Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lipoproteine aus Bakterienzellen für direkte Anwendungen zu extrahieren und N-terminale Lipopeptide für die Strukturanalyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie weiter vorzubereiten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, da die N-terminale Struktur der Lipoproteine die Erkennung und Signalübertragung von Toll-like-Rezeptoren beeinflusst, was sich auf die Immunantwort des Wirts auswirkt. Der einzigartige Vorteil dieser Technik ist die fakultative, aber absichtliche Bildung von Natriumaddukten, die die Fragmentierung in Richtung des diagnostischen Dehydroalanyl-Ions fördern und die strukturelle Zuordnung des Acylierungszustands des Lipoproteins unterstützen.

Züchten Sie Bakterien in 15 Millilitern tryptischer Sojabrühe oder ähnlichen Rich Media bis zur späten exponentiellen Phase. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie sie einmal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung EDTA oder TBSE. resuspendieren Sie die Zellen in 800 Mikrolitern TBSE mit einem millimolaren PMSF und 0,5 Milligramm pro Milliliter Lysozym.

Füllen Sie die Lösung in ein 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Gewinde mit Schraubverschluss und O-Ring, bevor Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Geben Sie etwa 800 Mikroliter 0,1 Millimeter Zirkonoxid-Kieselsäurekügelchen in das Röhrchen und zerkleinern Sie dann die Zellen, indem Sie fünf Zyklen von jeweils 30 Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit auf einem Homogenisator schütteln und zwischen jedem Zyklus eine zweiminütige Pause auf Eis einlegen. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 3.000 g Pulvertemperatur, um Kügelchen und unbeschädigte Zellen zu pelletieren.

Den Überstand in ein neues 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und auf Eis legen. Geben Sie 200 Mikroliter TBSE zum verbleibenden Pellet und kehren Sie für einen weiteren Zyklus zum Homogenisator zurück. Zentrifugieren Sie wie zuvor und kombinieren Sie den Überstand mit dem vorherigen Überstand.

Ergänzen Sie den Überstand mit TX-114 Tensid auf eine Endkonzentration von 2 %, indem Sie ein gleiches Volumen von 4 % Tensid in eiskaltem TBSE hinzufügen. Den ergänzten Überstand eine Stunde lang auf Eis inkubieren und alle 15 Minuten durch Inversion mischen. Übertragen Sie das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und inkubieren Sie es 10 Minuten lang, um eine Phasentrennung zu induzieren.

Die Probe wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 10.000 g zentrifugiert, um eine zweiphasige Trennung aufrechtzuerhalten. Die obere wässrige Phase vorsichtig abpipettieren und verwerfen. Geben Sie eiskaltes TBSE in die untere Tensidphase, um das Röhrchen wieder auf sein ursprüngliches Volumen zu füllen, und invertieren Sie es zum Mischen.

10 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation wird das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad überführt und 10 Minuten lang inkubiert, um eine Phasentrennung zu induzieren, und dann bei 10.000 g g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nachdem Sie diese Schritte noch einmal für insgesamt drei Trennungen wiederholt haben, entfernen Sie die obere wässrige Phase und verwerfen Sie.

Entfernen Sie das Pellet aus gefällten Proteinen, das sich im Laufe der Extraktionen gebildet hat, indem Sie der Tensidphase ein Volumen eiskaltes TBSE zusetzen. Zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius und 16.000 g für zwei Minuten, um das unlösliche Protein zu pelletieren. Den Überstand sofort in ein frisches 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1.250 Mikrolitern 100%igem Aceton umfüllen.

Mischen Sie die Probe durch Inversion und inkubieren Sie sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius, um das Protein auszufällen. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Lipoproteine unter Berücksichtigung der Ausrichtung des Röhrchens zu pelletieren. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 100 % Aceton, bevor Sie das Aceton umfüllen und die Probe an der Luft trocknen lassen.

Fügen Sie dann 20 bis 40 Mikroliter 10-millimolares Tris-HCL mit einem pH-Wert von 8,0 hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gründlich, indem Sie mit den gefällten Lipoproteinen gegen die Wand auf und ab pipettieren. Trennen Sie die Lipoproteine mittels SDS-PAGE mit Standardmethoden. Übertragen Sie die Lipoproteine mit einem Standard-Elektroblotting-Verfahren auf eine Nitrozellulose-Transfermembran.

Übertragen Sie die Nitrozellulosemembran in ein Gefäß und bedecken Sie sie mit Ponceau S-Lösung. Schaukeln Sie fünf Minuten lang vorsichtig oder bis rot-rosa Streifen sichtbar sind. Gießen Sie die Ponceau S-Lösung ab und spülen Sie die Nitrozellulosemembran vorsichtig mit destilliertem Wasser ab, um überschüssige Flecken zu entfernen.

Mit einer sauberen Rasierklinge die gewünschte Bande herausschneiden und in ein Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Waschen Sie die Membran dreimal mit einem Milliliter destilliertem Wasser, um das Band vollständig zu entfärben. Nachdem Sie den Schnitt auf eine saubere Oberfläche übertragen haben, verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um den Nitrozellulosestreifen in kleine Stücke von etwa einem Millimeter x einem Millimeter zu zerlegen.

Sammeln Sie die Stücke in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Zum Schluss waschen Sie die Stücke zweimal mit 500 Mikrolitern frisch zubereitetem 50-Millimolar-Ammoniumbicarbonat mit einem pH-Wert von 7,8 in einem Wasser in HPLC-Qualität. Die Nitrocellulosestücke werden in 20 Mikrolitern einer Trypsinlösung von 20 Mikrogramm pro Milliliter in 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat resuspendiert.

Die resuspendierten Nitrozellulosestücke zum Mischen vortexen. Dann das Röhrchen kurz drehen, um sicherzustellen, dass alle Stücke vollständig von der Trypsin-Lösung bedeckt sind. Decken Sie den Röhrchendeckel mit Paraffinfolie ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie den Aufschluss über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Schleudern Sie die Probe 30 Sekunden lang mit 16.000 g und entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren. Geben Sie dann 50 Mikroliter 0,5%ige Trifluoressigsäure in Wasser in HPLC-Qualität. Nach dem Vortexen zum Mischen die Probe kurz drehen, um sicherzustellen, dass alle Stücke von der Lösung bedeckt sind, und die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Entnahme der Flüssigkeit durch Pipettieren wiederholen Sie diesen Schritt mit 50 Mikrolitern 10 % Acetonitril und wiederholen Sie dann erneut mit 50 Mikrolitern 20 % Acetonitril. Um die fest gebundenen Lipopeptide zu eluieren, fügen Sie 15 Mikroliter frisch hergestellte CHCA-Matrix mit 10 Milligramm pro Milliliter hinzu, die in Chloroform-Methanol gelöst ist. 10 Minuten bei Raumtemperatur mit intermittierender Vortexbildung inkubieren.

Um die Bildung von Natriumaddukten zu fördern, ist die Lösung von CHCA in Chloroform-Methanol mit wässrigem Natriumbicarbonat bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar zu ergänzen. Nachdem Sie die Probe kurz gedreht haben, übertragen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Diese Lösung enthält den Großteil der N-terminalen Lipopeptide.

Lagern Sie einen Mikroliter der eluierten Lipopeptide mit CHCA auf ein MALDI-Target aus poliertem Stahl ab. Fahren Sie sofort mit der Massenspektrometrie fort. Beispielhafte Massenspektren der stufenweisen Nitrocellulose-Waschlösungen des Enterococcus faecalis Lipoproteins PnrA sind hier dargestellt.

Mit jedem weiteren Waschen werden Änderungen der Signalintensität und eine Abnahme der einzelnen Peaks beobachtet, die in dem hochangereicherten N-terminalen Lipopeptid-Ion in der abschließenden Elutionsfraktion gipfeln. Das MS/MS-Spektrum des Ausgangs-Lipopeptidions zeigt, dass es sich um das Lysoforme handelt, wobei die Fragmentionen dem N-terminalen PnrA-tryptischen Peptid entsprechen, das eine alpha-aminogebundene Acylkette und eine Monoacylglycerinstruktur aufweist. Die Zugabe von Natriumbicarbonat zur eluierten Lipopeptidfraktion des Escherichia coli Lipoproteins Lpp führt zu einer Erhöhung um 22-Dalton gegenüber der berechneten N-terminalen Masse.

Die MS/MS-Analyse des Mutterions im Vergleich zu seinem Natriumaddukt zeigt eine bevorzugte Fragmentierung in Richtung des Dehydroalanyl-Ions des sodiierten Elternteils durch neutrale Eliminierung der Diako-Thioglyceryl-Einheit. Dies hilft bei der strukturellen Bestimmung des N-terminalen Acylierungszustands. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass jede schrittweise Nitrozellulose-Waschfraktion durch Massenspektrometrie analysiert werden kann, was sowohl die Proteinidentifizierung als auch die N-terminale Charakterisierung des Lipopeptids in einem einzigen Experiment ermöglicht.

Nach der Lipoproteinextraktion aus Bakterien können weitere Experimente wie zellbasierte Assays zur Messung der Toll-like-Rezeptor-Signalgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie der Acylierungszustand des Lipoproteins die Immunantwort des Wirts beeinflusst.