark> tragen Sie angemessenen Schutz.</td></tr><tr><td>Hydroxylamin</td><td>Sigma</td><td>438227</td><td>Prepare 3 M Vorrat</td></tr><tr><td>4,9 M Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 &Yuml; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>Scientific S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &Yuml; 2H2</td><td>O Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (0,1 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S209-500</td><td>Bereiten Sie 3M Lagerbestand</td></tr><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>vor Polysciences, Inc.</td><td>1131</td><td>Toxisch: wear angemessener Schutz. Bereiten Sie 400mM Vorrat</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Natriumchlorid</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Surfact-Ampere</td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>Surfact-Ampere vor</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td><>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hinweis: Alle Lösungen werden mit sterilem Reinstwasser hergestellt und sollten entweder durch Autoklaven- oder Filtersterilisation sterilisiert werden.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE-Puffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0</td></tr><tr><td>20X SSC (Salznatriumcitrat)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 300 mM Natriumcitrat</td></tr><tr><td>2X Cacodylat-Fixlösung</td><td></td><td></td><td><stark>Giftig: </stark> tragen Sie angemessenen Schutz. 200 mM Natriumcacodylat, 200 mM Saccharose, 80 mM Natriumacetat, 20 mM EGTA</td></tr><tr><td>1,1X Hybridisierungspuffer</td><td></td><td></td><td>3,3 % SSC, 55 % Formamid, 11 % Dextransulfat</td></tr><tr><td>Fix-Lösung</td><td></td><td></td><td><stark>giftig: </starker Verschleiß geeigneter Schutz. 4 % Formaldehyd, 1X Cacodylat>-Fix-Lösung</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,5 % BSA, 0,1 % Trition X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1 % Trition X-100</td></tr><tr><td>Extraktionspuffer (PBSTx + Rnase)</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1 % Trition X-100, 100 & Mikro; g/mL RNase</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC, 0,1 % Tween 20</td></tr><tr><td>2X SSCT + 20 % Formamid</td><td></td><td></td><td><stark>Giftig: </stark> verschleißgerechter Schutz. 2X SSC, 0,1 % Tween 20, 20 % Formamid</td></tr><tr><td>2X SSCT + 40 % Formamid</td><td></td><td></td><td><stark> giftig: </stark> verschleißgerechter Schutz. 2X SSC, 0,1 % Tween 20, 40 % Formamid</td></tr><tr><td>2X SSCT + 50 % Formamid</td><td></td><td></td><td><stark>giftig: </stark> tragen Sie angemessenen Schutz. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 50% Formamid</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AluI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0137S</td><td></td></tr><tr><td>HaeIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0108S</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>RsaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0167S</td><td></td></tr><tr><td>BfuCI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0636S</td><td></td></tr><tr><td>100X BSA</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Kommt mit NEB-Enzymen</td></tr><tr><td>10X NEB-Puffer #2</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Restriktionsenzym-Verdauungspuffer. Kommt mit NEB-Enzymen:</td></tr><tr><td>Terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) 400 U/&micro; l</td><td>Roche/Sigma</td><td>3333566001</td><td></td></tr><tr><td>TdT-Puffer</td><td>Roche/Sigma</td><td></td><td>Kommt mit TdT-Enzym</td></tr><tr><td>Kobaltchlorid</td><td>Roche/Sigma</td><td></td><td>Toxisch: wear entsprechender Schutz. Kommt mit TdT-Enzym</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/ml)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Zytologiewerkzeuge usw.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td></td><td>#5 INOX, Biologie</td></tr><tr><td>9" Einweg-Glas-Pasteur-Pipetten</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td>Autoklav zum Sterilisieren</td></tr> von <tr><td>flachen Glas-Präparierschalen</td><td></td><td></td><td>Maßgeschneiderte</td></tr><tr><td>Deep-Well-Schüssel (3 Vertiefungen)</td><td>Pyrex</td><td>7223-34</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium-Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-104</td><td>Wird zum Abdecken von Deep-Well-Schalen</td></tr> verwendet <tr><td>Objektträger aus Milchglas, 25 x 75 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48312-002</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger, 3 x 1 Zoll, 1 mm dick</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, 10 x 10 mm, Nr. 1,5</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>Wolframnadel</td><td></td><td></td><td>selbstgemacht</td></tr><tr><td>Prolong GOLD Eindeckmedien</td><td>Molekulare Sonden</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Druckluft in Dose</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>AusrüstungPCR-Maschine</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000, Spektralphotometer</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td>Mikrovolumen-Spektralphotometer</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tischmikrofuge bei Raumtemperatur</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tischmikrofuge bei 4 &°; C</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Verschiedenes Hybridisierung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ofen oder Inkubator mit Rotator</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nutator Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1RSi Laserscanning-Konfoal</td><td>Nikon</td><td></td><td>40X Öl Plan Fluor DIC (NA 1.3)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Verbrauchsmaterialien usw.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrofugenröhrchen</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 & micro; l Mikrofuge Röhrchen</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & Mikro; l PCR-Röhrchen</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbehälter mit dicht schließendem Deckel</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Zum Halten von Drierite</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Einwegtücher</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Paraffinfilm</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC gereinigte 5'-markierte Oligonukleotide</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>Cy3-markierte Sonden, die die 359 bp Satellitenwiederholung des X-Chromosoms erkennen</td></tr><tr><td>Volocity 3D-Bildanalysesoftware</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Version 6.3</td></tr></tbody></table>

fluoreszenz in situ hybridisierung (fish) verwenden, um den zustand der arm zusammenhalt im prometaphase und metaphase überwachen ich drosophila eizellen

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Beim Menschen sind Chromosom Abtrennung Fehler in Eizellen verantwortlich für die meisten Fehlschläge und Geburtsschäden. Außerdem ist, wie Frauen im Alter, ist ihr Risiko zu konzipieren, dass eine Aneuploidie Fötus drastisch erhöht und dieses Phänomen als mütterliches Alter-Effekt bekannt. Eine Voraussetzung für präzise Chromosom Trennung während der meiotischen Divisionen sind Wartung der Schwester Chromatids Zusammenhalt in der erweiterten Prophase-Zeit, die Eizellen zu erleben. Zytologische Nachweis bei Menschen und Modellorganismen zufolge meiotische Zusammenhalt während der Alterungsprozess verschlechtert sich. Darüber hinaus Segregation Fehler in der menschlichen Eizellen sind am häufigsten während der Meiose I, Einklang mit vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt. Die Verwendung von Modellorganismen ist entscheidend für die Entschlüsselung der Mechanismen, die altersabhängigen Verlust der Kohäsion zugrunde liegen. Drosophila Melanogaster bietet mehrere Vorteile für die Regulierung der meiotischen Zusammenhalt in Eizellen zu studieren. Allerdings waren bis vor kurzem nur genetische Tests zur Verfügung, um für den Verlust von Arm Zusammenhalt in Eizellen von unterschiedlichen Genotypen oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen bestimmen. Hier ist ein detailliertes Protokoll, unter der Voraussetzung für die Verwendung von Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) direkt zu visualisieren Mängel an Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen verhaftet. Erzeugen eine Fisch-Sonde, die am distalen Arm des x-Chromosoms hybridisiert und konfokale Z-Stapel zu sammeln, kann Forscher die Anzahl der einzelnen Fische Signale in drei Dimensionen zu visualisieren und festzustellen, ob Schwester Chromatids Arme sind getrennt. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es, Arm Zusammenhalt Mängel in Hunderten von Drosophila Eizellen zu quantifizieren. Als solches stellt diese Methode ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die zum Zusammenhalt Wartung sowie die Faktoren, die zu seinem Untergang, während der Alterungsprozess führen beitragen.

Abbildung 5 zeigt Bilder, die mit einem Arm-Sonde, zytologische Region 6E-7 b auf dem x-Chromosom hybridisiert . Diese Testergebnisse in ein Signal, das gemeinsam mit der DAPI lokalisiert, unterscheidet sich leicht vom Hintergrund und wird bereits erfolgreich eingesetzt, Arm Zusammenhalt Mängel in verschiedenen Genotypen19zu quantifizieren. Quantifizierung der Zusammenhalt Mängel beschränkt war, prometaphase ich und Metaphase ...

Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, FISH-Sonden zu generieren und den Zustand der meiotischen Armkohäsion in Drosophila-Oozyten während der ersten und ersten Prometaphase zu visualisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, den Zustand der Armkohäsion in prometaphase- und metaphase-eins-gestoppten Drosophila-Eizellen zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Drosophila-Meiose zu beantworten, z. B. welche Bedingungen führen zu einem vorzeitigen Verlust der Armkohäsion?Diese Technik hat das Potenzial, unser Verständnis des Effekts des mütterlichen Alters beim Menschen zu erweitern, der zumindest teilweise darauf zurückzuführen ist, dass sich die meiotische Kohäsion mit zunehmendem Alter der Eizellen verschlechtert. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Erzeugung der Armsonde für FISH sowie der Dissektion und Fixierung von Eizellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Eizellen im Spätstadium zu trennen, geben Sie zunächst einen Milliliter PBSBTX in eine flache Präparierschale.Verwenden Sie dann einen P-200 mit einer BSA-beschichteten Spitze, um fixierte Eierstöcke in die flache Schale zu übertragen

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Das Kinetochor ist, wo der SAC initiiert sein Signal Überwachung der mitotischen Segregation der Schwesterchromatiden. Es wird eine Methode beschrieben, um die Rekrutierung und den Umsatz von einer der Kinetochorproteine ​​und ihre Abstimmung mit dem Chromosom Bewegung visualisieren,...

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryonen

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Dieses Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Protokoll ist optimiert, um die Anzahl der RNA-Moleküle in der angehenden Hefe während des vegetativen Wachstums und Meiose zu quantifizieren.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um die Hybridisierungskettenreaktion mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (HCR-FISH) in den optischen Lappen der Drosophila melanogaster-Larve durchzuführen. Verfahren für Sondendesign, Hybridisierung, Amplifikation und Gewebemontage werden detailliert beschrieben, um die Visualisierung des sich entwickelnden Optikuslappens zu erleichtern.

Hybridisierungskettenreaktion FISH im sich entwickelnden Drosophila-Optikuslappen

Lernen Sie FISH-Probenherstellung und Visualisierung meiotischer Arm-Kohäsion in Drosophila-Oozyten während Prometaphase und Metaphase. Diese Methode ermöglicht Forschern, den Zustand der Schwesterchromatidenkohäsion zu untersuchen.

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen (Video) | JoVE Journal

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

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