Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Menge an isolierter doppelsträngiger DNA und anschließenden Hochdurchsatz-Sequenzierungsbibliotheken aus Herbarproben zu erhöhen, um ihren Nutzen für phylogenomische Studien zu maximieren. Diese Methode erschließt das Potenzial von Herbarproben, die sonst aufgrund des umfangreichen Probenabbaus nicht für Sequenzierungsprojekte als genomische Sequenzen nützlich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie robust genug ist, dass seltene und historisch bedeutsame Herbarbelege verwendet werden können, ohne dass umfangreiche destruktive Probenahmen

Diese Technik erweitert die Tiefe der Taxon-Probenahme in systematischen Spaced-Projekten. Die Erfassung von Arten ist ein limitierender Schritt, aber mit diesem Protokoll können historische Sammlungen leicht für diese Studien verwendet werden. Fügen Sie flüssigen Stickstoff und 30 bis 50 Milligramm sterilisierten Sand hinzu, um einen Quadratzentimeter des vorausgewählten Herbargewebes in einem vorgekühlten Mörser und Stößel zu feinem Pulver zu mahlen.

Eine ausreichende Zerkleinerung ist für eine erfolgreiche DNA-Isolierung unerlässlich. Und es sollte darauf geachtet werden, dass die Probe vollständig pulverisiert wird. Geben Sie dann das gefrorene Pulver in zwei Zwei-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie nicht mehr als die Hälfte des Röhrchenvolumens.

Geben Sie dann 600 Mikroliter warme CTAB-Lösung in jedes Röhrchen. Mischen Sie das Pulver gründlich, indem Sie es umdrehen und vortexen. Dann inkubieren Sie die Proben in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius für ein bis 1,5 Stunden.

In der Zwischenzeit alle 15 Minuten vortexen. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation werden etwa 500 Mikroliter des Überstands in einen neuen, frischen Satz markierter Röhrchen überführt.

Fügen Sie dem Überstand vier Mikroliter à 10 Milligramm pro Milliliter RNase A zu jeder Abstimmung hinzu. Mischen Sie dann den Inhalt des Röhrchens durch Umdrehen oder Pipettieren. Inkubieren Sie die Proben in einem Wärmeblock oder Wasserbad, das 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gehalten wird.

Sobald die Röhrchen Raumtemperatur erreicht haben, fügen Sie den Proben etwa 500 Mikroliter eines Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches von 25:24:1 hinzu. Mischen Sie dann den Inhalt der Röhrchen durch Umdrehen oder wiederholtes Pipettieren. Anschließend werden die Proben bei 12.000 g 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Übertragen Sie die obere wässrige Schicht, die etwa 400 Mikroliter beträgt, auf einen frischen Satz markierter Röhrchen. Zu der wässrigen Schicht in jedem Röhrchen fügen Sie etwa 400 Mikroliter eines 24:1 Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches hinzu. Mischen Sie die Probe gründlich durch wiederholtes Pipettieren oder Inversion.

Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 g für fünf Minuten und überführen Sie etwa 300 Mikroliter der oberen wässrigen Schicht in vorgekühlte, markierte Röhrchen. Fügen Sie als nächstes 300 Mikroliter vorgekühltes Isopropanol und 12 Mikroliter 2,5 molare Natriumacetate hinzu. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten.

Nehmen Sie die Proben nach der Inkubation aus dem Gefrierschrank. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird das Pellet mit ca. 300 bis 500 Mikrolitern 70%igem Ethanol gewaschen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut bei 12.000 g für 10 Minuten. Entfernen Sie dann, ohne das Pellet zu stören, vorsichtig den Überstand. Als nächstes trocknen Sie die Pellets an der Luft und lösen die DNA in 50 Mikrolitern 1X Tris-EDTA-Puffer auf.

Geben Sie ein bis 16 Mikroliter isolierte DNA und zwei Mikroliter Fragmentierungsreaktionspuffer in ein 0,2-Milliliter-Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen. Stellen Sie das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 18 Mikroliter ein. Fügen Sie als Nächstes zwei Mikroliter doppelsträngiges DNA-Fragmentierungsenzym hinzu und wirbeln Sie die Mischung kurz für drei Sekunden.

Anschließend werden die Proben bei 37 Grad Celsius für 8,5 Minuten im Thermocycler inkubiert. Geben Sie nach der Inkubation fünf Mikroliter 0,5 molare EDTA in die Röhrchen. Fügen Sie 25 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen der gescherten DNA auf 50 Mikroliter einzustellen.

Fügen Sie dann 45 Mikroliter SPRI-Kügelchen, die bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, zu 50 Mikrolitern gescherter DNA hinzu und mischen Sie die beiden gründlich, indem Sie sie auf und ab pipettieren. Lassen Sie die Probe mit den Röhrchen fünf Minuten lang stehen. Übertragen Sie dann die Röhrchen auf eine Magnetplatte und warten Sie weitere fünf Minuten.

Den Überstand vorsichtig ausstoßen. Geben Sie dann 200 Mikroliter frisches 80%iges Ethanol in die Röhrchen auf dem Magnetständer und warten Sie weitere 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 30 Sekunden vorsichtig den Überstand.

Lassen Sie den Deckel der Tube offen, um die Kügelchen fünf Minuten lang auf dem Magnetständer an der Luft trocknen zu lassen. Nehmen Sie dann die Röhrchen vom Magnetständer und eluieren Sie die DNA von den Kügelchen in 55 Mikrolitern 0,1-fachem Tris-EDTA-Puffer. Mischen Sie die DNA gründlich durch wiederholtes Pipettieren.

Dann inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie das Röhrchen wieder auf den Magnetständer und warten Sie, bis die Lösung in etwa zwei Minuten klar ist. Entfernen Sie 52 Mikroliter des Überstands und führen Sie dann eine DNA-Quantifizierungsanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

Zu 50 Mikrolitern gereinigter und gescherter DNA fügen Sie drei Mikroliter Endonuklease, Phosphat-Tailing-Enzyme und sieben Mikroliter Reaktionspuffer hinzu. Mischen Sie die DNA und die anderen Bestandteile gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. Drehen Sie dann die Röhrchen, um die Blasen zu entfernen.

Nach dem Schleudern werden die Proben in einen Thermocycler überführt und das Programm eingestellt. Verdünnen Sie den Adapter um das 25- bis 50-fache, um eine Arbeitskonzentration von 0,6 bis 0,3 μmolar zu erreichen. Für eine Short-Read-Sequenzierung mit hohem Durchsatz geben Sie 30 Mikroliter Ligations-Mastermix, einen Mikroliter Ligationsverstärker und 2,5 Mikroliter Adapter in die Röhrchen.

Mischen Sie den Inhalt der Röhrchen gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. Drehen Sie die Röhrchen erneut, um Blasen zu entfernen. Dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 20 Grad Celsius für 15 Minuten.

Geben Sie drei Mikroliter einer handelsüblichen Mischung aus Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glykosylase-Lyase-Endonuklease VIII in die Röhrchen. Stellen Sie das Gesamtvolumen auf 96,5 Mikroliter ein. Die Komponenten gründlich mischen und bei 37 Grad Celsius 15 Minuten im Thermocycler inkubieren.

Bereiten Sie im Röhrchen die Polymerase-Kettenreaktionsmischung vor, indem Sie alle Reagenzien zur gereinigten, adapterligierten DNA hinzufügen. Dann die Reaktion durch Vortexen gut mischen. Sobald der Wirbel vorbei ist, geben Sie die Proben in den Thermocycler und starten Sie die Amplifikationseinstellung des Thermocyclers.

Geben Sie etwa 25 Mikroliter magnetischer Kügelchen, die bei Raumtemperatur gehalten werden, in die Probe und mischen Sie sie durch wiederholtes Pipettieren. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang. Übertragen Sie dann die Röhrchen auf einen Magnetständer und warten Sie weitere fünf Minuten.

Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand zu einem neuen Satz beschrifteter Röhrchen. Geben Sie dann sechs Mikroliter SPRI-Kügelchen in den Überstand und mischen Sie sie gründlich. Nachdem Sie die Proben fünf Minuten lang inkubiert haben, übertragen Sie die Röhrchen auf die Magnetplatte und warten Sie weitere fünf Minuten.

Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie dann 200 Mikroliter frisches 80%iges Ethanol in die Röhrchen auf dem Magnetständer. Inkubieren Sie die Röhrchen anschließend 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach 30 Sekunden vorsichtig den Überstand und trocknen Sie die Kügelchen fünf Minuten lang an der Luft bei geöffnetem Deckel der Tube, während Sie sich noch auf dem Magnetständer befinden. Entferne nun die Röhren vom Magneten. Eluieren Sie die Ziel-DNA aus den Kügelchen in 33 Mikroliter 0,1-fachen Tris-EDTA-Puffer und führen Sie eine gründliche Mischung durch.

Nach dem richtigen Mischen fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Setzen Sie dann die Röhrchen auf den Magnetständer und warten Sie etwa zwei Minuten, bis die Lösung klar wird. Pipettieren Sie 30 Mikroliter des Überstands zur Aufbewahrung in zwei Milliliter-Röhrchen.

Um die Isolierung von Herbar-DNA zu zeigen, wurde ein Agarose-Gel mit doppelsträngiger DNA durchgeführt, die aus verschiedenen Herbarproben isoliert wurde. Unter Verwendung von 10 Milligramm Blattgewebe wurden fast 3,56 bis 2.610 Nanogramm doppelsträngiger DNA isoliert auf das Agarosegel geladen. Das Gel zeigt in allen Bahnen abgebaute Herbar-DNA in Abstrichform.

Als nächstes wurde ein Agarose-Gel durchgeführt, um die Gewinnung einer hochwertigen Sequenzierungsbibliothek aus DNA zu zeigen, die aus 10 Herbarproben isoliert wurde. Vor der Beladung des Agarosegels wurden etwa 1,26 bis 464 Nanogramm der isolierten Herbar-DNA einer enzymatischen Scherung unterzogen und mit 90 % Bead-Volumen gereinigt. Das Agarose-Gel zeigt die Rückgewinnung einer hochwertigen Sequenzierungsbibliothek aus der DNA von 10 Herbarbelegen.

Die endgültigen Sequenzierungsbibliotheken zeigen eine primäre Bande zwischen 300 und 500 Basenpaaren. Um die Schrotflintensequenz der aus Herbarien gewonnenen DNA zu zeigen, wurde dann ein zirkuläres Diagramm des Chloroplastengenoms von TK 686 erhalten. Die Sequenz zeigt die Gesamtlänge der DNA, die invertierte Repeat-Region und das Vorhandensein von großen und kleinen Einzelkopie-Regionen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik an 24 Samples in weniger als 13 Stunden mit nur etwa acht Stunden aktiver Hands-on-Zeit durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Sequenzerfassung, an den resultierenden Bibliotheken durchgeführt werden, um Kerndaten für phylogenetische Studien zu generieren.