Name: Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Erfahren Sie die funktionelle Bildgebung viraler Transkriptionsfabriken mit 3D-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode nutzt nascent RNA-FISH und Aminofärbung zur Visualisierung aktiver Transkription bei KSHV-Reaktivierung.

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Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant (R01-DE025985) und durch eine amerikanische Krebs Gesellschaft Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch unterstützt durch Zuschüsse aus dem US Department of Agriculture (2015-67015-23268 und 2014-67015-21787) und neue Research Initiative Grant University of California, Davis.

Achtung: Zelllinien verwendet in diesem Verfahren infektiöse Viren enthalten, seien Sie vorsichtig und nur in Stufe 2 BSL Anlage oder höher gehen.
1. Handy-Vorbereitung und Wartung
<ol><li>Kulturzellen TREx-K-RTA BCBL-1 (oder ein anderes KSHV infiziert PEL-Zell-Linien) in RPMI1640 Medium mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung ergänzt.</li>
	<li>Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) sicherstellen, dass kontinuierlich wachsen und Zellen geteilt durch ein Verhältnis von 1:4 alle 2 – 4 Tage.</li>
	<li>Überwachen Sie Zellkulturen mit einem Lichtmikroskop jeden Tag bestätigen gute Zellwachstum und Morphologie, ansonsten empfiehlt es sich, die Zellkultur neu zu starten oder die Zelle Kulturbedingungen entsprechend anpassen.</li>
</ol>(2) Thymidin-Synchronisation und lytischen Induktion
<ol><li>In einer 10 cm Petrischale Platte TREx-K-Rta BCBL-1 Zellen in frisch zubereitete Medien (1 x 106 Zellen/2 mL der Medien)</li>
	<li>Fügen Sie 200 mM Thymidin (Endkonzentration: 2 mM) in die Schale mischen und 18 h inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen, die S-Phase für 8 h beenden.</li>
	<li>Hinzufügen von Thymidin (Endkonzentration: 2 mM), mischen und 16 h inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Um virale Reaktivierung zu induzieren, 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, Endkonzentration 20 ng/mL) und Doxycyclin (DOX, Endkonzentration 100 ng/mL) für die Zellkultur, mischen und 4 h inkubieren. Stimulieren Sie für Zell-Linien ohne eine K-Rta induzierbaren Kassette Reaktivierung mit TPA (Endkonzentration 20 ng/mL und Natrium Butyrat (1 mM)).</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in komplette Kulturmedien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In komplette Kulturmedien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen für 24 h zu wachsen.</li>
</ol>(3) Fixierung und Permeabilisierung
Hinweis: Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher Befestigung Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC-behandeltem PBS) Diethyl Pyrocarbonate behandelt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DEPC-PBS), Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) und Permeabilizating Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) sind bereit. In der Regel wird jede Folie benötigen mindestens 0,5 Millionen Zellen, vermehren, wenn notwendig und umfassen zusätzliche Zellen für Rücken vor allem, wenn Zellen nicht gesund sind.
<ol><li>Sammeln Sie Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Zentrifuge für 2 min bei 200 X g. waschen den Zellen die Zellen 3 Mal mit 1 mL sterile DEPC PBS. In 1,2 mL DEPC PBS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Legen Sie die entsprechende Anzahl von Deckgläsern (bestimmt durch den Versuchsaufbau) in den Böden der 6-Well-Platte.</li>
	<li>Pipette 200 µL der Zelle DEPC PBS-Mischung auf jeden Deckglas, sicherzustellen, dass mindestens 0,5 Millionen Zellen auf jeder Folie. Können Sie die Zellen für 2 min zu begleichen, und aspirieren Sie überschüssige DEPC PBS verlassen nur eine dünne Schicht von Zellen. Es ist normal, dass Zellen in diesem Prozess entfernt werden. Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 1 mL der Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC PBS) für jede Deckglas Befestigung. Lassen Sie die Zellen für 10 min beheben.</li>
	<li>Waschen Sie Deckgläsern 3 Mal mit DEPC PBS.</li>
	<li>Sorgfältig fügen Sie 1 mL Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) auf jeder Deckglas. Lassen Sie die Zellen für 5 min zu stillen.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber vorsichtig in die hand zu, für 1 min. Absaugen des überschüssigen DEPC PBS. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 1 mL permeabilizing Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) für jede Deckglas sorgfältig. Lassen Sie die Zellen, die für 15 min permeabilize. Hinweis: An dieser Stelle können die Deckgläsern in einem Gefrierschrank-20 ° C nicht länger als eine Woche gespeichert werden. Vermeiden Sie einfrieren zu oder minimieren Sie die Zeit in den Gefrierschrank, wie schnell die Bildqualität verschlechtern kann. Sicherstellen Sie, dass wenn Sie in den Gefrierschrank, den die Zellen bleiben feucht und bedeckt in Methanol/Aceton und um sicherzustellen, dass sie nach der Entnahme aus der Tiefkühltruhe richtig mit DEPC PBS rehydrieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber sanft in der hand für 1 min. aspirieren Sie die überschüssige DEPC PBS, achten Sie darauf, die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.</li>
</ol>4. IFA und RNA-Fisch
Hinweis: In Bezug auf RNA Fisch Sonde Kennzeichnung und Vorbereitung: für die K-Rta Intron 959 Basenpaare, 31 verschiedenen Sonden wurden generiert, die begnügten 20 Basenpaare jeweils mit einem GC von etwa 50 %. Arbeits- und Lager Lösungen der Sonden wurden bzw. regelmÄÑig in 100 µM und 2,5 µM Konzentrationen.
<ol><li>Objektträger mit notwendigen experimentellen Daten oder irgendeine Art von unterscheidbar Label zu kennzeichnen.</li>
	<li>Linie unten einen verschließbaren Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch.</li>
	<li>
Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung (1,5 µL LANA Antikörper, 0,75 µL RNA-Pol-II-Antikörper, 3 µL des Bäckers Hefe tRNA, DEPC PBS bis zu 30 µL), und multiplizieren Sie Rezept für jede vorhanden Deckglas. Platz 30 µL Primärantikörper Lösung auf jeder beschrifteten Objektträger.
	<ol>
<li>Titrieren Sie zunächst den primären Antikörper von Interesse und nutzen Sie die optimale Menge. Achten Sie darauf, gereinigte IgG zu verwenden, da Serum (Aszites-Flüssigkeit) große Menge von RNase enthalten kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Deckgläschen (Zellen mit Blick auf die Lösung) auf die beschrifteten Objektträger und verschieben Sie die Folien in den Behälter mit der feuchten Papiertuch. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Das äußere des Containers mit Plastikfolie abdecken. Bewegen Sie den Container in einen Inkubator, eingestellt auf 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Fisch-Waschpuffer (2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer (SSC) (final), 10 % Formamid, 90 % DEPC dH2O).</li>
	<li>2 x Hybridisierung Puffer vorzubereiten (4 X SSC, 20 % Dextran Sulfat).</li>
	<li>Bereiten Sie den sekundären Antikörper und Fisch Intron Sonde Puffer (20 µL 2 x Hybridisierung Puffer (letzte 1 x Hyb-Puffer), 4 µL der Bäckerhefe tRNA (letzten 10 %), 4 µL Formamid (letzten 10 %), Intron K-Rta-Sonde (final 125 nM), 0,8 µg Sekundärantikörper, DEPC dH2 O bis zu 40 µL). Multiplizieren Sie Rezept für jede Folie benötigt.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubation Zellen 3 Mal mit DEPC PBS in einer 6-well-Platte für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie mit Waschpuffer Fisch 3 Mal für 5 Minuten. Halten Sie Deckglas in Fisch-Waschpuffer bis Ziel vorbereiten Mischung von Zweitens Antikörper und Intron Sonde (Schritt 4,7).</li>
	<li>Sauberen Objektträger für Primärantikörper Inkubation für die Hybridisierung verwendet.</li>
	<li>Platz 40 µL der Sekundärantikörper und Fisch Intron-Sonde, die Lösung in jedem Glas Folie enthalten.</li>
	<li>Legen Sie Deckgläsern mit den Zellen auf dem Objektträger mit der Zelle-Seite nach unten auf den Puffer, darauf achten, nicht sein, Luftblasen einzuführen.</li>
	<li>Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch auf den Boden. Wickeln Sie Kunststoffbehälter in ersten Plastikfolie und dann in Alufolie.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Container mit den Folien bei 37 ° C für 16-24 h.</li>
	<li>Nach der Inkubation sorgfältig schieben Sie das Deckglas aus der Glas-Folie-Rand und setzen Sie wieder in 6 well-Platten nach oben und waschen Sie Zellen mit Fisch-Waschpuffer 3 Mal in einem 6-well-Platte für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.</li>
	<li>Fügen Sie DAPI (1:1 000) in den 2 X SSC und für 5 min bei Raumtemperatur sitzen lassen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.</li>
	<li>Reinigen Sie die Glas-Folien für die Hybridisierung verwendet, und fügen Sie 10 µL Montagelösung auf den Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie das Deckgläsern Gesicht nach unten auf die Montage-Lösung. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einem Labor Gewebe vorsichtig das überschüssige Befestigungslösung, wobei Sie darauf achten, nicht um die Zellen zu zerquetschen.</li>
	<li>Mit Nagellack, ein reichlich auftragen um den Rand der Deckgläsern und trocknen lassen.</li>
	<li>Fahren Sie mit Fluoreszenz-Mikroskopie durchzuführen.</li>
</ol>5. 3D Fluoreszenz-Mikroskopie
Hinweis: Protokolle variiert mit der Art der Fluoreszenz-Mikroskop-System verwendet, werden die folgenden Schritte helfen, um den Erwerb von optimalen Bilddaten für die Quantitative Analyse zu gewährleisten.
<ol><li>Vorbehandeln Sie feste Proben und montieren Sie in Anti-Fade Medien, Immunofluoreszenz Fluoreszenz während der Bildgebung zu verzögern.</li>
	<li>Verwenden Sie ein hochwertiges Ziel (z. B. ein 60 X 1,42 N.A Ölimmersion Objektiv), das eine ganze Zelle (oder einen Zellkern) erfassen kann in das Blickfeld.</li>
	<li>Belichtungsparameter (z.B.Erregerleistung, Belichtungszeit) für jeden Farbkanal Fluoreszenz, mit positiven und negativen Kontrollproben festgelegt. Fluoreszenzbilder zu erwerben. Hinweis: Positivkontrolle Proben, die nur eine fluoreszierende Label enthalten sollte auch zur Bestimmung der Höhe des "Übersprechen" zwischen Farbkanäle verwendet werden. Für bildgebende feste Zelle Proben kann Fluoreszenz Erregerleistung (mit etwas längeren Belichtungszeiten) reduziert werden, um Immunofluoreszenz zu minimieren.</li>
	<li>Sobald das Image-Protokoll festgelegt worden, erhalten die gleichen Belichtungsparameter konsistent für alle Proben in einer Studie — so dass Bilddaten genau analysiert und verglichen werden können.</li>
	<li>Führen Sie nach der Übernahme Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion. Identifizieren Sie die K-Rta-Transkripte von RNA-FISH-Signal (rot), LANA-Moleküle durch Immunfluoreszenz (grün) und nuklearen Chromatin (falls zutreffend) gebeizt mit DAPI (blau). Hinweis: Regionen des Zellkerns, in denen K-Rta und LANA Co gruppierten sind sind somit vermutlich virale Transkription Fabriken und Replikation komplexer zugeordnet werden.</li>
</ol>

<ol><li>de Laat, W., Grosveld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grosveld+Spatial+organization+of+gene+expression%3A+the+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub.</a> Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics%3A+implications+for+nuclear+architecture+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression.</a> Science. 291 (5505), 843-847 (2001).</li>
<li>Bernardi, R., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+dynamics+and+functions+of+promyelocytic+leukaemia+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).</li>
<li>Cioce, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies%3A+a+long+history+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies: a long history of discovery.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).</li>
<li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifunctional nucleolus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).</li>
<li>Sutherland, H., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factories%3A+gene+expression+in+unions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription factories: gene expression in unions.</a> Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li>
<li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> J Virol. 91 (11), (2017).</li>
<li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma%3A+listening+to+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).</li>
<li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v10/n10/full/nrc2888.html?foxtrotcallback=true">Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).</li>
<li>Campbell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+1-directed+methylation+of+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+latency-associated+nuclear+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen.</a> J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).</li>
<li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30(2012).</li>
<li>Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+diversity+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).</li>
<li>Osborne, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myc+dynamically+and+preferentially+relocates+to+a+transcription+factory+occupied+by+Igh%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh.</a> PLoS Biol. 5 (8), 192(2007).</li>
<li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li>
<li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly%28A%29+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> PLoS Pathog. 7 (10), 1002300(2011).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+JMJD2A+regulates+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+replication+and+is+targeted+by+a+viral+transcriptional+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor.</a> J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).</li>
<li>McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efficiency+of+phorbol+ester-induced+lytic+reactivation+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+during+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase.</a> J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).</li>
<li>Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+cycle+switches+of+oncogenic+human+gammaherpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses.</a> Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).</li>
<li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30(2012).</li>
</ol>

Die Autoren dieses Papiers haben keine finanziellen Verbindungen oder konkurrierenden Interessenkonflikte.

Es gibt einige Aspekte des Protokolls, die geändert werden können, um außergewöhnliche Umstände zu berücksichtigen. Die Wahl der Fixierung und Permeabilisierung Puffer kann auch geändert werden. Für Fixierung Puffer Paraformaldehyd ist auch wirksam und Ethanol für Permeabilisierung genutzt werden.
Abschrecken von Formaldehyd mit Glycin, die PBS empfohlen wird, da es verhindert, dass Formaldehyd deaktivieren die Antikörper in Abwesenheit von Rinderserumalbumin (BSA), aber wenn die Deckgläsern g...

Es ist immer deutlicher geworden, dass die räumlich-zeitliche Organisation des Kerns eine wichtige Rolle spielt bei der Modulation der fein abgestimmten Genexpression in den Eukaryotes. Die meisten Gewebe spezifische Gene über viele Chromosomen verteilt sind und synchron geregelt werden, um auf bestimmte Reize in einer koordinierten Art und Weise1reagieren müssen. Zellen bauen aktiv Chromatin Naben (ACH) als eine Möglichkeit der Zusammenführung von Genen und deren Cis-regulatorische Komponenten auf einem bestimmten nuklearen Raum1.
Es wurde auch durch verschiedene Studien nachgewiesen, dass obwohl der Kern sehr dicht und Viskose scheint, biologisch aktive Molekülen Nucleus ziemlich schnell per Diffusion2durchlaufen können. Als Folge dieser ephemeren Eigenschaft springen"" die meisten DNA-bindende Proteine von verbindlichen Website Website, Gefühl, ihren Weg um die nuklearen Raum, ermöglicht eine sehr anpassungsfähige und vielseitige Kern2als verbindlich.
Trotz dieses dynamische Verhalten von Biomolekülen innerhalb des Zellkerns, nukleare Einrichtungen ohne Membranen wie z. B. (aber nicht beschränkt auf) die Nukleolus, Cajal Körper und Promyelocytic Leukämie nuklearen Einrichtungen (PML-NB) noch vorhanden sind. Es ist durch eine Vielzahl von Mechanismen wie DNA Tandemwiederholungen (Nukleolus), rRNA (Nukleolus) und Strukturproteinen wie coilin (Cajal Bodies) oder PML Proteine (PML-NB), die diese Konstrukte zusammen3,4,5 halten . Diese Strukturen und anderen Gemeinden wie Transkription Fabriken dienen als Gerüste, die erhöhen nicht nur die lokale Konzentration von erforderlichen Komponenten, sondern Regeln auch die Zusammensetzung von Proteinen und Nukleinsäuren in ihnen letztendlich schaffen eine zentraler Standort für effiziente Zellfunktionen6.
Wann und wo atomare Strukturen Form bietet eine Fülle von Informationen für Forscher studieren Epigenetik zu visualisieren. Aus Sicht der Virologie der Reaktivierung der latent infizierten Viren, z. B. KSHV, erheblich verändert die Landschaft des Kerns und Verteilung der nuklearen Enzyme, Transkription in erster Linie aus zellulären Genen auf virale Gene, letztlich zu verlagern, voll funktionsfähige virale Nachkommen7,8zu produzieren. Wie manipuliert KSHV zelluläre gen Ausdruck Maschinen, virale Genexpression zu erleichtern? Solche Informationen könnten auch Aufschluss über zeitliche zelluläre gen Regulationsmechanismen.
Wie alle anderen Herpesviren hat KSHV zwei Lebenszyklen lytischen Replikation und Latenz genannt. KSHV befindet sich in erster Linie in der Latenz-Phase, in der die meisten seiner viralen Gens Ausdruck zum Schweigen gebracht wird, außer Latenz Gene9,10verbunden. Während der Wartezeit, die KSHV produziert verbundene Latenz nuclear Antigen (LANA), die konstitutiv bindet das virale Genom und Anbindehaltung virale Chromatin der menschlichen Chromosom11. Wegen Lanas intime Beziehung mit das virale Genom ist es möglich, IFA und DAPI zu färben und zu lokalisieren, wo der viralen Episomes in Bezug auf die Host-Chromatin waren zu verwenden.
Um KSHV Reaktivierung auf der Ebene der einzelnen Episome und die Assoziation mit anderen viralen Episomes in einer infizierten Zelle zu untersuchen, wurde eine Strategie suchen aktiv Transkription viraler Chromatin in Situ gegründet. Dementsprechend wurden LANA und RNAPII IFA mit Intron-RNA-Fisch kombiniert, durch die Generierung von RNA-FISH-Sonden, die an der Intron-Region (genaue Sonde finden Sie Sequenzen in die Izumiya Lab neueste Veröffentlichung8) binden KSHV K-Rta-die wichtigsten virales Protein, das ist, notwendig und ausreichend für KSHV Reaktivierung-es möglich war, wo Transkription tatsächlich nahm Platz8,11,12,13,14,15 . Diese Intron-RNA-FISH-Technik ermöglicht Forschern zu visualisieren, wo mRNA transkribiert ist, sofort bevor es gespleißt und, Zytoplasma16,17 exportiert.
KSHV kann reaktiviert werden, durch verschiedene chemische Reize, einschließlich Phorbol Ester wie 12-O-Tetradeconoyl-Phorbol-13acetate (TPA) und Histon-Deacetylase-Hemmer wie Natrium Butyrat, zusätzlich KSHV durch Überexpression von reaktivieren induziert werden können die virale Transkriptionsfaktor, K-Rta-19. Forscher haben erfolgreich erhöht die Effizienz der KSHV Reaktivierung durch die Synchronisation der Zelle Zyklen vor Induktion Reaktivierung18. So wurden für diese Spezialuntersuchungen Zellen synchronisiert, mit einen doppelten Thymidin-Block (Protokoll beschrieben) und für eine kurze Zeit mit TPA und Doxycyclin (Dox) inkubiert. Doxycyline wurde verwendet, weil in diesen Experimenten verwendeten Zelllinie eine Doxycyclin-induzierbaren K-Rta-Kassette, die wurde von cDNA kloniert und beinhaltet nicht die Intron-Region von K-Rta hat. Es ist zwar möglich, reaktivieren KSHV mit K-Rta Ausdruck nur induziert, es ist von anderen Forschern nachgewiesen worden, dass aufgrund einer Vielzahl von verschiedenen biochemischen Faktoren K-Rta Ausdruck allein erweist sich als ein schwacher Reaktivierung Reize20. Durch die Kombination aller dieser, und durch die Droge Inkubationen für einen kurzen Zeitraum zu begrenzen wurde eine robuste, aber nicht übermäßig künstliche KSHV Reaktivierung für die Bildgebung erreicht.
Nach LANA, RNAPII, Kennzeichnung K-Rta Introns und DNA als in diesem Dokument beschriebenen, 3D Fluoreszenz-Bildgebung erfolgte mittels einer Weitfeld Dekonvolution Mikroskop. Nach der Bearbeitung mit imaging-Software kann die räumliche Verteilung der aktiven viralen Episomes richtig ausgewertet werden. Mit dieser Technik können die zentralen Fragen über die grundlegende Natur der Bildung von aktiven Chromatin Hubs und andere atomaren Strukturen untersucht werden. Mit identischen virale Episomes in eine einzelne Zelle, die die gleichen regulatorischen Elemente verarbeitet kann eine einzigartige Recherche-Tool zur Vertiefung des Verständnisses der raumzeitlichen gen Regulationsmechanismen darstellen.
Eine Einschränkung von imaging-mehrere Zelle Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert um eine von Natur aus molekularen Dynamik zu charakterisieren ist, dass subtile oder kleine Änderungen bei Fluoreszenz Verteilung unentdeckt oder als unbedeutend. Dies gilt, sofern in dem seltenen Fall, jede Zelle beobachtet die gleiche subtile Änderung zeigt. Daher kann nicht die volle raumzeitliche Beziehung aktive virale Transkription und anderen atomaren Strukturen mit festen Bildgebung kritisch beurteilt werden. Um diese technischen Herausforderungen zu begegnen, ist der beste Ansatz, Bild lebenden Zellen, die virale Episomes geprägt haben und die Lage der wichtigsten zellulären Enzymen im Laufe der Zeit folgen.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Muss auf 37 Grad erwärmt werden; C</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamin (100x)</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco s Phosphatgepufferte Lösung</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd-Lösung&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>Ätzend, giftig, gesundheitsgefährdend</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>Akute Toxizität&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>Entzündliches, giftiges</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td>Entzündlicher, giftiger, gesundheitsgefährdender</td></tr><tr><td>monoklonaler Antikörper der Ratte gegen KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA-Polymerase II Antikörper-Klon CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonukleinsäure, Transfer vom Bäcker Hefe (S. cerevisiae)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Salzlösung Natriumcitrat Puffer 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15557044</tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% ige Lösung</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold Antifading-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Deckglas 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D-Bildgebungssoftware</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

funktionelle bildgebung der virale transkription fabriken mit 3d fluoreszenz-mikroskopie

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Es ist bekannt, dass räumliche und zeitliche Regelung der Gene Bestandteil ist des Regierens richtige Genexpression. Daher ist es von unschätzbarem Wert zu verstehen, wo und wann Transkription in nuklearen Raum stattfindet und die Beziehung zwischen Episomes innerhalb der gleichen Zellkern infiziert zu visualisieren. Hier, Immunfluoreszenz (IFA) und RNA-Fische wurden Combinedto identifizieren aktiv Transkription Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) Episomes. Durch Färbung KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA), ist es möglich, zu finden, wo virale Episomes im Zellkern vorhanden. Darüber hinaus können durch die Gestaltung von RNA-FISH-Sonden, um der Intron-Region eines viralen Gens zu Zielen, die nur während der produktiven Infektion ausgedrückt wird, im Entstehen begriffenen RNA-Transkripte befinden. Mit dieser Kombination aus molekularen Sonden, ist es möglich, die Montage von großen virale Transkription Fabriken visualisieren und analysieren die räumlichen Regulierung der viralen Genexpression während KSHV Reaktivierung. Durch die Einbeziehung Anti-RNA-Polymerase II Antikörper Färbung, kann man auch die Assoziation zwischen RNA-Polymerase II (RNAPII)-Aggregation und KSHV Transkription bei Reaktivierung sichtbar machen.

Eine leicht gekürzte Protokoll wurde durchgeführt, wo BCBL-1-Zellen dienten und nur LANA und K-Rta RNA (Abbildung 1 gefärbt wurden). Dieses Experiment kann wir prüfen, wo aktiv Universalklassifikation virale Episomes sind und die Heterogenität der Reaktion auf KSHV Reaktivierung Reize in einer Bevölkerung der Zellen. In der Zelle wird durch den Pfeil in Abbildung 1ist die verschiedene K-Rta-Fluoreszenz in Regionen, in denen die V...

Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Das übergeordnete Ziel der Kombination von naszierender RNA-FISH mit der Aminofärbung viraler latenter Proteine besteht darin, die aktive Transkription in Verbindung mit der Bildung viraler Transkriptionsfabriken sichtbar zu machen. Diese Methode kann zur Beantwortung zentraler Fragen in den Bereichen Genetik, Zellbiologie, Virologie und zellbiologische Virologie verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein induzierbares virales Mini-Chromosomenmodell verwendet, um die molekularen Details hinter genomischen architektonischen Veränderungen zu untersuchen.Sammeln Sie die Zellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 200 Volt Schwerkraft. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter sterilem DEPC PBS.Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen in 1,2 Millilitern DEPC PBS. Platzieren Sie die Deckblätter in den Boden einer Sechs-Well-Platte. Pipettieren Sie 200 Mikroliter des DEPC PBS-Gemisches der Zelle auf jedes Deckglas.Nachdem sich die Zellen zwei Minuten lang abgesetzt haben, aspirieren Sie überschüssiges DEPC PBS, so dass nur eine dünne Zellschicht übrig bleibt. Geben Sie vorsicht

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

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Visualisierung der bakteriellen Proteinverteilung in drei Dimensionen durch Fluoreszenzbildgebung

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Multiplexes Fluoreszenz-Imaging von viralen Nukleinsäuren und Proteinen in infizierten menschlichen Lymphozyten

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Visualisierung der transkriptionellen Supprimierung in virusinfizierten Zellen

Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

ICP0 erfährt nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion. Der molekulare Mechanismus dieses Ereignisses ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir die Verwendung von confocal Mikroskop als Instrument zur ICP0 Bewegung in HSV-1-Infektion, die legt den Grundstein für die Analyse von quantitativ ICP0 Translokation in zukünftigen mechanistische Studien zu quantifizieren.

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Dieses Protokoll stellt ein neues Reporter-Gensystem und den Versuchsaufbau zum Nachweis der Transkription bei DNA-Doppelstrangbrüchen mit Einzelmolekülsensitivität vor.

Live-Cell-Bildgebung der Transkriptionsaktivität an DNA-Doppelstrangbrüchen

Erfahren Sie die funktionelle Bildgebung viraler Transkriptionsfabriken mit 3D-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode nutzt nascent RNA-FISH und Aminofärbung zur Visualisierung aktiver Transkription bei KSHV-Reaktivierung.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

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