Entwicklung eines In-vitro- Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafischembryo aufzuzählen und zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, einige wirklich wichtige Fragen im hämatopoetischen Bereich zu beantworten, wie z.B. wie viele Stamm- und Vorläuferzellen tatsächlich in einem sich entwickelnden Zebrafischembryo vorhanden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnell, relativ kostengünstig und einfach durchzuführen ist.

Obwohl diese Methode Aufschluss über die Anzahl der im sich entwickelnden Zebrafisch vorhandenen Vorläuferzellen geben kann, ermöglicht sie es den Forschern auch, die funktionelle Wirkung eines Medikaments oder einer genetischen Mutation auf die Bildung von Vorläuferzellen im Blut zu messen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir Gene ausschalteten, von denen wir annahmen, dass sie für die Blutentwicklung entscheidend sind. Wir sagten voraus, dass wir mit diesem Assay in der Lage sein würden, den Unterschied zwischen normal entwickelnden Embryonen und solchen, die Morphanten waren, zu messen.

Um Zebrafischembryonen zu bleichen, verwenden Sie Plastikbehälter, um drei Waschstationen zu schaffen, von denen eine einen Milliliter fünf Prozent Bleiche pro Liter E3 und zwei Stationen steriles E3 enthält. Legen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in ein Teesieb und tauchen Sie sie fünf Minuten lang in die Waschstation Nummer eins. Dann geben Sie das Teesieb mit den Embryonen für fünf Minuten in die Waschstation Nummer zwei. Wiederholen Sie den Vorgang für die letzten fünf Minuten für Waschstation Nummer drei.

Nach dem letzten Waschen nehmen Sie die Embryonen aus dem Teesieb, indem Sie es über einer sauberen 10 Zentimeter großen Petrischale auf den Kopf stellen und die Embryonen mit einer Transferpipette und sterilem E3 vorsichtig vom Sieb abspülen. Um die Embryonen zu dechorionieren, verwenden Sie eine Transferpipette, um so viel E3 wie möglich aus der Petrischale zu entfernen und zu verwerfen. Geben Sie dann 500 Mikroliter Dechorionierungsprodeas zu den Embryonen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Seite der Petrischale, um die Chorionen vollständig zu entfernen. Fügen Sie dann mit einer serologischen Pipette 20 Milliliter steriles E3 hinzu, um die Prodeas zu verdünnen. Lassen Sie die Embryonen sich einnisten und verwenden Sie eine Pipette, um das E3 zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal, um alle Spuren der Dechorionierungsprodeas zu entfernen.

Um Embryoproben vorzubereiten, verwenden Sie eine Pipette, um 10 Embryonen in ein einziges steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu geben. Pipettieren Sie dann den E3 vorsichtig heraus und entsorgen Sie ihn. Übertragen Sie die Proben in eine Laminar-Flow-Haube und waschen Sie die Embryonen mit einem Milliliter sterilem E3, damit sich die Embryonen am Boden des Röhrchens absetzen können.

Verwenden Sie dann eine P1000-Pipette, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Wäschen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den E3 und entsorgen Sie ihn.

Fügen Sie dann einen Milliliter 10 millimolare DTT in E3 hinzu, um die Schleimschicht und alle Sporen, Hefen oder Bakterien zu entfernen, die in der Umgebung der Embryonen eingeschlossen sein könnten. Legen Sie nun das Mikrozentrifugenröhrchen waagerecht und inkubieren Sie es 25 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Embryonen zu dissoziieren, verwenden Sie einen Milliliter steriles DPBS, um die Probe dreimal zu waschen.

Nach der letzten Wäsche fügen Sie 500 Mikroliter DPBS mit Calcium und Magnesium und fünf Mikroliter fünf Milligramm pro Milliliter Dissoziationsprodeas hinzu. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius auf einem horizontalen Orbitalschüttler bei 180 U/min für 60 Minuten. Platzieren Sie dann die Proben und die Laminar-Flow-Haube und verwenden Sie einen P1000, um die Embryonen zu zerreiben, bis die Proben vollständig dissoziiert sind.

Seien Sie vorsichtig und kontrollieren Sie die Embryonen regelmäßig, um festzustellen, wann sie dissoziiert sind. Sie möchten, dass etwas Gewebe vorhanden ist. Es ist möglich, die Embryonen zu überverdauen, wodurch die Vorläuferzellen zerstört werden.

Pipettieren Sie die 10 dissoziierten Embryonen in das obere Reservoir eines runden Fünf-Milliliter-Polystyrol-Röhrchens mit einer 35-Mikrometer-Zellsiebkappe. Spülen Sie das Embryoröhrchen mit einer Pipette und sterilem PBS und geben Sie die Lösung in das Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit den gefilterten Zellen. Wiederholen Sie die Spülung, bis sich vier Milliliter Flüssigkeit in der Tube befinden.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius, um die homogenisierte Zellprobe zu palettieren. Entfernen und entsorgen Sie mit einer Pipette den Überstand aus dem Röhrchen mit rundem Boden, wobei Sie darauf achten müssen, dass die am Boden pelletierten Zellen nicht beschädigt werden. Verwenden Sie dann 100 Mikroliter PBS, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Bereiten Sie eine X komplette Methylcellulose-Stammlösung vor und verwenden Sie drei Milliliterspritzen und 16-Gramm-Nadeln, um 2,5 Milliliter sterile 14-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden hinzuzufügen. Verwenden Sie für jeden getesteten Zustand ein Röhrchen. Für die myeloische Differenzierung fügen Sie ein Prozent Karpfenserum und 0,3 Milligramm pro Milliliter rekombinanten Zebrafisch-Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor oder GCSF zu Methylcellulosemedium hinzu.

Für die erythroide Differenzierung fügen Sie ein Prozent Karpfenserum und 0,1 Milligramm pro Milliliter rekombinantes Zebrafisch-Erythropoietin oder EPO zu Methylcellulosemedium hinzu. Um Vorläuferzellen mit mehreren Linien zu untersuchen, fügen Sie EPO und GCSF hinzu. Geben Sie mit einer Pipette 100 Mikroliter der 10 dissoziierten Embryonen auf die Oberfläche der vorbereiteten Methylcellulose mit den rekombinanten Zytokinen im Karpfenserum.

Verschließen Sie den Deckel und wirbeln Sie ihn vorsichtig ein, um die Probe vollständig zu homogenisieren. Jedes Röhrchen sollte nun das dissoziierte Gewebe von 10 Embryonen enthalten. Mit drei Milliliterspritzen und 16-Gauge-Nadeln aliquotiert ein Milliliter der Probe in zwei separate 35-Millimeter-Petrischale.

Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in der Petrischale verteilt ist. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Probe. Legen Sie die 35 Millimeter großen Petrischalen mit Zellen und Methylcellulose in eine 15 Zentimeter große Petrischale.

Geben Sie zu jeder großen Platte eine 35-Millimeter-Schale mit fünf Millilitern sterilem Wasser, um die Proben zu befeuchten. Inkubieren Sie die Schalen bei 32 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für sieben bis 10 Tage. Visualisieren Sie abschließend die koloniebildenden Einheiten gemäß dem Textprotokoll.

Nach sieben Tagen in Kultur mit hämatopoetischen Stützfaktoren wurden Vorläuferzellen von 48 embryonalen HPF-Zebrafischen gezählt und abgebildet. Wichtig ist, dass die Menge der verwendeten Mukoviszidose direkt mit der Anzahl der plattierten Embryonen korreliert. Die Beschichtung von vier oder acht Embryonen pro Milliliter, was dem Start mit 10 oder 20 Embryonen zu Beginn des Experiments entspricht, ergibt etwa 1200 bzw. 2400 KBE.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zweieinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Embryonen nicht zu überverdauen, da dies die Vorläuferzellen zerstört. Mit diesem Verfahren können Sie die Anzahl der zu verschiedenen Zeitpunkten vorhandenen Vorläuferzellen vergleichen.

Sie können mutierte Tiere mit Wildtyp-Tieren vergleichen und die Wirkung von Medikamenten auf die Blutentwicklung testen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Methylcellulose-Assay durchführen, um hämatopoetische Vorläuferzellen von Zebrafischen aufzuzählen. Sie können dieses Verfahren an Ihre spezifischen experimentellen Anforderungen anpassen, z. B. an das Testen bestimmter Zytokine.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Wirbeltierblut und Nadeln äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Assays immer Vorsicht geboten ist.