Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie
18. Januar 2018
Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.
Das übergeordnete Ziel der Kombination von naszierender RNA-FISH mit der Aminofärbung viraler latenter Proteine besteht darin, die aktive Transkription in Verbindung mit der Bildung viraler Transkriptionsfabriken sichtbar zu machen. Diese Methode kann zur Beantwortung zentraler Fragen in den Bereichen Genetik, Zellbiologie, Virologie und zellbiologische Virologie verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein induzierbares virales Mini-Chromosomenmodell verwendet, um die molekularen Details hinter genomischen architektonischen Veränderungen zu untersuchen.
Sammeln Sie die Zellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 200 Volt Schwerkraft. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter sterilem DEPC PBS.
Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen in 1,2 Millilitern DEPC PBS. Platzieren Sie die Deckblätter in den Boden einer Sechs-Well-Platte. Pipettieren Sie 200 Mikroliter des DEPC PBS-Gemisches der Zelle auf jedes Deckglas.
Nachdem sich die Zellen zwei Minuten lang abgesetzt haben, aspirieren Sie überschüssiges DEPC PBS, so dass nur eine dünne Zellschicht übrig bleibt. Geben Sie vorsichtig einen Milliliter Fixierlösung auf jeden Deckglas. Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang fixieren.
Waschen Sie die Eindeckeinlagen dreimal mit DEPC PBS. Nach dem Waschen vorsichtig einen Milliliter Glycin DEPC PBS bis zu einer Endkonzentration von 100 Millimolar auf jedes Deckglas geben. Lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang abschrecken.
Fügen Sie 1,5 Milliliter DEPC PBS hinzu und geben Sie es fünf Minuten lang auf einen Shaker und schütteln Sie es eine Minute lang fest, aber vorsichtig in der Hand. Aspirieren Sie das überschüssige DEPC PBS und achten Sie darauf, die Zellen nicht zu stören. Geben Sie vorsichtig einen Milliliter permeabilisierende Lösung auf jedes Deckglas.
Lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang permeabilisieren. Fügen Sie 1,5 Milliliter DEPC PBS hinzu. Legen Sie die Zellen fünf Minuten lang auf einen Shaker und schütteln Sie sie eine Minute lang fest, aber sanft in der Hand.
Aspirieren Sie das überschüssige DEPC PBS und achten Sie darauf, die Zellen nicht zu stören. Beschriften Sie die Objektträger, befeuchten Sie ein Papiertuch und legen Sie dann den Boden eines verschließbaren Plastikbehälters mit dem Handtuch aus. Bereiten Sie anschließend die primäre Antikörperlösung vor und multiplizieren Sie das Rezept für jedes vorhandene Deckglas.
Geben Sie 30 Mikroliter Primärantikörperlösung auf jeden markierten Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Primärantikörperkonzentration korrekt ist, indem Sie die Ecke des Deckglases festhalten und vorsichtig darauf schnippen. Darüber hinaus kann die Ecke eines Taschentuchs verwendet werden, um überschüssige Feuchtigkeit abzuleiten.
Legen Sie dann das Deckglas auf die beschrifteten Objektträger, wobei Sie darauf achten sollten, dass keine Blasen entstehen. Decken Sie die Außenseite des Behälters mit Plastikfolie ab. Stellen Sie den Behälter für eine Stunde in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Bereiten Sie während der Inkubation die erforderlichen Reagenzien vor. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit DEPC PBS in einer Sechs-Well-Platte für jeweils fünf Minuten. Waschen Sie dann die Zellen dreimal für jeweils fünf Minuten mit FISH-Waschpuffer.
Und bewahren Sie den Deckglas in FISH-Waschpuffer auf, bis der Sekundärantikörper, eine Intronsondenmischung, hergestellt wurde. Reinigen Sie anschließend die Objektträger für die Inkubation der primären Antikörper für die Hybridisierung mit Seifenwasser. Nachdem sie getrocknet sind, reinigen Sie sie mit Ethanol und einem Labortuch.
Geben Sie 40 Mikroliter des Sekundärantikörpers und der FISH-Intronsonde mit Lösung auf jeden Objektträger. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen auf die Objektträger, wobei die Zellen mit der Seite nach unten auf den Puffer zeigen. Und achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen.
Legen Sie die Objektträger in einen Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch auf dem Boden. Wickeln Sie den Plastikbehälter zuerst in Plastikfolie und dann in Alufolie ein. Und inkubieren Sie den Behälter mit den Objektträgern.
Schieben Sie nach der Inkubation den Deckglas vorsichtig vom Rand des Objektträgers und legen Sie ihn mit der Vorderseite nach oben wieder in Sechs-Well-Platten. Waschen Sie die Zellen dreimal mit FISH-Waschpuffer in einer Sechs-Well-Platte für jeweils fünf Minuten. Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal mit zweifachem SSC.
Geben Sie DAPI in einer Konzentration von eins bis 1000 in den zweifachen SSC und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit zweifachem SSC. Reinigen Sie die für die Hybridisierung verwendeten Objektträger und geben Sie 10 Mikroliter Eindecklösung auf die Objektträger.
Legen Sie die Abdeckfolien mit der Vorderseite nach unten auf die Befestigungslösung. Entfernen Sie mit einem Labortuch vorsichtig die überschüssige Einbettlösung und achten Sie darauf, die Zellen nicht zu zerquetschen. Tragen Sie mit Nagellack eine großzügige Schicht um den Rand der Deckgläser auf und lassen Sie den Lack trocknen.
Die Probe ist nun bereit für die Fluoreszenzmikroskopie. BCBL-1-Zellen wurden mit LANA- und K-Rta-RNA gefärbt, um zu untersuchen, wo sich aktiv transkribierende virale Episomen befinden und wie heterogen die Reaktion auf Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus- oder KSHV-Reaktivierungsstimuli ist. Die ausgeprägte K-Rta-Fluoreszenz in Regionen, die eng mit der Verteilung der viralen Episomen übereinstimmen, ist ein Hinweis darauf, dass eine aktive Transkription in der Nähe von KSHV-Genomen stattfindet.
In der gleichen Probe können Zellen beobachtet werden, die eine viel schwächere und diffuse K-Rta-Fluoreszenz aufweisen, die sich nicht signifikant mit LANA überschneidet, was die beträchtliche Variation und den Grad der Reaktion auf Reaktivierungsstimuli innerhalb einer Zellpopulation verdeutlicht. Als nächstes wurde die Wirksamkeit der Thymidin-Synchronisation untersucht, indem die Expression des viralen Proteins visualisiert wurde, was deutlich zeigte, dass synchronisierte Zellen stärker auf die Reaktivierungsstimuli reagierten als die unsynchronisierte Population. Die DAPI-Färbung kann mehrere Funktionen erfüllen, dieses Beispiel zeigt deutlich, dass es drei separate Zellen anstelle von einer gibt.
Die 3D-Mikroskopie zusammen mit dieser Technik enthüllte ringförmige RNA-PII-Strukturen, die mit KSHV-Genomen an der Peripherie gesehen wurden. Mit seiner Entwicklung würde das mini-virale Chromosom den Forschern einzigartige Werkzeuge an die Hand geben, um die besondere zeitliche Organisation der Genexpression und die Regression des Zellkerns zu erforschen.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Visualisierung aktiver Transkription in viralen Transkriptionsfabriken mittels naszierender RNA-FISH in Kombination mit Aminofärbung viraler latenter Proteine vor. Das Verfahren zielt darauf ab, die molekularen Details hinter genomischen strukturellen Veränderungen während der viralen Reaktivierung aufzuklären.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Zellbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Virale transkriptionelle Fabriken verstärken die Transkription viraler Gene.
- Die zelluläre RNA-Polymerase II ist in diesen Strukturen angereichert.
- Das Verständnis der transkriptionellen Aktivität ist entscheidend für die Virologieforschung.
- Induzierbare virale Mini-Chromosomenmodelle liefern Einblicke in genomische Veränderungen.
Zweck der Studie
- Aktive Transkription im Zusammenhang mit der Bildung viraler Transkriptionsfabriken sichtbar machen.
- Zentrale Fragen in der Genetik und Virologie beantworten.
- Molekulare Details der Prozesse der viralen Reaktivierung untersuchen.
Verwendete Methoden
- Kombination von naszierender RNA-FISH und Amino-Färbung.
- Verwendung eines induzierbaren viralen Mini-Chromosomenmodells.
- Zellgewinnung und Zentrifugationstechniken.
- Immunfluoreszenz-Färbung und in-situ-RNA-Hybridisierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von aktiv transkribierendem viralem Chromatin.
- Identifizierung von Transkriptionsfabriken im dreidimensionalen nukleären Raum.
- Einblicke in die Dynamik der viralen Genexpression während der Reaktivierung.
- Nachweis der Anwendbarkeit der Methode in der Virologieforschung.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der viralen Transkription.
- Sie vertieft das Verständnis der Mechanismen der viralen Reaktivierung.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um die Virusbiologie zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die ortsaufgelöste Abbildung viraler Transkriptionsfabriken mittels 3D-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung aktiver Genexpressionereignisse innerhalb der nuklearen Architektur. Diese Fähigkeit ist entscheidend, um mechanistische Hypothesen zur Regulation des viralen Genoms abzusichern, und stärkt die Vorhersagekraft bei der Validierung antiviraler Zielstrukturen in frühen Entwicklungsphasen. Der Ansatz unterstützt Portfolioentscheidungen, indem er die räumlichen und zeitlichen Dynamiken der viralen Reaktivierung auf Einzelzellniveau aufklärt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung aktiver viraler Transkriptionsstellen zur funktionellen Zielvalidierung.
- Klärt die räumliche Beziehung zwischen viralen Episomen und der Transkriptionsaktivität und unterstützt dadurch die Aufklärung von Wirkmechanismen.
- Ermöglicht eine hypothesengetriebene Untersuchung der viralen Genregulation während der Reaktivierung.
- Liefert Belege für die Beteiligung von Signalwegen und die biologische Relevanz von Zielkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Bildgebungsassays zur Quantifizierung der transkriptionellen Aktivität als Reaktion auf Störungen.
- Erleichtert die reproduzierbare Detektion neu synthetisierter RNA und Proteinmarker in Hochdurchsatz-Screening-Formaten.
- Ermöglicht die Standardisierung von Messgrößen für die Bewertung von Wirkstoffen, die auf die virale Genexpression abzielen.
- Unterstützt Skalierbarkeit und Wiederverwendung der Plattform für verwandte virale Systeme.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt bildgebende Ergebnisse mit krankheitsrelevanten Modellen der viralen Reaktivierung in Übereinstimmung.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem molekulare Ereignisse mit phänotypischen Ergebnissen verknüpft werden.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf räumlichen und zeitlichen Genexpressionsdaten.
- Unterstützt die Identifizierung translationsrelevanter Biomarker für die Entwicklung von Antivirotika.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Bildgebungsmethode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie die direkte Messung der viralen transkriptionellen Aktivität und der nukleären Organisation ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur viralen Genregulation und Bildung von Transkriptionsfabriken.
- Screening: Bietet quantitative, reproduzierbare bildgebende Messgrößen für die Assay-Entwicklung und Wirkstoff-Screening.
- Analytik: Ermöglicht räumlich aufgelöste Messungen der Kolokalisation neu synthetisierter RNA und Proteine für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Bildgebungsdaten mit krankheitsrelevanten Modellen der viralen Reaktivierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die an andere Studien zur episomalen oder nukleären Genregulation angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und verringert mechanistische Unklarheiten in der Regulation viraler Gene.
- Operationaler Wert: Standardisiert Imaging-Workflows hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Forschungs- und Entwicklungsteams hinweg.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem quantitative, informationsreiche Daten zu viralen Transkriptionsdynamiken bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von antiviralen Targets und Mechanismen für die Weiterentwicklung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in fortgeschrittener Fluoreszenzmikroskopie und der Konzeption molekularer Sonden.
- Benötigt Zugang zu 3D-Bildgebungsinstrumentierung und Infrastruktur zur Bildanalyse.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei Färbeprotokollen und bildgebenden Parametern über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann auf verschiedene virale und nukleäre Modellsysteme übertragen werden, sofern geeignete Sonden entwickelt werden.
- Hängt von der Eignung des Zellmodells und der Spezifität der Sonde für eine korrekte Interpretation ab.
