Name: Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Lernen Sie die Extraktion bakterieller Lipoproteine mittels nichtionischer Tensid-Phasenpartitionierung zur Aufklärung der N-terminalen Struktur durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie.

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Forschung im Labor Meredith wurde von Start-up aus Mitteln der Eberly Hochschule der Wissenschaft (Pennsylvania State University) unterstützt. Wir danken Dr. Tatiana Laremore für kompetente technische Beratung und Zugang zu Geräten an der Penn State Proteomics und Mass Spectrometry Core Facility, University Park, PA, wo massenspektrometrische Analysen durchgeführt wurden.

(1) Zelle Wachstum und Lyse
<ol><li>Wachsen Sie Bakterien in 15 mL tryptic Soy Bouillon (TSB) oder ähnliche rich Media zu späten exponentiellen Phase (OD600 von 1,0-1,5). Ernten von Zellen durch Zentrifugation, einmal mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung/EDTA (TBSE) waschen und mit Protokoll fortfahren oder bis zum Gebrauch einfrieren. Hinweis: TBSE: 20 mM Tris-Hydrochlorid (HCl), pH 8.0, 130 mM Natriumchlorid (NaCl), und 5 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)). Lipoprotein-Ausdruck und Modifikation können durch Wachstumsbedingungen (z.B. Säure, Salzgehalt, Wachstumsmedien) und Wachstum Phase15beeinflusst werden. Zellwachstum kann skaliert werden, wie gewünscht, sondern 15 mL von Zellen ist für eine einzelne Vorbereitung der Lipoproteine empfehlen, da überschüssige Biomasse Lipoprotein Ertrag verringern kann. Eine 15-mL-Vorbereitung ergibt in der Regel genügend Blut für die optimale Beladung von ~ 2-4 Fahrspuren auf einem standard Mini SDS-PAGE-Gel.</li>
	<li>Zellen in 800 μl TBSE mit 1 mM Phenylmethyl Sulfonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mg/mL Lysozym aufzuwirbeln. Lösung zu einem 2,0 mL Gewinde Microcentrifuge Schlauch mit Schraubverschluss und o-Ring zu übertragen und 20 min bei 37 ° c inkubieren Hinweis: Bestimmte Arten sind nicht anfällig für Lyse von Lysozym. Eine entsprechende lytische Enzym sollten ersetzt werden, um Lyse zu erleichtern.</li>
	<li>Die Röhre ~ 800 μl 0.1 mm Zirkonia/Kieselsäure Perlen hinzu und stören Zellen durch Schütteln mit maximaler Geschwindigkeit (7.000 u/min) auf einem Homogenisator für 5 Zyklen von 30 s jeweils mit 2 min ruhen auf dem Eis zwischen jedem Zyklus.</li>
	<li>Zentrifuge Probe bei 3000 X g für 5 min bei 4 ° C (pellet-Perlen und ungebrochene Zellen). Übertragen Sie den überstand zu, zu einem neuen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch und halten Sie auf dem Eis.</li>
	<li>Die restlichen Pellets 200 μL TBSE hinzu und zurück zu den Homogenisator für einen weiteren Zyklus. Zentrifugieren Sie (siehe oben) und kombinieren Sie überstand mit der vorherigen überstand (sollte 800-1000 μl Gesamtvolumen) zu.</li>
</ol>(2) Anreicherung von Lipoproteinen durch TX-114 Phase Partitionierung
<ol><li>Den Überstand mit TX-114 Tensid, eine Endkonzentration von 2 % (Vol/Vol) durch das Hinzufügen von ein gleiches Volumen von 4 % (Vol/Vol) das Tensid in eiskalten TBSE ergänzen und Inkubation für 1 h, mischen durch Umkehrung jedes ~ 15 min auf Eis. Hinweis: Wenn gekühlt, wird der überstand und Tensid mischbar sein.</li>
	<li>Übertragen Sie das Rohr auf 37 ° C Wasserbad und inkubieren Sie für 10 min, Phasentrennung zu induzieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur , Bi-phasisch Trennung aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Vorsichtig aus der oberen wässrigen Phase pipette und verwerfen. Die untere Tensid-Phase um das Rohr zu seinem ursprünglichen Volumen wieder aufzufüllen eiskalte TBSE hinzu und kehren Sie um zu mischen. Inkubieren Sie für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Übertragen Sie das Rohr auf 37 ° C Wasserbad inkubieren 10 min induzieren Phasentrennung und Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,4 einmal mehr für eine Gesamtmenge von 3 Trennungen. Entfernen der oberen wässrigen Phase und entsorgen.</li>
	<li>Entfernen Sie Pellet ausgefällten Proteine, die im Laufe der Extraktionen (sichtbar an der Unterseite des Rohrs), gebildet, indem die Tensid-Phase 1 Volumen von eiskalten TBSE hinzufügen. Zentrifugieren Sie bei 4 ° C bei 16.000 x g für 2 min zu unlöslichen Protein Pellets. Hinweis: Probe sollte eine einzelne Phase bleiben. Wenn Phasentrennung auftritt, neu chill Probe und Zentrifugieren Sie wieder. Das Pellet besteht im Allgemeinen aus nicht-Lipoprotein Verunreinigungen, aber zur weiteren Analyse beibehalten werden.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand sofort zu einem frischen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1250 μl 100 % Aceton Pipette oben und unten gründlich, um die Probe von der Spitze zu waschen, wie es zähflüssig sein wird. Mischen Sie durch Umkehrung und Inkubation über Nacht bei-20 ° C Protein ausgefällt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur, pellet-Lipoproteine mit Augenmerk auf die Ausrichtung des Rohres. Lipoproteine bildet einen dünnen, weißen Film entlang der Außenwand des Rohres.</li>
	<li>Waschen Sie Pellet zweimal mit 100 % Aceton. Dekantieren Sie Aceton und lassen Sie Probe an der Luft trocknen.</li>
	<li>20-40 μl 10 mm Tris-HCl, pH 8.0 oder ein standard Laemmli SDS-PAGE Probe Puffer16 hinzufügen und gründlich von oben und unten an der Wand mit der ausgefällten Lipoproteine pipettieren aufzuwirbeln. Kratzen Sie die Seite des Rohrs mit der PIPETTENSPITZE, Lipoproteine zu verdrängen. Hinweis: Lipoproteine löst sich nicht in Tris-Puffer, aber eher eine Suspension bilden.<ol>
<li>Lipoproteine bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) SDS-PAGE, Elektroblotting und Färbungen mit Ponceau S
<ol><li>Separate Lipoproteine durch SDS-PAGE mit Standardmethoden16. Hinweis: Die entsprechenden Gel Acrylamid-Anteil variiert je nach Verwendungszweck und Größe der Lipoproteine. Hier wurden E. Faecalis Lipoproteine über 10 % Tris-Glycin Gel getrennt, während eine 16,5 %-Tris-Tricine-Gel für die kleineren E. Coli Lipoprotein Lpp17verwendet wurde.</li>
	<li>Übertragen Sie die Lipoproteine auf Nitrozellulose Transfer Membran mit einem standard Elektroblotting-Verfahren. Hinweis: Eine halbtrockene Übertragung mittels Bjerrum Schafer-Nielsen Puffer plus 0,1 % SDS wurde in 25 V, 1,3 mA für 15 min18. Alternativ könnte Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran verwendet werden, jedoch wie es mehr hydrophobe als Nitrozellulose, es effizient Elution von hydrophoben Lipopeptide von der Membrane in späteren Schritten verringern kann.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nitrozellulose-Membran auf einen Behälter und Deckel mit Ponceau S-Lösung (0,2 % (w/V) Ponceau S in 5 % Essigsäure). Rock, sanft für 5 min oder bis rot-rosa Bänder sichtbar sind.</li>
	<li>Ponceau S Lösung abgießen und sorgfältig ausspülen der Nitrozellulose-Membran mit dH2O überschüssiges entfernen Flecken. Hinweis: Ponceau-gefärbten Bändern werden schnell destain. Wenn die Bänder verschwinden, wiederholen Sie Färbung.</li>
	<li>Mit einer sauberen Rasierklinge Verbrauchsteuern Sie die gewünschte Band und den Transfer zu einem Microcentrifuge Schlauch. Waschen Sie dreimal mit 1 mL dH2O, vollständig die Band destain. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Speichern Sie den ausgeschnittenen Bereich bedeckt mit Wasser bei-20 ° C bis zur Verwendung.</li>
	<li>Abschnitt zu übertragen, um eine saubere Oberfläche und mit einer sauberen Rasierklinge, Würfel des Nitrozellulose-Streifens in kleine Stücke von ca. 1 mm x 1 mm. sammeln die Stücke in einem 0,5 mL eiweißarme Bindung Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Waschen Sie die Stücke zweimal mit 0,5 mL des frisch zubereiteten 50 mM Ammonium Bicarbonat (NH4HCO3), pH 7,8 im Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Grade Wasser.</li>
</ol>4. folgen Verdauung, Lipopeptide Extraktion aus Nitrozellulose-Membran, Ablagerung auf MALDI Ziel- und Datenerfassung
<ol><li>Nitrozellulose-Stücke in 20 μl einer 20 μg/mL Lösung von Trypsin in 50 mM NH4HCO3pH 7,8 in HPLC Grade Wasser aufschwemmen. Wirbel zu mischen, dann kurz drehen, um sicherzustellen, dass alle Stücke die Trypsin-Lösung vollständig abgedeckt sind. Decken Sie den Schlauch Deckel mit Paraffin Film um Verdunstung zu verhindern und Digest über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Drehung der Probe bei 16.000 x g für 30 s und Entfernen der Flüssigkeit durch pipettieren. Hinweis: Dies entfernt trypsiniert hydrophilen Peptide, die später durch MALDI-TOF MS Proteinidentifikation untersucht werden können.</li>
	<li>50 μL der 0,5 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in HPLC Grade Wasser hinzufügen. Vortex mischen, dann drehen Sie die Probe kurz um sicherzustellen, dass alle Stücke von der Lösung bedeckt sind. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch pipettieren. Vorsicht: TFA ist Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.3 mit 50 μL der 10 % Acetonitril HPLC Grade Wasser. Vorsicht: Acetonitril ist Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.3 mit 50 μL der 20 % Acetonitril HPLC Grade Wasser. Hinweis: Dadurch werden alle mäßig hydrophoben Peptiden lose gebunden, die Nitrozellulose entfernt.</li>
	<li>Eluieren fest gebundenen Lipopeptide, hinzufügen 15 μl 10 mg/mL frisch zubereiteten α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) Matrix in Chloroform-Methanol (2:1, V/V) gelöst und 10 min bei Raumtemperatur mit intermittierenden Vortexen inkubieren.<ol>
<li>Alternativ fügen Sie 15 μl Chloroform-Methanol zu eluieren Lipopeptide und mischen Sie mit Matrix zu einem späteren Zeitpunkt hinzu. Andere Matrizen, wie z. B. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB), sollte als Alternative zu CHCA getestet werden, wenn unbefriedigende Ergebnisse, für eine bestimmte Lipopeptide Komposition erzielt werden. Vorsicht: Chloroform und Methanol sind gesundheitsschädlich bei Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.</li>
		<li>
Optional: Natrium zu fördern Bildung Addukt, ergänzen die Lösung von CHCA in Chloroform-Methanol mit wässrigen Natriumbicarbonat (Nahco33) um eine Endkonzentration von 1 mM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drehen Sie die Probe kurz. Übertragen Sie mit einer Pipette vorsichtig die Flüssigkeit auf einen neuen low-Protein Bindung Microcentrifuge Schlauch. Diese Lösung enthält den Großteil der N-terminalen Lipopeptide. Hinweis: Die Nitrozellulose kann ganz oder teilweise in der Chloroform-Methanol-Lösung auflösen. Dies wirkt sich nicht negativ auf MS-Ergebnisse und kann als alternative Methode zur Steigerung Lipopeptide Rendite verwendet werden. PVDF-Membran löst sich nicht auf die gleiche Weise.</li>
	<li>1 μl der eluierten Lipopeptide mit CHCA auf einer polierten Stahl MALDI-Ziel zu hinterlegen. Hinweis: Das Chloroform-Methanol wird schnell verdunsten hinterließ kristallisierten CHCA und Lipopeptide. Eine optionale zweite 1 μL aliquoten kann auf den gleichen Punkt Erhöhung der probenkonzentration deponiert werden. Chloroform-Methanol kann deutlich nach Absetzung des Ziels verbreitet und als solche sollte darauf geachtet werden um zu vermeiden, Probe mischen auf dem Ziel. Es wird empfohlen, zu hinterlegen und schießen mehrere Flecken jeder Probe.</li>
	<li>Fahren Sie sofort mit Massenspektrometrie. Scannen Sie alle Bereiche des Spots für Lipopeptide Signal, vor allem, wenn der Spot zwei Schichten der Probe, enthält, wie die zweite Schicht der Lipopeptide zum äußeren Rand der Stelle schieben kann. Hinweis: Empfohlene Ausgangspunkt Laserstärke ist 25 %, obwohl es möglicherweise erforderlich, erhöhen die Intensität um Signal zu erwerben und die Summe mehrere Spektren (20 oder mehr Scans) um ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Hier Spektren wurden erworben, auf einem MALDI-TOF-TOF-Instrument (siehe die Tabelle der Materialien) mit einer Fabrik konfiguriert Instrument-Methode für den Reflektor positiv-Ionen-Nachweis über den 700-3500 m/Z -Bereich. Das Gerät wurde mit einer Rinderserumalbumin (BSA) folgen Peptid Mischung kalibriert.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll hierin beschreibt zwei Phasen der Lipoprotein-Charakterisierung: Anreicherung von TX-114 phase Partitionierung und strukturellen Bestimmung durch MALDI-TOF MS. Während der TX-114 Extraktion entfernt zusätzliche Zentrifugation kontaminierende Proteine, die während dieses Prozesses, gefolgt von Aceton Niederschlag hochangereichertem Lipoproteine Ausbeute auszufällen. Durch die Begrenzung des Ausmaßes der jede Vorbereitung auf 15 mL im Wert von Zellen, können mehrere Proben problemlos parallel verarbeitet und ...

Bakterielle Lipoproteine zeichnen sich durch eine konservierte N-terminale Lipid-modifizierten Cystein, die die kugelförmige Protein-Domäne an die Oberfläche der Zellmembran verankert. Sie verteilen sich universell in Bakterien, bildet 2 bis 5 % aller zellulärer Gene innerhalb einer typischen Genom-1. Lipoproteine spielen eine kritische Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Nährstoffaufnahme, Signaltransduktion, Montage von Proteinkomplexen und bei der Aufrechterhaltung der Zelle Umschlag strukturelle Integrität2. Bei pathogenen Bakterien dienen Lipoproteine als Virulenz Faktoren3,4. Während einer Infektion stachelt Anerkennung der N-terminalen Lipopeptide von Toll-Like-Rezeptor (TLR) 2 eine angeborene Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger zu entfernen. Je nach dem N-terminalen Acylation Zustand sind Lipoproteine Alternative TLR2-heterodimerisierenden-komplexe in der Regel anerkannt. TLR2-TLR1 erkennt N-Acylated Lipopeptide, während TLR2-TLR6 bindet freie Lipopeptide α-Aminosäure Termini. Einmal gebunden, konvergieren die Signalwege induzieren Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen3,4.
Früher dachte man, dass Lipoproteine von gram-positiven Bakterien Diacylated und die von Gram-negativen Bakterien Triacylated waren, unterscheiden sich in das Fehlen oder Vorhandensein einer Amid-linked Fettsäure auf der erhaltenen N-terminalen Cystein Rückstand. Diese Annahme wurde durch den Mangel an Sequenz Orthologe in gram-positiven Genomen, Lnt, Gram-negative N-Acyl-Transferase unterstützt, die Triacylated Lipoproteine5bildet. Jedoch haben neuere Studien Lipoprotein Triacylation in gram-positiven Firmicuten, dass fehlende Lnt, sowie drei neuartige N-terminale Lipoprotein Strukturen bezeichnet die Peptidyl, Lyso und N -Acetyl Formen6,7 gezeigt. ,8. Diese Erkenntnisse werfen Fragen über mögliche noch entdeckt Lipoprotein Formen, neben grundlegende Fragen wie diese neuartige Lipoproteine entstehen und welche physiologischen Zweck oder nutzen die verschiedenen Formen vermitteln. Darüber hinaus zeigen sie die aktuelle Unfähigkeit der Genomik, Lipoprotein Struktur Vorhersagen. In der Tat haben wir vor kurzem eine neuartige Klasse von Lipoprotein-N-Acyl-Transferasen, Lit, von Enterococcus Faecalis und Bacillus Cereus , das Lyso-Formular Lipoproteine9macht aufgerufen. Dies zeigt die Notwendigkeit, die aufgrund ihrer extrem hydrophoben Charakters und begrenzte Methoden zur Verfügung, um ihre molekulare Struktur charakterisieren eine Herausforderung sein Lipoprotein Struktur, experimentell zu überprüfen.
Um Studien auf Lipoprotein Induktion der Host Immunantwort sowie die N-terminale Strukturaufklärung zu erleichtern, haben wir mehrere zuvor beschriebenen Protokolle um bakterielle Lipoproteine reinigen und Vorbereiten der N-terminalen tryptic angepasst Lipopeptide für die Analyse von MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteine sind angereichert mit einer etablierten Triton X-114 (im folgenden als Tensid oder TX-114 bezeichnet) Phase Partitionierung Methode, mit der Optimierung zu entfernen Verunreinigungen nicht-Lipoproteine und Lipoprotein Ertrag zu steigern. Diese Lipoproteine sind geeignet für den direkten Einsatz in TLR Tests oder für weitere Reinigung durch SDS-PAGE. Für MALDI-TOF MS Übertragung der Lipoproteine auf Nitrozellulose-Membran bietet ein Gerüst für die effiziente in Situ Trypsin-Verdauung waschen und anschließende Elution von der Membranoberfläche, was zu sehr gereinigt N-terminale Lipopeptide. Nitrozellulose nachweislich Probenbehandlung Erleichterung und Verbesserung des Sequenz-Abdeckung für stark hydrophobe Peptide aus integrale Membrane Proteine13,14, sowie Lipoproteine9,10 . Die Methode hat den zusätzlichen Vorteil der Fraktionierung Peptide basierend auf Polarität, so dass fortgeschrittene Waschlösungen für hohes Vertrauen Proteinidentifikation gleichzeitig mit N-terminale Strukturaufklärung in einem einzigen Experiment analysiert werden können . Dieses Protokoll eindeutig Merkmale vorsätzliche Natrium Addukt Bildung, übergeordnete Ion Fragmentierung in Richtung Dehydroalanyl-Ionen während MS/MS, Beihilfe bei der strukturellen Zuordnung des N- Acylation Staates zu fördern. Der N-Terminus ist variabel und wichtige Funktion im Zusammenhang mit TLR Anerkennung der Lipoproteine. Zusammengenommen hat dieses Protokoll auf Lipoproteine, mit den einzelnen Stufen der Reinigung und Strukturaufklärung von MALDI-TOF MS leicht angepasst, je nach Ziel des Experiments intensive und reproduzierbare Studien erlaubt.

<table><tbody><tr><td>Materials0,01</td> mm Zirkonoxid-/Silica-Kügelchen <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioSpec Products</td><td>110791012</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMD</td><td>AX0116-6</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0142-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Fluka Analytical</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT Nitrocellulose</td><td>PALL Life Sciences</td><td>66485</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Digest Standard</td><td>Protea</td><td>PS-204-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550025</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>EMD</td><td>WX0008-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP535-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsinprotease</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Acros Organics</td><td>161470100</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Macron Feinchemikalien</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-hydrochlorid (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93422</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (MS-Qualität)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNALyser</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Target</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Ausgestattet mit einem 355 nm frequenzverdreifachten Nd:YAG Smartbeam-II Laser</td></tr></tbody></table>

bereicherung der bakterielle lipoproteine und vorbereitung der n-terminalen lipopeptide strukturaufklärung durch massenspektrometrie

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Lipoproteine sind wichtige Bestandteile der bakteriellen Zellhülle und potente Aktivatoren der Säugetier-angeborenen Immunantwort. Trotz ihrer Bedeutung für Zellphysiologie und Immunologie bleibt noch viel um zu entdecken über neuartige Lipoprotein Formen, wie sie synthetisiert werden und die Wirkung der verschiedenen Formen auf wirtsimmunität. Um gründliche Studien über Lipoproteine zu ermöglichen, dieses Protokoll beschreibt eine Methode für bakterielle Lipoprotein Bereicherung und Vorbereitung der N-terminalen tryptic Lipopeptide für die Strukturaufklärung von Matrix-assisted Laser desorption ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS). Erweiterung auf einer etablierten Triton X-114 Phase Partitionierung Methode für die Extraktion von Lipoprotein und Anreicherung von der bakteriellen Zellmembran, das Protokoll enthält zusätzliche Schritte aus, um nicht-Lipoprotein Verunreinigungen, Lipoprotein Ertragssteigerung zu entfernen und Reinheit. Da Lipoproteine in Toll-Like-Rezeptor (TLR) Assays allgemein verwendet sind, ist es wichtig, zunächst die N-terminalen Struktur von MALDI-TOF MS. hierin charakterisieren, ein Verfahren vorgestellt, um konzentrierter hydrophobe Peptide in N-terminale angereichert zu isolieren Lipopeptide geeignet für die direkte Analyse von MALDI-TOF-MS/MS.-Lipoproteine, die von Sodium Dodecyl Sulfat Poly-Acrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt wurden auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, in Situ mit verdaut Trypsin, gegenüber dem Vorquartal um polare tryptic Peptide zu entfernen gewaschen und schließlich mit Chloroform-Methanol eluiert. Wenn in Verbindung mit MS mehr polare trypsiniert Peptide aus Waschlösungen, bietet diese Methode die Möglichkeit, sowohl das Lipoprotein zu identifizieren und zu charakterisieren seine N-Terminus in einem einzigen Experiment. Absichtliche Natrium Addukt Bildung können auch als Werkzeug eingesetzt werden, um mehr strukturell informative Fragmentierung Spektren zu fördern. Letztlich werden Bereicherung der Lipoproteine und Bestimmung ihrer N-terminale Strukturen umfangreichere Studien auf diese allgegenwärtige Klasse bakterielle Proteine erlauben.

Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt. Die Lipoprotein-angereicherten Bruchteil extrahiert von Enterococcus Faecalis ATCC 19433 von TX-114 ist in Abbildung 2dargestellt. Zum Vergleich zeigt sich auch das bandenmuster die ausgefällten Proteinfraktion. Proteine aus dieser Fraktion wurden von MALDI-MS zu sehr reichlich kontaminierende Proteine als Lipoproteine (Tabelle...

Die Anreicherung von bakterielle Lipoproteine mit einem nichtionischen Tensid Phase Partitionierung Methode wird für die direkte Verwendung in TLR-Tests oder andere Anwendungen beschrieben. Weitere Schritte sind detailliert, um strukturelle Charakterisierung N-terminalen tryptic Lipopeptide Vorbereitung durch Massenspektrometrie.

Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lipoproteine aus Bakterienzellen für direkte Anwendungen zu extrahieren und N-terminale Lipopeptide für die Strukturanalyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie weiter vorzubereiten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, da die N-terminale Struktur der Lipoproteine die Erkennung und Signalübertragung von Toll-like-Rezeptoren beeinflusst, was sich auf die Immunantwort des Wirts auswirkt. Der einzigartige Vorteil dieser Technik ist die fakultative, aber absichtliche Bildung von Natriumaddukten, die die Fragmentierung in Richtung des diagnostischen Dehydroalanyl-Ions fördern und die strukturelle Zuordnung des Acylierungszustands des Lipoproteins unterstützen.Züchten Sie Bakterien in 15 Millilitern tryptischer Sojabrühe oder ähnlichen Rich Media bis zur späten exponentiellen Phase. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie sie einmal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung EDTA oder TBSE. resuspendieren Sie die Zellen in 800 Mikrolitern TBSE mit einem millimolaren PMSF und 0,5 Milligramm pro Milliliter Lysozym.Füllen Sie die Lösung in ein 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrche

enrichment-bacterial-lipoproteins-preparation-n-terminal-lipopeptides

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Anreicherung bakterieller Lipoproteine und Präparation von N-terminalen Lipopeptiden zur Strukturbestimmung durch Massenspektrometrie. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Anreicherung von bakteriellen Lipoproteinen mit einem nichtionischen Detergens, das beim Erwärmen eine Phasentrennung erfährt. Durch sequentielle Temperaturverschiebungen und Zentrifugationsschritte werden Lipoproteine selektiv in die Detergenzphase aufgeteilt, während...

Anreicherung bakterieller Lipoproteine mittels nichtionischer Detergenzien-Phasentrennung

Isolierung und Charakterisierung der Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien gibt Einblick in Zelloberfläche basierend Mechanismen der Antibiotikaresistenz, bakterielle Überlebensrate und Fitness, und wie chemisch unterschiedlicher Lipid einer molekularen Spezies unterschiedlich modulieren Host angeborenen Immunantwort.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Viele vorhergesagte (Phospho)lipasen sind hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten und physiologischen Funktionen schlecht charakterisiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um die Enzymaktivitäten zu optimieren, nach natürlichen Substraten zu suchen und physiologische Funktionen für diese Enzyme vorzuschlagen.

Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Diese Methode bietet einen Rahmen für die Untersuchung der Einbeziehung von exogenen Fettsäuren aus komplexen Wirtsquellen in bakterielle Membranen, insbesondere Staphylococcus aureus. Um dies zu erreichen, werden Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb und anschließende Fettsäureprofilierung von bakteriellen Phospholipiden unter Verwendung der Massenspektrometrie beschrieben.

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Dieses Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Peptidoglykanzusammensetzung mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Verbindung mit fortschrittlicher Merkmalsextraktion und bioinformatischer Analysesoftware.

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Die auf Schrotflinten-Massenspektrometrie basierende Lipidomik liefert eine empfindliche quantitative Momentaufnahme eines breiten Spektrums von Lipidklassen gleichzeitig in einer einzigen Messung aus verschiedenen Nagetiergeweben.

Schrotflinten-Lipidomik von Nagetiergewebe

Lernen Sie die Extraktion bakterieller Lipoproteine mittels nichtionischer Tensid-Phasenpartitionierung zur Aufklärung der N-terminalen Struktur durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie.

Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal

Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

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