Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu identifizieren, welche Regionen der mRNA in Proteine übersetzt werden, die Proteintranslation in knospenden Hefepilzen (Saccharomyces cerevisiae) auf genomweiter Ebene quantitativ zu messen. Das Ribosomen-Profiling kann verwendet werden, um die Rate von Proteinen und Krankheiten zu überwachen und die Mechanismen der translationalen Regulation zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zu anderen Methoden eine viel höhere Empfindlichkeit bietet, und zwar bei der Messung von Proteinen und Krankheiten in vivo mit einer einzigen Kontaktauflösung.

Obwohl dieses Protokoll spezifisch für knospende Hefen ist, ist es auch nützlich für Forscher, die versuchen, Ribosomen-Profiling in anderen Modellsystemen, wie z. B. Säugetierzellen und -geweben, zu etablieren. Die Extrakte werden aus Hefezellen hergestellt, die bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet wurden. Verwenden Sie eine Glashalterfilterbaugruppe, um die Kultur durch 0,45-Mikromembranfilter zu filtern.

Das Pellet mit dem Spatel abkratzen, in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Geben Sie drei 3,2 Millimeter große Chromstahlperlen in ein 1,8 Milliliter Edelstahlrohr und kühlen Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff vor. Fügen Sie die gefrorenen Pellets hinzu und decken Sie das Stahlrohr mit einer Silikongummikappe ab.

Homogenisieren Sie die Probe durch Kryomahlen für 10 Sekunden bei 4200 U/min. Um die Proben während des gesamten Mahlvorgangs eingefroren zu halten, ist es wichtig, das Röhrchen zwischen jedem Mahlvorgang mindestens 10 Sekunden lang in flüssigem Stickstoff zu kühlen. Wenn die Homogenisierung abgeschlossen ist, fügen Sie der Probe einen Milliliter Lysepuffer hinzu, der Cycloheximid enthält.

Durch Pipettieren gut mischen und die Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 20.000 g bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Übertragen Sie 100 Mikroliter Lysat in ein weiteres neues 1,5-Milliliter-Röhrchen für die Poly(A)mRNA-Isolierung. Schockfrosten Sie die Röhrchen mit den mRNA-Proben auf dem Rest des Lysats, das für die Fußabdruckextraktion in flüssigem Stickstoff verwendet wird, und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. In der Nacht vor der Extraktion des Fußabdrucks tauen die zuvor vorbereiteten Saccharosegradienten bei vier Grad Celsius auf.

Tauen Sie am nächsten Tag das Zelllysat auf Eis auf. Ein Aliquot des Zelllysats mit 50 OD260-Einheiten wird in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt, frischer Lysepuffer bis zu einem Milliliter und 10 Mikroliter RNase ein Milliliter hinzugefügt. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit sanfter Drehung auf einem Hals-über-Kopf-Rotator.

Als nächstes schichten Sie die Lysatprobe vorsichtig auf einen Saccharosegradienten von 10 % bis 50 % in Polymerröhrchen. Mit einem SW41 ti-Rotor zentrifugieren Sie drei Stunden lang bei 35.000 U/min bei vier Grad Celsius. Während der Ultra-Cetrifugation das Gradientenfraktionierungssystem einrichten.

Schalten Sie die Komponenten ein und lassen Sie den UV-Monitor mindestens 30 Minuten lang aufwärmen. Füllen Sie die Spritze mit Chase-Lösung und entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze und der Kanüle. Wenn die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, setzen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit dem Saccharosegradienten ein und stechen Sie es durch.

Starten Sie die Spritzenpumpe mit einem Milliliter pro Minute und sammeln Sie einen Milliliter Fraktionen, während Sie die A254-Werte überwachen. Fraktionen, die den ADS-Monosom-Peak repräsentieren, werden gesammelt und gepoolt. Filtrieren Sie die Fraktionen 10 Minuten lang durch 0,5-Milliliter-Zentrifugalfilter bei 12.000 g bei vier Grad Celsius, verwerfen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie den Vorgang, bis das Volumen weniger als 100 Mikroliter beträgt.

Bei 400 Mikrolitern Freisetzungspuffer, der durch Pipettieren gemischt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert wird, wird das Gerät in ein neues Sammelröhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 12.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Sammeln Sie den Durchfluss. Anschließend reinigen Sie die Fußabdruckfragmente und fällen Sie die Proben mit Ethanolfällung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um dieses Verfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie den ausgefällten Fußabdruck und die fragmentierten mRNA-Proben bei 20.000 g und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nach dem Entfernen des Ethanols und dem Lufttrocknen der Pellets suspendieren wir jedes Pellet in 7,75 Mikrolitern Wasser. Fügen Sie zu jedem Pellet einen Mikroliter 10XT4-Polynukleotidkinase-Puffer, einen Mikroliter T4-Polynukleotidkinase und 0,25 Mikroliter RNase-Inhibitor hinzu.

Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie 10 Mikroliter 2X FSME-Harnstoffprobenpuffer zu 10 Mikrolitern jeder Fußabdruck- und mRNA-Probe. Inkubieren Sie die Proben und die entsprechenden Kontrollen drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius, schleudern Sie sie herunter und legen Sie sie eine Minute lang auf Eis.

Jede Probe wird in zwei Vertiefungen eines 15%igen TBE-Harnstoffgels geladen und die RNA-Fragmente durch Gelelektrophorese bei 180 Volt für eine Stunde getrennt. Färben Sie das Gel mit einem Nukleinsäure-Gel-Fleck, der fünf Minuten lang vor Licht geschützt ist. Während Sie das Gel unter einem Blaulicht-Transilluminator visualisieren, exzitieren Sie die richtige Bande zwischen 28 und 32 Nukleotiden für Fußabdruckproben und etwa 50 bis 70 Nukleotide für mRNA-Proben.

Frieren Sie die herausgeschnittenen Polyacrylamid-Gelstücke mindestens 10 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius ein, bevor Sie RNA aus dem Polyacrylamid-Gel extrahieren. Vor der reversen Transkription führen Sie eine Ligation mit drei Prime-Adaptern durch und fällen Sie die Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Resuspendieren Sie jedes Pellet in 11,5 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser.

Fügen Sie dann 0,5 Mikroliter acht mikromolare Reverse-Transkriptionsprimer und einen Mikroliter dNTP-Mix hinzu. Bei 65 Grad Celsius fünf Minuten inkubieren und dann auf Eis legen. Zu jeder Probe werden vier Mikroliter 5x Erststrangpuffer, zwei Mikroliter 0,1 molares DTT, 0,5 Mikroliter RNase-Inhibitor und 0,5 Mikroliter reverse Transkriptase hinzugefügt.

Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 48 Grad Celsius, eine Minute lang 65 Grad Celsius und fünf Minuten lang 80 Grad Celsius. Fahren Sie sofort mit der Hydrolyse der RNA fort, indem Sie jeder Probe 0,8 Mikroliter zweimolares Natriumhydroxid zusetzen und 30 Minuten lang bei 98 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie 0,8 Mikroliter zweimolaren Chlorwasserstoff hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren.

Nach der Ausfällung der Proben, wie im Textprotokoll beschrieben, resuspendieren Sie jedes Pellet in fünf Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und fügen Sie fünf Mikroliter 2x FSME-Harnstoff-Probenpuffer hinzu. Drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius inkubieren, herunterschleudern und eine Minute lang einfrieren. Laden Sie die Probe in eine Vertiefung mit einem 10%igen TBE-Harnstoffgel.

Die Produkte der reversen Transkriptionsreaktion werden durch Gelelektrophorese 180 Volt für 50 Minuten getrennt. Färben Sie das Gel fünf Minuten lang mit einem Nukleinsäure-Gel-Fleck, der vor Licht geschützt ist. Schneiden Sie mit einem Blaulicht-Transilluminator die Bande um 128 Nukleotide und höher heraus.

Frieren Sie die Polyacrylamid-Gelstücke mindestens 10 Minuten bei minus 80 Grad Celsius ein, bevor Sie DNA aus dem Polyacrylamid-Gel extrahieren. Um die DNA zu zirkulieren, resuspendieren Sie jedes DNA-Pellet in 16,75 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Fügen Sie zwei Mikroliter 10x einzelsträngigen DNA-Lygaspuffer, einen Mikroliter 50 millimolares Manganchlorid und 0,25 Mikroliter einzelsträngige DNA-Ligase hinzu.

Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius, gefolgt von 80 Grad Celsius für 10 Minuten. Lagern Sie das einzelsträngige DNA-Ligationsreaktionsprodukt ohne Ausfällung bei minus 20 Grad Celsius. Führen Sie anschließend eine PCR-Bibliotheksamplifikation durch, gefolgt von einer Bibliotheksquantifizierung und einer Hochdurchsatzsequenzierung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Gezeigt werden repräsentative Bio-Analyzer-Profile der PCR-amplifizierten Footprint-Bibliothek und der Sequenzierungsbibliothek für mRNA-Proben. Die erwartete durchschnittliche Größe der Footprint-Bibliothek beträgt 148 bis 152 Nukleotide, und die erwartete Größe der mRNA-Bibliothek beträgt 170 bis 190 Nukleotide. Dieses Diagramm zeigt die kombinierte Anzahl von mRNA-, Footprint- und rRNA-Reads, die für zwei unabhängige biologische Replikate einer Wildtyp-Probe und der hbs1-Deletionsmutante erhalten wurden.

50 % bis 60 % aller sequenzierten Reads in den Footprint-Bibliotheken entsprachen Ribosomen-geschützten Footprint-Fragmenten. Im Gegensatz dazu wurden nur 3% der rRNA-Fragmente in mRNA-Bibliotheken beobachtet, was zeigt, dass die Poly(A)mRNA-Isolierung eine effektive Eliminierung von rRNA-Reads ermöglicht. Sowohl die Footprint- als auch die mRNA-Probenbibliotheken zeigen eine gute Reproduzierbarkeit, was durch einen Pearson-Korrelationskoeffizienten von etwa 0,99 zwischen übereinstimmenden Proben angezeigt wird.

In Kombination mit mRNA-Abundanzmessungen ermöglicht das Ribosomen-Profiling die Messung von Änderungen der Translationseffizienz zwischen experimentellen Bedingungen. Signifikant hoch- und herunterregulierte Gene in der hbs1-Deletionsmutante werden danach gruppiert, ob sie von einer Veränderung der mRNA-Transkription, der Translationseffizienz oder von einem gemeinsamen Effekt beeinflusst werden. Sobald das gesamte Protokoll gemeistert ist, kann es in etwa 11 Tagen durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Handschuhe zu tragen und alle Schritte mit RNase-freien Reagenzien und Verbrauchsmaterialien durchzuführen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden und das Risiko eines RNA-Abbaus in den Proben zu verringern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ribosomen-Fußabdrücke mithilfe des Nukleaseverdschlusses generiert, intakte Ribosomen-Fußabdruck-Komplexe durch Saccharose-Gradientenfraktionierung isoliert und DNA-Bibliotheken für die Tiefensequenzierung vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann und dass beim Umgang mit extrem kalten Materialien immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille und Kryohandschuhe getroffen werden sollten.