Name: Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Erfahren Sie eine robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbarproben. Diese Methode maximiert die Nutzung degradierter historischer Sammlungen in phylogenomischen Studien.

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Wir danken Taylor AuBuchon-Holunder, Jordan Teisher und Kristina Zudock um Hilfe bei der Probenahme Herbar und Missouri Botanical Garden Zugang zum Herbar für destruktive Probenahme. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (DEB-1457748).

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Die hier vorgestellten Protokoll ist eine umfassende und solide Methode zur DNA-Isolierung und Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von getrockneten Pflanzen. Die Konsistenz des Verfahrens und des minimalen Notwendigkeit, es zu ändern basierend auf Probe Qualität machen es skalierbar für große Herbarium-basierte Sequenzierung Projekte. Die Einbeziehung eines optionalen Reamplification Schritts für geringe Ausbeute Bibliotheken ermöglicht die Aufnahme von geringer Qualität, geringe Menge, selten, oder historisch wichtige...

Herbarium Sammlungen sind potentiell wertvolle Arten und genomische Diversität für Studien einschließlich Phylogenetik1,2,3, Populationsgenetik4,5, Erhaltung Biologie6, invasive Arten Biologie7und Merkmal Evolution8. Die Fähigkeit, eine große Vielfalt von Arten, Populationen, geografische Orte und Zeitpunkte zu erhalten unterstreicht die "Schatztruhe"9 , die das Herbarium. Historisch, hat degradierten Artder Herbarium abgeleitet DNA PCR-basierten Projekten, oft verwies Forscher mittels nur Marker gefunden in hohe Kopie, wie Regionen von Chloroplast Genom oder die interne transkribierten Distanzstück (ITS) aus der ribosomalen behindert. RNA. Qualität der Proben und DNA variieren ausgiebig basierend auf Methoden der Konservierung9,10, mit Doppelstrang-Brüche und Fragmentierung von Wärme in der Trocknung werden die häufigsten Formen von Schäden, die Schaffung der so genannte 90 % DNA Überbrückungskupplung, die PCR-basierten Studien11belastet hat. Abgesehen von Fragmentierung ist das zweithäufigste Problem im Herbarium Genomics Verunreinigungen, wie z. B. die endophytische Pilze13 abgeleitet oder Pilze Obduktion erworben nach Sammlung aber vor dem Einbau in das Herbarium12, obwohl dieses Problem kann gelöst Bioinformatically rechts Pilze Datenbank (s.u.) gegeben werden. Eine dritte, und weniger üblich, Problem ist Sequenz Modifikation durch Cytosin Deamination (C/G→T/A)14, obwohl es wird geschätzt (~ 0,03 %) niedrig sein Herbarium Exemplare11. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) kann das Problem der Fragmentierung mit kurzen Lese- und Sequenzierung Tiefe12,15, so dass Genomebene Datenerfassung aus zahlreichen Proben mit niedriger Qualität überwunden werden DNA, und manchmal sogar ganze Genom-Sequenzierung15erlaubt.
Herbarium Proben werden immer häufiger verwendet und sind ein größerer Bestandteil der phylogenetische Projekte16. Eine aktuelle Herausforderung für HTS Herbar zu verwenden ist konsequent ausreichend Doppel stranded DNA, eine notwendige Voraussetzung für die Sequenzierung Protokolle, von zahlreichen Tierarten in einer fristgerechten Weise erhalten ohne Methoden zur individuellen Optimierung Proben. In diesem Papier wird ein Protokoll für die DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung der Herbarbelege demonstriert, nutzt die vorhandenen Methoden und ändert sie, um schnelle und reproduzierbare Ergebnisse zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht für die Komplettbearbeitung von Probe zu einer Bibliothek von 24 Proben in 13 h, mit Hands-on-Zeit 8 h oder 16 h, mit 9 h Arbeitsaufwand beträgt, wenn der optionale Reamplification-Schritt benötigt wird. Gleichzeitige Verarbeitung von mehr Proben ist erreichbar, wenn der limitierende Faktor Zentrifuge Kapazität und technisches Geschick. Das Protokoll soll nur typische Laborgeräte (Thermocycler, Zentrifuge und magnetische steht) anstelle von Spezialausrüstung, wie z. B. einen Vernebler oder Sonikator, für Scheren DNA benötigen.
DNA-Qualität, Fragmentgröße und Menge sind Faktoren für den Einsatz von Herbar im Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimente begrenzt. Weitere Methoden zum Herbarium DNA zu isolieren und Erstellen von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken haben gezeigt, das Dienstprogramm zu verwenden so wenig wie 10 ng DNA-16; jedoch bedürfen experimentell ermitteln die optimale Anzahl von PCR-Zyklen für Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dies wird unpraktisch, beim Umgang mit äußerst geringen Mengen an lebensfähigen Doppel DNA (DsDNA), gestrandet, da einige Herbar nur genügend DNA für eine einzelne Bibliothek Zubereitung produzieren. Die hier vorgestellte Methode verwendet eine einzelne Zahl der Zyklen unabhängig von Sample-Qualität, so dass keine DNA Bibliothek Optimierungsschritte verloren geht. Stattdessen wird ein Reamplification Schritt aufgerufen, wenn Bibliotheken nicht die Mindestbeträge für die Sequenzierung erforderlich erfüllen. Viele Herbarium Proben sind selten und besitzen wenig Material macht es schwierig, destruktive Probenahme in vielen Fällen zu rechtfertigen. Um dem entgegenzuwirken, die vorgestellte Protokoll ermöglicht DsDNA Eingang Größen von weniger als 1,25 ng in der Bibliothek Vorbereitungsprozess, Erweiterung des lebensfähigen Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung und die Notwendigkeit einer destruktiven Entnahme von Proben zu minimieren.
Das folgende Protokoll wurde optimiert für Gräser und getestet auf Hunderte verschiedener Arten von Herbarium Proben, obwohl wir erwarten, dass das Protokoll auf viele andere Pflanzengruppen angewendet werden kann. Freuen Sie sich auf eine optionale Wiederherstellungsschritt, die verwendet werden, um niedrige Qualität und/oder seltene Exemplare zu speichern. Basierend auf mehr als zweihundert Herbar getestet, funktioniert dieses Protokoll auf Proben mit niedrigen Gewebe ein- und Qualität, so dass für die Erhaltung der seltene Exemplare durch minimale destruktive Probenahme. Hier wird gezeigt, dass dieses Protokoll hochwertige Bibliotheken bieten kann, die für Datenqualität-basierte Projekte sequenziert werden können.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 Well&nbsp;</td></tr><tr><td>Gel-Imaging-System</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Serie</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Trockenbad</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresesystem</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Reinstwasser)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA-LoBind-Röhrchen&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mörser</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>Porzellan</td></tr><tr><td>Stößel</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02595</td><td>Porzellan</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Streifenröhrchen und Kappe für PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff Kurzzeitlagerung</td><td>Nalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Magnet-Ring-Ständer&nbsp;</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 Bohrung&nbsp;</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Heizplattenrührer</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 x TE Puffer</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuklease A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml Lösung</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>bio</td><td>WORLD 40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>bio</td><td>WORLD 42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Isoamylalkohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Dinatriumsalz</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>ultrareiner</td></tr><tr><td>Gel-Ladefarbstoff Purple (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit für Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos für Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primer Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 x</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenollösung</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Quarzsand</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Reamplifikationsprimer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>siehe Text</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

robuste dna-isolierung und hochdurchsatz-sequenzierung bibliotheksbau für herbar

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbarien sind eine unschätzbare Quelle von pflanzlichem Material, das in einer Vielzahl von biologischen Studien verwendet werden kann. Die Verwendung von Herbar ist verbunden mit einer Reihe von Herausforderungen einschließlich Probenqualität Erhaltung geschädigter DNA und destruktive Probenahme seltene Exemplare. Um effektiver Herbarium Material in großen Sequenzierung Projekten verwenden, ist eine zuverlässige und skalierbare Methode der DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dieses Papier zeigt eine robuste, Anfang-Ende Protokoll für DNA-Isolierung und hohem Durchsatz Bibliotheksbau von Herbar, die keine Änderung für Einzelproben erfordert. Dieses Protokoll ist für niedrige Qualität getrocknet Pflanze Material und nutzt vorhandene Methoden durch die Optimierung der Gewebe Schleifen, ändern Bibliothek Größenauswahl und die Einführung eines optionalen Reamplification Schritt für geringe Ausbeute Bibliotheken zugeschnitten. Reamplification von geringer Ausbeute DNA-Bibliotheken kann Proben abgeleitet von unersetzlichen und potenziell wertvollen Herbar, negiert die Notwendigkeit für zusätzliche destruktive Probenahme und ohne erkennbare Sequenzierung Voreingenommenheit für gemeinsame retten. phylogenetische Anwendungen. Das Protokoll ist auf Hunderten von Grasart geprüft worden, aber wird voraussichtlich nach Prüfung für den Einsatz in anderen pflanzlichen Linien angepasst werden. Dieses Protokoll kann durch extrem geschädigter DNA, wo Fragmente nicht in der gewünschten Größenordnung vorhanden sind, und sekundäre Pflanzenstoffe in einigen Pflanzenmaterial vorhanden, die saubere DNA-Isolierung hemmen begrenzt. Dieses Protokoll stellt insgesamt eine schnelle und umfassende Methode, die DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung von 24 Proben in weniger als 13 Stunden mit nur 8 h aktive Handhabungszeit mit minimalen Anpassungen ermöglicht.

DNA-Isolierung und endgültige Bibliothek Ertrag In dieser Studie wurde die Wirksamkeit des Protokolls für die Isolierung von Herbarium DNA und die Verwertung von hochwertigen Sequenzierung Bibliotheken nachgewiesen mit fünfzig verschiedenen Proben mit das älteste aus dem Jahre 1920 und der jüngste ab 2012 (Tabelle 2). Für jede Probe wurde etwa 10 mg Blattgewebe für DNA-Isolierung verwendet. Grüner Blattgewebe wurde bevorzugt, falls verfügbar, und kein ...

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau aus Herbarium Material einschließlich Rettung von sehr schlechter Qualität DNA.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Menge an isolierter doppelsträngiger DNA und anschließenden Hochdurchsatz-Sequenzierungsbibliotheken aus Herbarproben zu erhöhen, um ihren Nutzen für phylogenomische Studien zu maximieren. Diese Methode erschließt das Potenzial von Herbarproben, die sonst aufgrund des umfangreichen Probenabbaus nicht für Sequenzierungsprojekte als genomische Sequenzen nützlich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie robust genug ist, dass seltene und historisch bedeutsame Herbarbelege verwendet werden können, ohne dass umfangreiche destruktive Probenahmen erforderlich sind.Diese Technik erweitert die Tiefe der Taxon-Probenahme in systematischen Spaced-Projekten. Die Erfassung von Arten ist ein limitierender Schritt, aber mit diesem Protokoll können historische Sammlungen leicht für diese Studien verwendet werden. Fügen Sie flüssigen Stickstoff und 30 bis 50 Milligramm sterilisierten Sand hinzu, um einen Quadratzentimeter des vorausgewählten Herbargewebes in einem vorgekühlten Mörser und Stößel zu feinem Pulver zu mahlen.Eine ausreichende Zerkleinerung ist für eine erfolgreiche DNA-Isolierung unerlässlich. Und es sollte darauf geachtet werden, dass die Probe vollständig pulverisiert wird. Geben Sie dann das gefrorene Pulver in zwei Zwei-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie nicht mehr als die Hälfte des Röhrchenvolumens.Geben Sie dann 600 Mikroliter warme CTAB-Lösung in jedes Röhrchen. Mischen Sie das Pulver gründlich, indem Sie es umdrehen und vortexen. Dann inkubieren Sie die Proben in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius für ein bis 1,5 Stunden.In der Zwischenzeit alle 15 Minuten vortexen. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation werden etwa 500 Mikroliter des Überstands in einen neuen, frischen Satz markierter Röhrchen überführt.Fügen Sie dem Überstand vier Mikroliter à 10 Milligramm pro Milliliter RNase A zu jeder Abstimmung hinzu. Mischen Sie dann den Inhalt des Röhrchens durch Umdrehen oder Pipettieren. Inkubieren Sie die Proben in einem Wärmeblock oder Wasserbad, das 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gehalten wird.Sobald die Röhrchen Raumtemperatur erreicht haben, fügen Sie den Proben etwa 500 Mikroliter eines Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches von 25:24:1 hinzu. Mischen Sie dann den Inhalt der Röhrchen durch Umdrehen oder wiederholtes Pipettieren. Anschließend werden die Proben bei 12.000 g 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.Übertragen Sie die obere wässrige Schicht, die etwa 400 Mikroliter beträgt, auf einen frischen Satz markierter Röhrchen. Zu der wässrigen Schicht in jedem Röhrchen fügen Sie etwa 400 Mikroliter eines 24:1 Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches hinzu. Mischen Sie die Probe gründlich durch wiederholtes Pipettieren oder Inversion.Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 g für fünf Minuten und überführen Sie etwa 300 Mikroliter der oberen wässrigen Schicht in vorgekühlte, markierte Röhrchen. Fügen Sie als nächstes 300 Mikroliter vorgekühltes Isopropanol und 12 Mikroliter 2,5 molare Natriumacetate hinzu. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten.Nehmen Sie die Proben nach der Inkubation aus dem Gefrierschrank. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird das Pellet mit ca. 300 bis 500 Mikrolitern 70%igem Ethanol gewaschen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut bei 12.000 g für 10 Minuten. Entfernen Sie dann, ohne das Pellet zu stören, vorsichtig den Überstand. Als nächstes trocknen Sie die Pellets an der Luft und lösen die DNA in 50 Mikrolitern 1X Tris-EDTA-Puffer auf.Geben Sie ein bis 16 Mikroliter isolierte DNA und zwei Mikroliter Fragmentierungsreaktionspuffer in ein 0,2-Milliliter-Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen. Stellen Sie das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 18 Mikroliter ein. Fügen Sie als Nächstes zwei Mikroliter doppelsträngiges DNA-Fragmentierungsenzym hinzu und wirbeln Sie die Mischung kurz für drei Sekunden.Anschließend werden die Proben bei 37 Grad Celsius für 8,5 Minuten im Thermocycler inkubiert. Geben Sie nach der Inkubation fünf Mikroliter 0,5 molare EDTA in die Röhrchen. Fügen Sie 25 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen der gescherten DNA auf 50 Mikroliter einzustellen.Fügen Sie dann 45 Mikroliter SPRI-Kügelchen, die bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, zu 50 Mikrolitern gescherter DNA hinzu und mischen Sie die beiden gründlich, indem Sie sie auf und ab pipettieren. Lassen Sie die Probe mit den Röhrchen fünf Minuten lang stehen. Übertragen Sie dann die Röhrchen auf eine Magnetplatte und warten Sie weitere fünf Minuten.Den Überstand vorsichtig ausstoßen. Geben Sie dann 200 Mikroliter frisches 80%iges Ethanol in die Röhrchen auf dem Magnetständer und warten Sie weitere 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 30 Sekunden vorsichtig den Überstand.Lassen Sie den Deckel der Tube offen, um die Kügelchen fünf Minuten lang auf dem Magnetständer an der Luft trocknen zu lassen. Nehmen Sie dann die Röhrchen vom Magnetständer und eluieren Sie die DNA von den Kügelchen in 55 Mikrolitern 0,1-fachem Tris-EDTA-Puffer. Mischen Sie die DNA gründlich durch wiederholtes Pipettieren.Dann inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie das Röhrchen wieder auf den Magnetständer und warten Sie, bis die Lösung in etwa zwei Minuten klar ist. Entfernen Sie 52 Mikroliter des Überstands und führen Sie dann eine DNA-Quantifizierungsanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben.Zu 50 Mikrolitern gereinigter und gescherter DNA fügen Sie drei Mikroliter Endonuklease, Phosphat-Tailing-Enzyme und sieben Mikroliter Reaktionspuffer hinzu. Mischen Sie die DNA und die anderen Bestandteile gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. Drehen Sie dann die Röhrchen, um die Blasen zu entfernen.Nach dem Schleudern werden die Proben in einen Thermocycler überführt und das Programm eingestellt. Verdünnen Sie den Adapter um das 25- bis 50-fache, um eine Arbeitskonzentration von 0,6 bis 0,3 μmolar zu erreichen. Für eine Short-Read-Sequenzierung mit hohem Durchsatz geben Sie 30 Mikroliter Ligations-Mastermix, einen Mikroliter Ligationsverstärker und 2,5 Mikroliter Adapter in die Röhrchen.Mischen Sie den Inhalt der Röhrchen gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. Drehen Sie die Röhrchen erneut, um Blasen zu entfernen. Dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 20 Grad Celsius für 15 Minuten.Geben Sie drei Mikroliter einer handelsüblichen Mischung aus Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glykosylase-Lyase-Endonuklease VIII in die Röhrchen. Stellen Sie das Gesamtvolumen auf 96,5 Mikroliter ein. Die Komponenten gründlich mischen und bei 37 Grad Celsius 15 Minuten im Thermocycler inkubieren.Bereiten Sie im Röhrchen die Polymerase-Kettenreaktionsmischung vor, indem Sie alle Reagenzien zur gereinigten, adapterligierten DNA hinzufügen. Dann die Reaktion durch Vortexen gut mischen. Sobald der Wirbel vorbei ist, geben Sie die Proben in den Thermocycler und starten Sie die Amplifikationseinstellung des Thermocyclers.Geben Sie etwa 25 Mikroliter magnetischer Kügelchen, die bei Raumtemperatur gehalten werden, in die Probe und mischen Sie sie durch wiederholtes Pipettieren. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang. Übertragen Sie dann die Röhrchen auf einen Magnetständer und warten Sie weitere fünf Minuten.Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand zu einem neuen Satz beschrifteter Röhrchen. Geben Sie dann sechs Mikroliter SPRI-Kügelchen in den Überstand und mischen Sie sie gründlich. Nachdem Sie die Proben fünf Minuten lang inkubiert haben, übertragen Sie die Röhrchen auf die Magnetplatte und warten Sie weitere fünf Minuten.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie dann 200 Mikroliter frisches 80%iges Ethanol in die Röhrchen auf dem Magnetständer. Inkubieren Sie die Röhrchen anschließend 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie nach 30 Sekunden vorsichtig den Überstand und trocknen Sie die Kügelchen fünf Minuten lang an der Luft bei geöffnetem Deckel der Tube, während Sie sich noch auf dem Magnetständer befinden. Entferne nun die Röhren vom Magneten. Eluieren Sie die Ziel-DNA aus den Kügelchen in 33 Mikroliter 0,1-fachen Tris-EDTA-Puffer und führen Sie eine gründliche Mischung durch.Nach dem richtigen Mischen fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Setzen Sie dann die Röhrchen auf den Magnetständer und warten Sie etwa zwei Minuten, bis die Lösung klar wird. Pipettieren Sie 30 Mikroliter des Überstands zur Aufbewahrung in zwei Milliliter-Röhrchen.Um die Isolierung von Herbar-DNA zu zeigen, wurde ein Agarose-Gel mit doppelsträngiger DNA durchgeführt, die aus verschiedenen Herbarproben isoliert wurde. Unter Verwendung von 10 Milligramm Blattgewebe wurden fast 3,56 bis 2.610 Nanogramm doppelsträngiger DNA isoliert auf das Agarosegel geladen. Das Gel zeigt in allen Bahnen abgebaute Herbar-DNA in Abstrichform.Als nächstes wurde ein Agarose-Gel durchgeführt, um die Gewinnung einer hochwertigen Sequenzierungsbibliothek aus DNA zu zeigen, die aus 10 Herbarproben isoliert wurde. Vor der Beladung des Agarosegels wurden etwa 1,26 bis 464 Nanogramm der isolierten Herbar-DNA einer enzymatischen Scherung unterzogen und mit 90 % Bead-Volumen gereinigt. Das Agarose-Gel zeigt die Rückgewinnung einer hochwertigen Sequenzierungsbibliothek aus der DNA von 10 Herbarbelegen.Die endgültigen Sequenzierungsbibliotheken zeigen eine primäre Bande zwischen 300 und 500 Basenpaaren. Um die Schrotflintensequenz der aus Herbarien gewonnenen DNA zu zeigen, wurde dann ein zirkuläres Diagramm des Chloroplastengenoms von TK 686 erhalten. Die Sequenz zeigt die Gesamtlänge der DNA, die invertierte Repeat-Region und das Vorhandensein von großen und kleinen Einzelkopie-Regionen.Einmal gemeistert, kann diese Technik an 24 Samples in weniger als 13 Stunden mit nur etwa acht Stunden aktiver Hands-on-Zeit durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Sequenzerfassung, an den resultierenden Bibliotheken durchgeführt werden, um Kerndaten für phylogenetische Studien zu generieren.

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Hallo-C-Methode ermöglicht unvoreingenommene, genomweite Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen (1). Hallo-C Paare Ligationssysteme und massiv parallele Sequenzierung. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um genomische Architektur auf mehreren Skalen zu studieren: die ersten Ergebnisse identifizierten Features wie Chromosom Gebiete, Segregation von offenen und geschlossenen Chromatin und Chromatin-Struktur an der Megabasen.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Der Vergleich und die Optimierung zweier pflanzenorganischer DNA-Anreicherungsmethoden werden vorgestellt: traditionelle Differentialzentrifugation und Fraktionierung der gesamten gDNA auf Basis des Methylierungsstatus. Wir beurteilen die resultierende DNA-Quantität und -Qualität, zeigen die Leistung in der Kurzzeit-Sequenzierung der nächsten Generation und diskutieren das Potenzial für den Einsatz in der Langzeit-Einzelmolekül-Sequenzierung.

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Gel-Seq ermöglicht Forschern gleichzeitig Bibliotheken für beide DNA und RNA-Seq bei vernachlässigbaren Kosten ab 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel-Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

Kontamination während der Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Organismen bleibt ein großes Problem. Hier zeigen wir eine Methode um das Genom der Bärtierchen aus einem einzigen Exemplar mit so wenig wie 50 Pg genomic DNA ohne Verstärkung des gesamten Genoms zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu sequenzieren.

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Long-Read Sequenzen erleichtern erheblich die Montage komplexer Genome und Charakterisierung von strukturellen Variation. Wir beschreiben eine Methode um ultra-lange Sequenzen durch Sequenzierung Nanopore-basierte Plattformen zu generieren. Das Konzept nimmt eine optimierte DNA-Extraktion, gefolgt von modifizierten Bibliothek Vorbereitungen, Hunderte von Kilobase liest mit moderaten Abdeckung aus menschlichen Zellen zu generieren.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Ansatz für die Kultivierung, Sequenzierung und De-novo-Hybridgenomassemblierung von Harnbakterien.   Es bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung vollständiger, zirkulärer Genomsequenzen, die bei der Untersuchung sowohl chromosomaler als auch extrachromosomaler genetischer Elemente nützlich sind, die zur Kolonisierung im Urin, zur Pathogenese und zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

Der vorliegende Artikel zielt darauf ab, detaillierte und adäquate Protokolle für die Isolierung pflanzenassoziierter endophytischer Pilze, die Langzeitkonservierung von Isolaten, die morphologische Charakterisierung und die Gesamt-DNA-Extraktion für die anschließende molekulare Identifizierung und metagenomische Analyse bereitzustellen.

Isolierung, Charakterisierung und Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung endophytischer Pilze in mykoheterotrophen Pflanzen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der DNA-Barcoding-Technologie zur Authentifizierung von pflanzlichen medizinischen Materialien und der Heilpflanze Angelica sinensis (Oliv.) Als Beispiel wurde Diels genannt.

Anwendung von DNA-Barcoding zur Identifizierung von Heilpflanzen

Erfahren Sie eine robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbarproben. Diese Methode maximiert die Nutzung degradierter historischer Sammlungen in phylogenomischen Studien.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

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