Fertigung-Verfahren und Doppelbrechung Messungen für die Gestaltung von magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Phospholipid-Baugruppen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochmagnetisch ansprechende polymolekulare Lanthanid-Ionen-Chelat-Anordnungen herzustellen und die magnetische Reaktion mit Doppelbrechungsmessungen einfach zu überwachen. Doppelbrechungsmessungen können dazu beitragen, Schlüsselfragen beim Design von magnetisch ansprechenden polymolekularen Anordnungen, wie z. B. Bizellen, zu beantworten, indem sie eine alternative und vergleichsweise einfache Möglichkeit zur Überwachung der Ausrichtung bieten. Der Hauptvorteil dieser polymolekularen Anordnungen ist die Fähigkeit, eine unverfeinerte und abstimmbare magnetische Reaktion bei einer Feldstärke von nur einem oder zwei Tesla zu liefern, indem sie mit Zahlen pro magnetischem Lanthanoid-Ion assoziiert wird.

Obwohl die Überwachung des Doppelbrechungssuchers wichtige Informationen für das Bicelles-Design liefert, kann sie auch für die Untersuchung anderer magnetisch ansprechender Systeme verwendet werden, wie z. B. neurokristalline Sedolos oder Amyloidfasern, die mit Eisenoxid-Nanopartikeln dotiert sind. Verwenden Sie zu Beginn des Verfahrens eine 2,5-Milliliter-Glasspritze und drei Milliliter-Fläschchen mit Schnappverschluss, um die erforderlichen Mengen an DMPC-, DMPE-DTPA-, Cholesterin- und Thulium(III)chlorid-Stammlösungen zu messen. Die Stammlösungen werden in einem 25-Milliliter-Rundkolben kombiniert.

Jede Durchstechflasche wird mit 2,5 ml des in der entsprechenden Stammlösung verwendeten Lösungsmittels in den Kolben gespült. Klemmen Sie den Kolben auf einen Rotationsverdampfer. Entfernen Sie das Lösungsmittel bei 40 Grad Celsius unter 30.000 Pascal aus der Mischung, bis nur noch ein viskoser transparenter Film übrig bleibt.

Reduzieren Sie den Druck auf 100 Pascal und entnehmen Sie die Probe mindestens zwei Stunden lang, um einen trockenen Lipidfilm zu erhalten. Spülen Sie dann den Kolben eine Minute lang mit Argon. Verschließen Sie den Kolben mit Paraffinfolie und lagern Sie die Probe bei 18 Grad Celsius.

Wenn Sie bereit sind, das Lipid zu rehydrieren, geben Sie drei Milliliter 15 Millimolar pH 7,4 Phosphatpuffer in den Kolben. Der Kolben wird in einem Flüssigstickstoffbad gedreht, bis die Probe vollständig gefroren ist, was sich daran zeigt, dass der flüssige Stickstoff nicht mehr siedet. Drehen Sie dann den Kolben 5 Minuten lang in einem Wasserbad bei 60 Grad Celsius.

Sobald die Probe vollständig flüssig ist, wirbeln Sie die Probe 30 Sekunden lang ein. Nach dem letzten Gefrierschritt wird die Probe mit zwei Heiz-Kühl-Zyklen stabilisiert. Besorgen Sie sich zunächst spurgeätzte Polycarbonat-Membranfilter mit der gewünschten Porengröße für die Extrusion.

Beginnen Sie mit dem Zusammenbau eines 10-Milliliter-Lipidextruders mit einem ummantelten Probengefäß, das von einer Pinzette mit Silikonspitze unterstützt wird. Verwenden Sie ein paar Tropfen Phosphatpuffer, um das Stütznetz und die Polyester-Ablaufscheibe für eine optimale Platzierung des Membranfilters zu befeuchten. Legen Sie den O-Ring vorsichtig auf den Membranfilter.

Stellen Sie sicher, dass sich keine Falten oder Falten auf der Membran befinden. Schließen Sie die Montage des Lipidextruders ab und schließen Sie das ummantelte Probengefäß an einen temperaturgesteuerten Wasserkreislauf an. Erhitzen Sie das Umwälzwasserbad auf 60 Grad Celsius und starten Sie die Zirkulation.

Schließen Sie den Extruder mit Hochdruck-PVC-Schläuchen und Schnellkupplungen an eine unter Druck stehende Stickstoffgasflasche an. Stellen Sie den Extrusionsdruck auf den für die Porengröße der Membran geeigneten Wert ein. Verwenden Sie eine Zwei-Milliliter-Glaspipette, um die Probe in das ummantelte Gefäß zu geben.

Schließen Sie das Gefäß und lassen Sie die Probe 30 bis 60 Sekunden lang äquilibrieren. Legen Sie das Ende des Probenauslassrohrs in den Probenkolben. Öffnen Sie dann den Stickstofffluss zum Extruder, während Sie das Probenauslassrohr ruhig halten.

Sobald die Probenextrusion abgeschlossen ist, entlüften Sie den Extruder und verwenden Sie dieselbe Zwei-Milliliter-Glaspipette, um die extrudierte Probe in das ummantelte Gefäß zu übertragen. Führen Sie auf diese Weise 10 Extrusionszyklen durch. Ersetzen Sie den Membranfilter, wenn er zu verstopfen beginnt.

Wiederholen Sie die Extrusion durch kleinere Porengrößen wie gewünscht. Schalten Sie das Doppelbrechungsmessgerät ein und richten Sie es ein. Geben Sie die Probe dann in eine temperaturkontrollierte Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 10 Millimetern.

Schließen Sie die Küvette an ein externes Wasserbad an, das auf fünf Grad Celsius eingestellt ist. Führen Sie ein 0,5 Millimeter dickes k-Typ-Thermoelement durch eine Öffnung in der Kappe in die Probe ein. Passen Sie die Temperatur im Wasserbad basierend auf dem Thermoelementmesswert an, bis die Probe fünf Grad Celsius erreicht.

Setzen Sie die Küvette in die Bohrung des Magneten ein. Vergewissern Sie sich, dass sich das Thermoelement nicht im Lasergang befindet, indem Sie ein Blatt Papier über die Küvette hinaus in den Lasergang halten und nach Schatten suchen, die vom Thermoelement geworfen werden. Es ist wichtig, die Temperatur der Probe direkt zu überwachen, aber die Sonde darf dem Laserlicht nicht im Weg sein.

Dies lässt sich leicht überprüfen, indem man das weiße Papier hinter der Küvette in den Lasergang legt und nach Schatten sucht. Wenden Sie einen gleichmäßigen Strom von trockener Druckluft bei Raumtemperatur mit 10.000 Pascal auf die Küvette an, um die Bildung von Kondenswasser zu vermeiden. Wählen Sie die Empfindlichkeitsmultiplikatoren des Verstärkers aus, um sicherzustellen, dass der Verstärker nicht überlastet wird und nicht mehr als vier rote Balken auf dem Display angezeigt werden.

Als nächstes autofazieren Sie beide Lock-in-Verstärker. Die Trübung der Probe kann sich während eines Temperaturzyklus aufgrund polymolekularer Umlagerungen dramatisch ändern. Die höchste Trübungen treten in der Regel bei niedrigen Temperaturen auf und um eine Signalüberlastung beim Erhitzen zu vermeiden, darf die Empfindlichkeit nicht zu hoch auf fünf Grad Celsius eingestellt werden.

Geben Sie den Namen des Samples und die Empfindlichkeiten des Lock-in-Verstärkers ein. Geben Sie einen Dateinamen für die Messung ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten. Erhöhen Sie dann das Magnetfeld mit dem Messprogramm auf 5,5 Tesla.

Erfassen Sie Doppelbrechungssignaldaten bei verschiedenen Probentemperaturen und Magnetfeldstärken nach Wunsch. Das Doppelbrechungssignal von cholesterindotierten Bizellen, die durch Membranen mit 800 Nanometer-Poren extrudiert wurden, nahm mit zunehmender Magnetfeldstärke zu, wobei die maximale Doppelbrechung bei 5,5 Tesla erreicht wurde. Sukzessive Extrusionen bei 60 Grad Celsius durch Membranen mit abnehmender Porengröße führten zu sinkenden Doppelbrechungswerten bei fünf Grad Celsius.

Es wurde auch eine Verringerung des absoluten Alignment-Faktors beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die magnetische Ausrichtung durch Anpassung der Bizellengrößen durch Extrusion ihrer Vesikelvorläufer abgestimmt werden kann. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie täglich durchgeführt werden, um viele Proben effektiv zu screenen und die vielversprechendsten Kandidaten zu identifizieren, um optimale magnetische Reasebindungen des erforderlichen Temperaturbereichs zu liefern.

Nach der erfolgreichen Identifizierung der vielversprechendsten Probe mit diesem Verfahren können Methoden wie die Kleinwinkel-Neutronenstreuung oder die Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Struktur der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Anordnungen zu beantworten. Bei der Arbeit mit Lipidanordnungen, wie den hier vorgestellten Bizellen, ist es wichtig, mit sauberen Glaswaren in einer ruhigen Umgebung zu arbeiten. Wir empfehlen, für diese Arbeit Glaswaren zu verwenden und mit Chloroform zu waschen.