Name: Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Erfahren Sie Ribosom-Profiling zur genomweiten Quantifizierung der Translation in Saccharomyces cerevisiae. Diese hochsensitive Methode ermöglicht die Analyse von Proteinbiosynthese und regulatorischen Mechanismen in vivo.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Stipendien, AG040191 und AG054566, VML unterstützt. Diese Studie wurde durchgeführt, während VML ein AFAR Research Grant von der American Federation for Aging Research erhielt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die Ribo-Seq-Ansatz ist eine leistungsstarke Technologie für die Analyse von mRNA Übersetzung in Vivo bei der Genom-weite Ebene 3entstanden. Studien mit diesem Ansatz, der ermöglicht die Überwachung von Übersetzung mit Single-Codon Auflösung, hat zu unserem Verständnis der translational Regelung beigetragen. Trotz seiner Vorteile hat Ribo-Seq mehrere Einschränkungen. Ribosomale RNA (rRNA) Fragmente sind immer Co gereinigten während Isolierung des Ribosom-geschützte Fußabdrücke verringern ...

mRNA Übersetzung ist eines der grundlegenden Prozesse in der Zelle, die eine wichtige bei der Regulierung der Proteinexpression Rolle. Daher wird die mRNA Übersetzung als Reaktion auf verschiedene interne und externe physiologischen Reize 1,2streng kontrolliert. Allerdings bleiben die Mechanismen der translationalen Verordnung erforschten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung. Das übergeordnete Ziel der Ribosom Profilerstellungs-Technik ist, zu studieren und die Übersetzung von spezifischen mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen zu quantifizieren. Diese Technik nutzt Next Generation Sequencing, um Ribosom Belegung im gesamten Genom quantitativ zu analysieren und ermöglicht die Überwachung der Rate des Protein-Synthese in Vivo auf der einzigen Codon Resolution 3,4. Derzeit, diese Methode bietet die modernsten Mittel zur Messung der Niveaus von Protein Übersetzung und hat sich als ein nützliches Discovery-Tool die Informationen, die von anderen derzeit verfügbaren Techniken, z.B. Microarrays offenbart werden kann nicht oder Übersetzung Status Array-Analyse (TSAA) 5. Als Ribosom Profilierung Berichte über die kombinierte Veränderungen in Abschrift Ebenen und translationale Ausgabe bietet es auch viel mehr Sensibilität gegenüber anderen Methoden.
Dieser Ansatz basiert auf Tiefe Sequenzierung des Ribosom-geschützte mRNA Fragmenten 3. Während der Protein-Übersetzung, Ribosomen zu schützen ~ 28 nt Teile der mRNA (so genannte Fußabdrücke) 6. Durch die Bestimmung der Reihenfolge der Fragmente Ribosom geschützt, kann Ribo-Seq ordnen Sie die Position der Ribosomen auf die übersetzten mRNA und ermitteln, welche Regionen der mRNA Protein 3,7aktiv übersetzt werden dürften. Darüber hinaus können wir die Übersetzung von mRNA quantitativ messen, durch zählen der Anzahl der Spuren, die zu einem bestimmten mRNA-Transkript ausgerichtet.
Um das Ribosom-geschützten Fragmente zu isolieren, sind Zelle Lysates zunächst mit einem Inhibitor der Übersetzung, die Ribosomen, gefolgt von Ribonuklease Verdauung stall behandelt. Während kostenlose mRNA und Teile der übersetzten mRNAs nicht geschützt von Ribosomen von Ribonuklease abgebaut werden, können die Ribosom geschützt mRNA Fragmenten durch Reinigung intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe wiederhergestellt werden. Diese mRNA Fußabdrücke sind dann in cDNA Bibliothek umgewandelt und durch tiefe Sequenzierung (Abbildung 1) analysiert. Parallel zur Profilerstellung Ribosom ist intakt mRNA aus derselben Probe extrahiert und sequenziert. Durch Vergleich des Übersetzung von Ribo-Seq mit mRNA Fülle Messungen identifiziert, können wir identifizieren Gene, speziell Up - oder Down-reguliert auf der Ebene der Übersetzung und Übersetzung Effizienz der mRNA auf Genom-weite Ebene zu berechnen. Während des Protokolls, die in diesem Artikel beschriebenen spezifisch für Hefe ist, sollte es auch nützlich für Forscher, die versuchen, das Ribo-Seq-Protokoll in andere Systeme zu etablieren.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; M Membranfilter</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Zentrifugalfilter (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 bei 4°; C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X FSME-Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% FSME-Harnstoffgel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% FSME-Harnstoffgel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X FSME-Harnstoff-Probenpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5,5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/&mu; L)</td><td>Epizentrum</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Nukleinsäure-Probenladepuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE-Gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Säure-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (mit IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Blaulicht-Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Chrom-Stahl-Kügelchen, 3,2 mm</td><td>BioSpec Produkte</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Kryoschleifer</td><td>Biospec Produkt</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Desoxynukleotid (dNTP) Lösungsmischung (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Gradientenfraktionierungssystem</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase (2.000 U/ml)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Lieferung mit 5X Phusion HF-Puffer</td></tr><tr><td>Quantifizierungskit für Next-Generation-Sequencing-Bibliothek</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Nukleinsäure-Gelfärbung</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)-mRNA-Isolationskit</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J-Exonuklease (10 U/&mu; L)</td><td>Epizentrum</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase (200 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Lieferung mit 5x Erststrangpuffer und 0,1 M DTT</td></tr><tr><td>RNA-Fragmentierungspuffer</td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Hemmer (20 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Silikonkautschuk-Kappen</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA-Ligase (100 U/&mu; L)</td><td>Epizentrum</td><td>CL9021K</td><td>Lieferung mit 10X CircLigase II Puffer und 50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Mikrofläschchen aus Edelstahl, 1,8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>T4-Polynukleotidkinase (10.000 U/ml)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Lieferung mit 10x T4-Polynukleotidkinase-Puffer</td></tr>, <tr><td>T4-RNA-Ligase 2 verkürztes KQ (200.000 U/ml)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Lieferung mit 10x T4-RNA-Ligase-Puffer und 50 % PEG8000</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>dünnwandige Polyallomerröhrchen, 13,2 mL</td><td>Beckman-Schar</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>UV-Monitor</td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae Stamm BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

genomweite quantifizierung der Übersetzung in der angehenden hefe durch ribosom profilierung

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Übersetzung von mRNA in Proteine ist ein komplexer Prozess mit mehreren Schichten der Verordnung. Es wird oft angenommen, dass Veränderungen in der mRNA-Transkription in der Proteinsynthese Änderungen, aber viele Ausnahmen eingehalten worden. Vor kurzem hat sich eine Technik namens Ribosom Profilierung (oder Ribo-Seq) eine leistungsfähige Methode entwickelt, die Identifizierung, mit hoher Genauigkeit ermöglicht, welche Regionen der mRNA in Proteine und Quantifizierung des Übersetzungsdienstes der Genom-weite Ebene umgesetzt werden. Hier präsentieren wir Ihnen eine generalisierte Protokoll für genomweite Quantifizierung der Übersetzung mittels Ribo-Seq angehende Hefe. Darüber hinaus ermöglicht Kombination Ribo-Seq-Daten mit mRNA Fülle Messungen gleichzeitig Übersetzung Effizienz von Tausenden von mRNA Transkripte in der gleichen Probe zu quantifizieren und Änderungen dieser Parameter als Reaktion auf experimentelle vergleichen Manipulationen oder in verschiedenen physiologischen Zuständen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Ribosom Fußabdrücke mit Nuklease Verdauung, Isolierung von intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe über Saccharose gradient Fraktionierung und Vorbereitung von DNA-Bibliotheken für tiefe Sequenzierung zusammen mit entsprechenden Qualitätskontrollen notwendig, genaue Analyse der in Vivo Übersetzung zu gewährleisten.

Detaillierten Rohrleitungen für bioinformatische Analyse der Ribosom Profilerstellungsdaten wurden 8,9beschrieben. Darüber hinaus haben mehrere Forschungsgruppen entwickelt Bioinformatik für differenzielle gen Ausdruck Analyse und Aufbereitung von Sequenzierungsdaten, die spezifisch für Ribosom Profilerstellung Methode 10,11,12 ,</s...

Translational Regelung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Protein Fülle. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Analyse der Übersetzung in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu identifizieren, welche Regionen der mRNA in Proteine übersetzt werden, die Proteintranslation in knospenden Hefepilzen (Saccharomyces cerevisiae) auf genomweiter Ebene quantitativ zu messen. Das Ribosomen-Profiling kann verwendet werden, um die Rate von Proteinen und Krankheiten zu überwachen und die Mechanismen der translationalen Regulation zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zu anderen Methoden eine viel höhere Empfindlichkeit bietet, und zwar bei der Messung von Proteinen und Krankheiten in vivo mit einer einzigen Kontaktauflösung.Obwohl dieses Protokoll spezifisch für knospende Hefen ist, ist es auch nützlich für Forscher, die versuchen, Ribosomen-Profiling in anderen Modellsystemen, wie z. B. Säugetierzellen und -geweben, zu etablieren. Die Extrakte werden aus Hefezellen hergestellt, die bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet wurden. Verwenden Sie eine Glashalterfilterbaugruppe, um die Kultur durch 0,45-Mikromembranfilter zu filtern.Das Pellet mit dem Spatel abkratzen, in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Geben Sie drei 3,2 Millimeter große Chromstahlperlen in ein 1,8 Milliliter Edelstahlrohr und kühlen Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff vor. Fügen Sie die gefrorenen Pellets hinzu und decken Sie das Stahlrohr mit einer Silikongummikappe ab.Homogenisieren Sie die Probe durch Kryomahlen für 10 Sekunden bei 4200 U/min. Um die Proben während des gesamten Mahlvorgangs eingefroren zu halten, ist es wichtig, das Röhrchen zwischen jedem Mahlvorgang mindestens 10 Sekunden lang in flüssigem Stickstoff zu kühlen. Wenn die Homogenisierung abgeschlossen ist, fügen Sie der Probe einen Milliliter Lysepuffer hinzu, der Cycloheximid enthält.Durch Pipettieren gut mischen und die Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 20.000 g bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen.Übertragen Sie 100 Mikroliter Lysat in ein weiteres neues 1,5-Milliliter-Röhrchen für die Poly(A)mRNA-Isolierung. Schockfrosten Sie die Röhrchen mit den mRNA-Proben auf dem Rest des Lysats, das für die Fußabdruckextraktion in flüssigem Stickstoff verwendet wird, und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. In der Nacht vor der Extraktion des Fußabdrucks tauen die zuvor vorbereiteten Saccharosegradienten bei vier Grad Celsius auf.Tauen Sie am nächsten Tag das Zelllysat auf Eis auf. Ein Aliquot des Zelllysats mit 50 OD260-Einheiten wird in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt, frischer Lysepuffer bis zu einem Milliliter und 10 Mikroliter RNase ein Milliliter hinzugefügt. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit sanfter Drehung auf einem Hals-über-Kopf-Rotator.Als nächstes schichten Sie die Lysatprobe vorsichtig auf einen Saccharosegradienten von 10 % bis 50 % in Polymerröhrchen. Mit einem SW41 ti-Rotor zentrifugieren Sie drei Stunden lang bei 35.000 U/min bei vier Grad Celsius. Während der Ultra-Cetrifugation das Gradientenfraktionierungssystem einrichten.Schalten Sie die Komponenten ein und lassen Sie den UV-Monitor mindestens 30 Minuten lang aufwärmen. Füllen Sie die Spritze mit Chase-Lösung und entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze und der Kanüle. Wenn die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, setzen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit dem Saccharosegradienten ein und stechen Sie es durch.Starten Sie die Spritzenpumpe mit einem Milliliter pro Minute und sammeln Sie einen Milliliter Fraktionen, während Sie die A254-Werte überwachen. Fraktionen, die den ADS-Monosom-Peak repräsentieren, werden gesammelt und gepoolt. Filtrieren Sie die Fraktionen 10 Minuten lang durch 0,5-Milliliter-Zentrifugalfilter bei 12.000 g bei vier Grad Celsius, verwerfen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie den Vorgang, bis das Volumen weniger als 100 Mikroliter beträgt.Bei 400 Mikrolitern Freisetzungspuffer, der durch Pipettieren gemischt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert wird, wird das Gerät in ein neues Sammelröhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 12.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Sammeln Sie den Durchfluss. Anschließend reinigen Sie die Fußabdruckfragmente und fällen Sie die Proben mit Ethanolfällung, wie im Textprotokoll beschrieben.Um dieses Verfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie den ausgefällten Fußabdruck und die fragmentierten mRNA-Proben bei 20.000 g und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nach dem Entfernen des Ethanols und dem Lufttrocknen der Pellets suspendieren wir jedes Pellet in 7,75 Mikrolitern Wasser. Fügen Sie zu jedem Pellet einen Mikroliter 10XT4-Polynukleotidkinase-Puffer, einen Mikroliter T4-Polynukleotidkinase und 0,25 Mikroliter RNase-Inhibitor hinzu.Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie 10 Mikroliter 2X FSME-Harnstoffprobenpuffer zu 10 Mikrolitern jeder Fußabdruck- und mRNA-Probe. Inkubieren Sie die Proben und die entsprechenden Kontrollen drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius, schleudern Sie sie herunter und legen Sie sie eine Minute lang auf Eis.Jede Probe wird in zwei Vertiefungen eines 15%igen TBE-Harnstoffgels geladen und die RNA-Fragmente durch Gelelektrophorese bei 180 Volt für eine Stunde getrennt. Färben Sie das Gel mit einem Nukleinsäure-Gel-Fleck, der fünf Minuten lang vor Licht geschützt ist. Während Sie das Gel unter einem Blaulicht-Transilluminator visualisieren, exzitieren Sie die richtige Bande zwischen 28 und 32 Nukleotiden für Fußabdruckproben und etwa 50 bis 70 Nukleotide für mRNA-Proben.Frieren Sie die herausgeschnittenen Polyacrylamid-Gelstücke mindestens 10 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius ein, bevor Sie RNA aus dem Polyacrylamid-Gel extrahieren. Vor der reversen Transkription führen Sie eine Ligation mit drei Prime-Adaptern durch und fällen Sie die Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Resuspendieren Sie jedes Pellet in 11,5 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser.Fügen Sie dann 0,5 Mikroliter acht mikromolare Reverse-Transkriptionsprimer und einen Mikroliter dNTP-Mix hinzu. Bei 65 Grad Celsius fünf Minuten inkubieren und dann auf Eis legen. Zu jeder Probe werden vier Mikroliter 5x Erststrangpuffer, zwei Mikroliter 0,1 molares DTT, 0,5 Mikroliter RNase-Inhibitor und 0,5 Mikroliter reverse Transkriptase hinzugefügt.Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 48 Grad Celsius, eine Minute lang 65 Grad Celsius und fünf Minuten lang 80 Grad Celsius. Fahren Sie sofort mit der Hydrolyse der RNA fort, indem Sie jeder Probe 0,8 Mikroliter zweimolares Natriumhydroxid zusetzen und 30 Minuten lang bei 98 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie 0,8 Mikroliter zweimolaren Chlorwasserstoff hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren.Nach der Ausfällung der Proben, wie im Textprotokoll beschrieben, resuspendieren Sie jedes Pellet in fünf Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und fügen Sie fünf Mikroliter 2x FSME-Harnstoff-Probenpuffer hinzu. Drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius inkubieren, herunterschleudern und eine Minute lang einfrieren. Laden Sie die Probe in eine Vertiefung mit einem 10%igen TBE-Harnstoffgel.Die Produkte der reversen Transkriptionsreaktion werden durch Gelelektrophorese 180 Volt für 50 Minuten getrennt. Färben Sie das Gel fünf Minuten lang mit einem Nukleinsäure-Gel-Fleck, der vor Licht geschützt ist. Schneiden Sie mit einem Blaulicht-Transilluminator die Bande um 128 Nukleotide und höher heraus.Frieren Sie die Polyacrylamid-Gelstücke mindestens 10 Minuten bei minus 80 Grad Celsius ein, bevor Sie DNA aus dem Polyacrylamid-Gel extrahieren. Um die DNA zu zirkulieren, resuspendieren Sie jedes DNA-Pellet in 16,75 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Fügen Sie zwei Mikroliter 10x einzelsträngigen DNA-Lygaspuffer, einen Mikroliter 50 millimolares Manganchlorid und 0,25 Mikroliter einzelsträngige DNA-Ligase hinzu.Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius, gefolgt von 80 Grad Celsius für 10 Minuten. Lagern Sie das einzelsträngige DNA-Ligationsreaktionsprodukt ohne Ausfällung bei minus 20 Grad Celsius. Führen Sie anschließend eine PCR-Bibliotheksamplifikation durch, gefolgt von einer Bibliotheksquantifizierung und einer Hochdurchsatzsequenzierung, wie im Textprotokoll beschrieben.Gezeigt werden repräsentative Bio-Analyzer-Profile der PCR-amplifizierten Footprint-Bibliothek und der Sequenzierungsbibliothek für mRNA-Proben. Die erwartete durchschnittliche Größe der Footprint-Bibliothek beträgt 148 bis 152 Nukleotide, und die erwartete Größe der mRNA-Bibliothek beträgt 170 bis 190 Nukleotide. Dieses Diagramm zeigt die kombinierte Anzahl von mRNA-, Footprint- und rRNA-Reads, die für zwei unabhängige biologische Replikate einer Wildtyp-Probe und der hbs1-Deletionsmutante erhalten wurden.50 % bis 60 % aller sequenzierten Reads in den Footprint-Bibliotheken entsprachen Ribosomen-geschützten Footprint-Fragmenten. Im Gegensatz dazu wurden nur 3% der rRNA-Fragmente in mRNA-Bibliotheken beobachtet, was zeigt, dass die Poly(A)mRNA-Isolierung eine effektive Eliminierung von rRNA-Reads ermöglicht. Sowohl die Footprint- als auch die mRNA-Probenbibliotheken zeigen eine gute Reproduzierbarkeit, was durch einen Pearson-Korrelationskoeffizienten von etwa 0,99 zwischen übereinstimmenden Proben angezeigt wird.In Kombination mit mRNA-Abundanzmessungen ermöglicht das Ribosomen-Profiling die Messung von Änderungen der Translationseffizienz zwischen experimentellen Bedingungen. Signifikant hoch- und herunterregulierte Gene in der hbs1-Deletionsmutante werden danach gruppiert, ob sie von einer Veränderung der mRNA-Transkription, der Translationseffizienz oder von einem gemeinsamen Effekt beeinflusst werden. Sobald das gesamte Protokoll gemeistert ist, kann es in etwa 11 Tagen durchgeführt werden.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Handschuhe zu tragen und alle Schritte mit RNase-freien Reagenzien und Verbrauchsmaterialien durchzuführen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden und das Risiko eines RNA-Abbaus in den Proben zu verringern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ribosomen-Fußabdrücke mithilfe des Nukleaseverdschlusses generiert, intakte Ribosomen-Fußabdruck-Komplexe durch Saccharose-Gradientenfraktionierung isoliert und DNA-Bibliotheken für die Tiefensequenzierung vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann und dass beim Umgang mit extrem kalten Materialien immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille und Kryohandschuhe getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

Die Fähigkeit der Zellen, sich an Stress anzupassen, ist entscheidend für ihr Überleben. Die Regulation der mRNA-Translation ist eine solche Anpassungsstrategie, die eine schnelle Regulation des Proteoms ermöglicht. Hier stellen wir ein standardisiertes Polysomen-Profiling-Protokoll zur Verfügung, um spezifische mRNAs zu identifizieren, die unter Stressbedingungen selektiv translatiert werden.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Übersetzende Ribosomen dekodieren drei Nukleotide pro Codon in Peptide. Ihre Bewegung entlang der mRNA, die durch Ribosomenprofilierung erfasst wird, erzeugt die Fußabdrücke, die eine charakteristische Triplettperiodizität aufweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie RiboCode verwendet werden kann, um dieses herausragende Merkmal aus Ribosom-Profiling-Daten zu entschlüsseln, um aktiv übersetzte offene Leserahmen auf der Ebene des gesamten Transkriptoms zu identifizieren.

De novo Identifizierung von aktiv übersetzten offenen Leserahmen mit Ribosom-Profiling-Daten

Erfahren Sie Ribosom-Profiling zur genomweiten Quantifizierung der Translation in Saccharomyces cerevisiae. Diese hochsensitive Methode ermöglicht die Analyse von Proteinbiosynthese und regulatorischen Mechanismen in vivo.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

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