Metabolische Mapping: Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie die Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben zu bestimmen

Dieses Video zeigt, wie Sie ein metabolisches Mapping durchführen. Ein Verfahren zur Quantifizierung der Aktivität bestimmter Enzyme, die als Dehydrogenasen bezeichnet werden. Die Zellen haften an einem Mikroskopie-Objektträger oder einem gefrorenen Gewebe.

Vor Jahrzehnten haben wir eine ganze Reihe von metabolischen Kartierungstechniken entwickelt, die damals als Enzymistochemie bezeichnet wurden, um die Aktivität in Geweben und Zellen unter dem Mikroskop zu erkennen. Im Zuge der genetischen Revolution Ende des letzten Jahrhunderts wurde der Stoffwechsel jedoch obsolet. Doch jetzt läuft der Stoffwechsel wieder heiß.

Schauen Sie sich zum Beispiel die Krebszellen an. Der Stoffwechsel gilt nun als therapeutisches Ziel, und daher ist die Aktivitätsbestimmung in Zellen und Geweben wieder heiß. Eine Schlüsselkomponente des Reaktionspuffers ist Polyvinylalkohol (PVA).

Dieses ist in Phosphatpuffer in einer Konzentration von 18 % gelöst. PVA ist staubig und giftig, wenn es eingeatmet wird, also achten Sie darauf, PVA unter einem Abzug zu wiegen. Wegen der hohen PVA-Konzentration im Phosphatpuffer die Reaktionspufferflasche unter Rühren im Wasserbad erhitzen. Achten Sie darauf, den Verschluss locker auf die Flasche zu schrauben, da die Flasche sonst explodieren kann.

Es kann bis zu 15 Minuten dauern, bis das PVA vollständig im Phosphatpuffer gelöst ist. Wenn ja, sollte die Lösung transparent sein mit kleinen Luftblasen, die durch das Rühren entstanden sind. Die viskose PVA-Lösung kann mit einer breiten Pipette in ein Reaktionspufferröhrchen pipettiert werden.

Halten Sie die Röhren bei mindestens 40 Grad Celsius oder höher, um zu verhindern, dass sich das PVA verfestigt. Ein Milliliter PVA-Lösung reicht für etwa vier Zytospins oder zwei Gewebepräparate. Für die anderen Bestandteile des Reaktionspuffers wird das gelbe nitroblaue Tetrazoliumchlorid, auch NitroBT genannt, in einem Gemisch aus Ethanol und Dimethylformamid gelöst, während es in einem Glasfläschchen im Bunsenbrenner erhitzt wird.

Die Lösung sollte nicht zum Kochen kommen, da sonst das Volumen zu stark abnimmt. Lassen Sie das Fläschchen also nicht zu lange auf der Flamme und schütteln Sie es regelmäßig. Bewahren Sie es nach dem Auflösen auf Eis auf und fahren Sie schnell mit dem nächsten Schritt fort, da das gelöste NitroBT schnell verdirbt.

NitroBT ist ein gelbes Pulver, das auf dem Boden des Glasfläschchens liegt und Ethanol und DMF enthält, wenn es nicht aufgelöst aufbewahrt wird. Sie können alle paar Male überprüfen, ob das nitroBT aufgelöst ist. Die Lösung ist dann gelb transparent.

Wenn das NitroBT aufgelöst ist, kann es in die Fläschchen mit der PVA-Lösung pipettiert werden. Rühren Sie vorsichtig mit einem dünnen Löffel oder einem dünnen Spatel um, um das NitroBT und den Puffer zu vermischen. Führen Sie dies Schritt für Schritt für alle Komponenten des Reaktionspuffers durch, die in Tabelle eins des Volltextes aufgeführt sind.

Versuchen Sie, beim Einrühren der Reaktionskomponenten in die PVA-Lösung nicht zu viele Luftblasen zu bilden. Der Trick besteht darin, ständig zu rühren, ohne den Löffel oder Spatel aus der Lösung zu nehmen. Der Elektronenträger, Methoxyphenaziniummethylsulfat, soll zuletzt vor Licht geschützt und in den Reaktionspuffer aufgelöst werden.

Die rote Farbe des MPMS ist praktisch, um zu überprüfen, ob alle Komponenten korrekt aufgelöst sind. Während Sie den Reaktionspuffer vorbereiten und die Komponenten darin einrühren, erwärmen Sie die Objektträger 50 Minuten lang in einem Inkubator mit warmem Wasser. Halten Sie einen niedrigen Wasserstand in der Inkubationskammer.

Bei geschlossenem Deckel bleibt die Reaktionsumgebung feucht. Bei geöffnetem Deckel hält das Wasser die Objektträger auf einer warmen Temperatur. Tragen Sie den Reaktionspuffer mit einer Glaspipette auf die Zell- oder Gewebepräparate auf.

Machen Sie sich keine Sorgen über kleine Luftblasen, da diese zur Oberfläche strömen und die Reaktion in den Zellen oder Geweben nicht beeinträchtigen. Halten Sie den Deckel der Inkubationskammer während der Inkubationszeit geschlossen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Reaktion in einer feuchten Umgebung stattfindet, um ein Austrocknen des PVA-Puffers zu verhindern.

Die meisten Dehydrogenase-Reaktionen in metabolischen Kartierungsexperimenten finden bei 37 Grad Celsius statt. Inkubieren Sie die Objektträger für eine vorgegebene Zeitspanne im Reaktionspuffer, die in Tabelle eins des Volltextartikels zu finden ist. Man kann leicht erkennen, ob die Reaktion funktioniert hat oder nicht, da die Zellen oder das Gewebe aufgrund der Aktivität der Dehydrogenasen dunkelblau oder violett werden.

Daraus wird schließlich farbloses unlösliches NitroBT das dunkelblaue Formazol, das an der Stelle der Dehydrogenase-Aktivität ausfällt. Die enzymatische Reaktion wird in drei Schritten gestoppt. Zunächst soll das überschüssige Inkubationsmedium auf ein Gewebe abgeklopft werden.

Zweitens soll das Inkubationsmedium durch mechanisches Waschen in einem Phosphatpuffer mit einem PH-Wert von 5,3 bei 60 Grad Celsius von den Objektträgern abgewaschen werden. Drittens sind die Objektträger 20 Minuten lang in frischem Phosphatpuffer von PH 5,3 bei 60 Grad Celsius zu belassen. Viertens kann der Phosphatpuffer mit Leitungswasser und dann mit destilliertem Wasser abgespült werden.

Man kann gut sehen, wie sich der Reaktionspuffer löst. Der niedrige pH-Wert des Stopppuffers hilft dabei, die Dehydrogenase-Reaktion in den Zellen zu stoppen. Legen Sie die Objektträger ein- oder zweimal in einen neuen Stopppuffer, je nachdem, wie viele Objektträger Sie gleichzeitig verarbeiten.

Spülen Sie die Objektträger ebenfalls mit Leitungswasser ab und schließen Sie sie mit destilliertem Wasser ab. Nun können die Dias auf einem Diawärmer getrocknet und eingehaust werden. Trocknen Sie die Rückseite der Rutsche vorsichtig ab, wischen Sie sie ab und legen Sie sie auf einen auf 50 bis 60 Grad Celsius vorgeheizten Objektträgerwärmer.

Wenn die Objektträger trocken sind, können eine Glyceringlycerin-Glycerin-Lösung und Deckgläser verwendet werden, um die Objektträger zu umschließen und zu konservieren. Bewahren Sie die Dias im Kühlschrank auf, bis Sie mit der Bildaufnahme fortfahren. Dabei handelt es sich um eine farbige Mikroaufnahme eines repräsentativen Gewebeschnitts auf einem Objektträger, der in dem in diesem Video gezeigten Experiment bearbeitet wurde.

Hierbei handelt es sich um einen Glioblastom-Schnitt und Lepto-Dehydrogenase ist das Enzym, das untersucht wurde. Jede Dehydrogenase produziert die Einheit PH und jedes Molekül der Einheit PH wandelt ein Molekül von NitroBT, dem gelben Tetrazoliumsalz, in ein Molekül von Formazol um, dem violetten Niederschlag, der in diesem Bild gezeigt wird. Man kann eine hohe intrazelluläre Aktivität der Laktatdehydrogenase in den dunkelviolett dargestellten Tumorzellen sehen.

Die Blutgefäße sind weniger aktiv und weiß. Dabei handelt es sich um ein monochromatisches Bild desselben Bereichs der Folie. Dies kann verwendet werden, um die Enzymaktivität zu quantifizieren, wie im Protokoll beschrieben.

Je mehr Formazan produziert wird, desto dunkler ist das Pixel und desto höher ist die Absorption. Die Absorption kann dann in Picomole der Entität ph umgewandelt werden, die erzeugt wurden. Das metabolische Mapping ist also einfach durchzuführen.

Es ist sehr schnell und es ist billig. Nutzen Sie es also in Ihrer Forschung.