Name: CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Erfahren Sie die CRISPR/Cas9-vermittelte HMEJ-Strategie für gezielte DNA-Integration in vivo. Diese Methode ermöglicht effiziente Korrektur von Genmutationen mit therapeutischem Potenzial für Gentherapie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch CAS strategische Priorität Research Program (XDB02050007, XDA01010409), der nationalen Hightech-R & D-Programm (863 Programm; 2015AA020307), der National Natural Science Foundation of China (NSFC Zuschüsse, 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China Youth tausend Talente Programm (HY), Pause durch Projekt der chinesischen Akademie der Wissenschaften, Projekt Shanghai City Committee von Wissenschaft und Technik (16JC1420202, HY), das Ministerium of Science and Technology of China (die meisten; 2016YFA0100500).

Alle Verfahren einschließlich tierische Themen wurden von der biomedizinischen Forschung-Ethik-Kommission der Shanghai Institute für biologische Wissenschaften (CAS) genehmigt.
1. Aufbau des Spenders Plasmide
<ol><li>
Auswahl des sgRNA
	<ol>
<li>Verwenden Sie Online-CRISPR-Design-Tools SgRNAs am Ziel Region11,12,13,14,15vorherzusagen. Design für die Cdx2 Locus, sechs verschiedene SgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) um die Haltestelle Codon mit höheren Rang und niedrigeren Potential aus-Ziele (Abb. 1A)16.</li>
		<li>Linearisieren Sie 2 µg Cas9-CMV-EGFP Expressionsvektoren und SgRNA durch BbsI Verdauung (1 µL der BbsI für 2 h bei 37 ° C auf eine Endkonzentration von 1 U/µL in einem Volumen von 20 µL). Dann reinigen Sie das Produkt durch Gel-Reinigung-Kit mit einem 1 % Agarose-Gel in 1 x TAE-Puffer.</li>
		<li>Die Oligo-Lösung mit einem Temperaturgradienten von 95 ° C bis 25 ° C mit einer Änderungsrate der Temperatur von 5 ° C/5 min (95 ° C für 5 min inkubieren Sie Mix ein paar SgRNA Oligonukleotide in 10 µL 1 × T4 DNA-Ligase Puffer, eine Endkonzentration von 50 µM. dann 90 ° C für 5 min, 85 ° C für 5 min, etc..), die wird die Oligos Tempern.</li>
		<li>Mix 4 µL Produkt, 2 µL der linearisierten Vektor mit 1 µL T4 DNA-Ligase in 10 µL 1 × T4 DNA-Ligase Puffer, geglüht und dann bei 22 ° C für 1-2 h (Abbildung 1B) verbinden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Landvermesser Nuklease-Test von sgRNA Hinweis: Die targeting Effizienz der SgRNA für die Knock-in-Experiment verwendet wird ausgewertet, indem Surveyor Nuclease Assay (auch bekannt als T7 Endonuklease ich (T7EI) assay)17. Wählen Sie die SgRNA mit hoher DNA Spaltung Effizienz und einen geringen Abstand zwischen Ortsbild SgRNA schneiden und das Stopp-Codon.<ol>
<li>Cas9-SgRNA-EGFP Expressionsvektoren in N2a Zelllinien transfizieren kultiviert in DMEM mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt, 1 % PSG und 1 % nicht-essentielle Aminosäure durch die Transfektion kit (siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 ° C in 5 % CO2.</li>
		<li>Nach 48 h Inkubation, sammeln Sie 5.000 transfizierte Zellen (GFP+) durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Verwendung nicht transfizierten Zellen als ein Steuerelement.</li>
		<li>Die gesammelten Zellen in 2 bis 5 µL Oflysis-Puffer (0,1 % Triton x-100, 0,1 % Tween 20 und 100 µg/mL Proteinase K) bei 56 ° C für 30 min zu verdauen, und dann Hitze inaktivieren Proteinase K bei 95 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Die Probe von verschachtelten PCR (Tabelle 1) mit der Hersteller-Protokoll zu verstärken. Die Größe der PCR-Produkte wird auf 300-500 bp festgelegt.<ol>
<li>Mix 1 µL Lyse Produkt mit DNA-Polymerase und ein paar von äußeren Primern erkennen die Sequenz auf dem SgRNA-Ziel-Gelände (0,1 µM, Endkonzentration) (Tabelle 1), und führen Sie die primäre PCR in einem Volumen von 20 µL.</li>
			<li>DNA-Polymerase bei 95 ° C für 5 min zu aktivieren, und führen Sie die primäre PCR für 30 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 24 s (1 min/1 kb), mit der letzten Erweiterung bei 72 ° C für 5 Minuten.</li>
			<li>Führen Sie die sekundäre PCR mit 1 µL des primären PCR-Produkt und ein paar verschachtelte innere Primer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Denaturieren und Tempern wieder 300-600 ng des gereinigten PCR-Produkt in 20 µL 1 × T7EI Reaktion Puffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7,9) mit einem Gefälle von Temperatur von 95 ° C bis 25 ° C mit einer Rate von 5 ° C/5 min.</li>
		<li>Die geglühten PCR-Produkte und Digest bei 37 ° C für 2 h 1 µL T7EI Enzym hinzufügen. Führen Sie dann die Verdauung Produkt auf 2 % Agarose-Gel in 1 × TAE Puffer bei 120 V 40 min, bis die Fragmente getrennt sind (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Verwenden Sie ImageJ um die Band-Intensitäten von Schnitt und ungeschnitten DNA zu bestimmen. Berechnen Sie die Indel Frequenz mit den Methoden wie zuvor9 (Abbildung 1C) berichtet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bau des Spenders Vektor Hinweis: Um HMEJ Spender Vektoren für Cdx2 gen zu erzeugen, konstruieren einen Spender DNA (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) flankiert mit 23 nt Cdx2-SgRNAs targeting-Sequenz an beiden Enden (Abbildung 1D und Abbildung 1E). Die PAM Zielsequenz grenzte an das Ende der homologen Arm. Gibson Montage empfiehlt sich für HMEJ Spender Klonen.<ol>
<li>Verstärken Sie die 800 bp linken Homologie Arm (HAL) mit forward Primer-1F (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von Vector, 23 nt Cdx2-SgRNA-targeting-Sequenz und etwa 20 nt-Sequenz von HAL) und reverse Primer-1R (mit 15-20 bp Überlappung Sequenz von p2A-mCherry und etwa 20 nt-Sequenz von HAL) bei 0,1 µM Endkonzentration mit Maus genomischer DNA bei 200 ng/µL (Abbildung 1D, Tabelle 1).</li>
		<li>Verstärken die p2A-mCherry Einfügung Fragment mit forward Primer-2F (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von HAL und etwa 20 nt-Sequenz aus Einfügung Fragment) und reverse Primer-2R (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von HAR und etwa 20 nt-Sequenz aus Das Fragment einfügen) bei 0,1 µM Endkonzentration mit genomische DNA oder Plasmid mit Reporter Sequenzen bei 100 ng/µL oder 30 ng/µL (Abbildung 1D, Tabelle 1).</li>
		<li>Verstärken der 800 bp richtige Homologie Arm (HAR) mit forward Primer-3F (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von Vector, 23 nt Cdx2-SgRNA-targeting-Sequenz und etwa 20 nt-Sequenz von HAR) und reverse Primer-3R (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von p2A-mCherry und etwa 20 nt-Sequenz von HAR) bei 0,1 µM Endkonzentration mit Maus genomischer DNA bei 200 ng/µL (Abbildung 1D, Tabelle 1).</li>
		<li>Laufen Sie die PCR-Produkte auf 1 % Agarosegel auf 1 x TAE-Puffer, und reinigen Sie die PCR-Produkte der erwarteten Größe Gel Extraction Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 1).</li>
		<li>50-100 ng eines Vektors Konstrukt mit KpnI und XbaI zu verdauen. Mix 2 µL der linearisierten Vektor auf 30-40 ng/µL mit drei PCR verstärkt Fragmente (1 µL für jedes, 100-200 ng/µL) 2 x Gibson Mischung. Fügen Sie H2O um die letzte Lautstärke auf 10 µL.Incubate die Mischung bei 50 ° C für 60 min hinzu.</li>
		<li>Verwandeln Sie kompetente E. Coli Zellen mit dem montierten Produkt und Extrakt das Plasmid DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers baut. Überprüfen des HMEJ Spenders durch DNA-Sequenzierung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Genom-Bearbeitung in Mausembryonen mithilfe der HMEJ-basierte Methode
<ol><li>
Produktion von Cas9 mRNA
	<ol>
<li>Vorbereitung der Cas9 mRNA fügen Sie T7 Promotorsequenz, der Cas9 Region durch PCR-Amplifikation mit der entsprechenden Primerpaar in Tabelle 1aufgeführten Codierung hinzu. Fügen Sie den Primer Cas9 F/R auf eine Endkonzentration von 0,1 µM und 20 ng des Cas9 mit dem Ausdruck Vektor 1 × High Fidelity DNA-Polymerase Mischung. Die letzte Lautstärke zu 50 µL mit H2O.</li>
		<li>DNA-Polymerase bei 95 ° C für 5 min zu aktivieren, und führen Sie die PCR für 36 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 68 ° C für 4 min (1 min/1 kb), mit der letzten Erweiterung bei 68 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>T7-Cas9 PCR-Produkt für in-vitro- Transkription (IVT) zu reinigen, und dann transkribieren 0,5-1 µg DNA mRNA-Transkription-Kit bei 37 ° C für 8 h in einem Gesamtvolumen von 20 µL, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Die Mischung der DNA Schablone bei 37 ° C für 15 min. Add ein Poly-A-Endstück für 45 min bei 37 ° C zu entfernen und Wiederherstellen der Cas9 mRNA durch RNA-Reinigung-Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers 1 µL DNase hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Herstellung von sgRNA
	<ol>
<li>Angetrieben von einem T7 Promotor mit High-Fidelity-DNA-Polymerase als oben SgRNA-Vorlage generieren. Wählen Sie ein SgRNA Gerüst mit Vektor als Vorlage. Die Primer verwendet, sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
		<li>Reinigen der T7-SgRNA PCR-Produkt und verwenden Sie 0,5-1 µg DNA als Vorlage für in-vitro- Transkription von SgRNA mit einem kurzen RNA Transkription-Kit bei 37 ° C für 6 Stunden in einem Gesamtvolumen von 20 µL, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien < / c11 >).</li>
		<li>1 µL DNase zur Mischung hinzugeben und weiter die Inkubation bei 37 ° C für 15 min, die DNA-Vorlage zu entfernen. Reinigen Sie die SgRNAs durch RNA-Reinigung-Kit, wie oben (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Die SgRNA um 500 ng/µL RNase-freies Wasser zu verdünnen und die Proben bei −80 ° C bis zu 3 Monate lang zu speichern. Hinweis: CRISPR Ribonucleoproteins (RNPs) sind eine alternative Substitution mit besser schneiden Effizienz18,19,20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryo-Sammlung, Mikroinjektion und in-vitro- Kultur
	<ol>
<li>Superovulate weibliche B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) Mäusen (ca. 7-8 Wochen alt) von trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG), gefolgt von humanes Choriongonadotropin (hCG) 48 h später. Nach der hCG-Injektion Übernachtung Haus Frauen mit B6D2F1 Männchen.</li>
		<li>Die Weibchen durch CO2 Narkose, 24 Stunden nach der hCG-Injektion zu opfern. Sammeln Sie die befruchteten Embryonen aus ihrer Eileiter (mit 30-50 Embryonen für jedes Weibchen) in M2 Medium.</li>
		<li>Ort der befruchteten Embryonen (ca. 300 Eiern für Tages-Injektion) in KSOM Medium (5,55 g/L NaCl, 0,19 g/L KCl, 0,05 g/L KH2PO4, 0,05 g/L MgSO4•7H2O, 0,04 g/L Glukose, 1,12 g/L Natrium Laktat, 2,1 g/L Nahco33 , 0,02 g/L Natrium Pyruvat, 0,25 g/L CaCl2•2H2O 0,004 g/L EDTA, 0,146 g/L L-Glutamin und 1 g/L Rinderserumalbumin) bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2.</li>
		<li>Mix Cas9 mRNA (100 ng/µL), SgRNA (50 ng/µL), HMEJ Spender Vektor (100 ng/µL) und H2O die letzte Lautstärke auf 10 µL. setzen Sie die Mischung auf dem Eis hinzufügen.</li>
		<li>Kapillare Nadeln (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,78 mm mit Filament) ziehen mit einer Mikropipette Abzieher (Parameter: Wärme, 74, ziehen, 60, Geschwindigkeit, 80; Zeitverzögerung/200, Druck, 300. Siehe Tabelle der Materialien). Kommerzielle Nadeln wäre eine alternative Ersatz für die Mikroinjektion.</li>
		<li>Injizieren eine wahrscheinliche Volumen der Mischung in das Zytoplasma der Zygoten mit klar definierten Vorkerne in ein Tröpfchen HEPES-CZB Medium mit 5 µg/mL Cytochalasin B mit Hilfe eines Microinjector mit konstanten flow-Einstellungen (Abb. 2A) (siehe Tabelle der Materialien)21. Hinweis: Jede Gruppe von Zygoten injiziert werden sollten innerhalb von 20-30 min. Cytochalasin B könnte die Lebensfähigkeit der Maus Zygote nach der Injektion zu erhöhen. Mikroinjektion kann alternativ mit dem Piezo-System betrieben werden, wie zuvor beschrieben,22.</li>
		<li>Kultur der injizierten Zygoten in KSOM-Medium bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 bis Blastozyste Bühne nach 3,5 Tagen für Fluoreszenz-Beobachtung (Abbildungen 2 b und 2C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryo-Transfer und Generierung von Mäusen
	<ol>
<li>Mate estrous ICR weibliche Mäuse mit vasektomierten ICR männliche Mäuse am selben Tag als Injektion.</li>
		<li>Kultur der injizierten Zygoten in das 2-Zell-Stadium bei 37 ° C unter 5 % CO2und Transfer 25-30 2-Zellen Embryonen in den Eileiter pseudopregnant ICR-Weibchen bei 0,5 Tag Post Coitum (Dpc). Empfängers Mütter liefern Welpen zu 19,5 Dpc.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maus-Genotypisierung
	<ol>
<li>Extrahieren Sie Maus genomischer DNA aus Zehe oder Schweif Proben mit einem DNA-Extraktion-Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Identifizieren der 5' und 3' Kreuzung von Knock-in Veranstaltungen mit 200-400 ng genomic DNA als Vorlage durch UV/Vis-Spektrometrie gemessen, die PCR Lautverstärkung durchzuführen.<ol>
<li>DNA-Polymerase bei 95 ° C für 5 min zu aktivieren, und führen Sie die PCR für 38 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min (1 min/1 kb), mit der letzten Erweiterung bei 72 ° C für 10 Minuten. Verwenden Sie für die 5' Kreuzung die forward Primer auf den vorgelagerten HAL, mit der Rückseite auf die Knock-in-Fragment (p2A-mCherry). 3' Kreuzung nutzen Sie die vorwärts Grundierung auf die Knock-in-Fragment (p2A-mCherry), mit der Rückseite eines auf die nachgelagerten HAR (Tabelle 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>6 µL des PCR Produktes auf 1 % Agarose-Gel auf 1 x TAE-Puffer und prüfen, ob die erwarteten Fragmentgröße ausgeführt. Dann überprüfen sie durch DNA-Sequenzierung (Abbildung 2D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HMEJ-basierte In-Vivo Genom Bearbeitung in Hepatozyten
<ol><li>Empfängers C57BL/6J Maus (8 Wochen) in eine Haltevorrichtung legen Sie und das Ende durch den Schlitz.</li>
	<li>Mischen Sie HMEJ Spender Vektoren (30 µg) und spCas9 Expressionsvektoren (30 µg) in 2 mL Kochsalzlösung. Auszusetzen Sie für das Kontrollexperiment HMEJ Spender Vektoren (30 µg) in 2 mL Kochsalzlösung(Abbildung 3).</li>
	<li>Reinigen Sie die Maus-Rute mit 70 % Ethanol. Setzen Sie die Nadel in das Heck Vene und injizieren die Plasmid-DNA-Lösung innerhalb von 5-7 s. die Nadel entfernen und lassen Sie die Maustaste aus der Haltevorrichtung.</li>
	<li>Opfern Sie Mäuse durch CO2 Narkose nach 5-9 Tage nach der Injektion. Die Mäuse Transcardially mit 0,9 % Kochsalzlösung durchspülen, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd mittels einer peristaltischen Pumpe und beheben die Leber über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Das Gewebe mit 30 % Saccharose über Nacht, bis es auf den Boden des Rohres sinkt zu entwässern.</li>
	<li>Abschnitt des gefrorenen Gewebes bei einer Dicke von 10 µm für Leber Proben.</li>
	<li>Spülen Sie die Abschnitte dreimal in 0,1 M Phosphat gepuffert (PB) und inkubieren sie mit primären Antikörper: Kaninchen-Anti-mCherry (in 5 % verdünnt NGS) über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie Abschnitte dreimal in PB und inkubieren sie dann mit Sekundärantikörper: Cy3-AffiniPure Ziege IgG Anti-Kaninchen für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler.</li>
	<li>Gegenfärbung die Abschnitte mit DAPI für 20 min und Mount mit Glycerin auf Objektträgern für weitere Fluoreszenz Beobachtungen (Abbildung 3B).</li>
</ol>

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<li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li>
<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die wichtigsten Schritte beim Bau von HMEJ Spender Plasmide sind: (1) Wahl des SgRNA mit hoher DNA Spaltung Effizienz und geringe Abstand zwischen SgRNA schneiden Website und Stopp-Codon und (2) die ordnungsgemäße Errichtung der HMEJ Spender. CRISPR/Cas9-vermittelte Spaltung auf beide Transgen-Spender-Vektor (mit SgRNA-Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Arme) und gezielte Genom ist notwendig für eine effiziente und präzise gezielte Integration in-vivo. Die wichtigsten Schritte der Generation von Knock-in Mäusen m...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Präzise, gezielte Genom-Bearbeitung ist oft für die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodellen und klinischen Therapien erforderlich. Viel Anstrengungen unternommen worden, um verschiedene Strategien für effiziente zielgerichtete Genom bearbeiten, wie z. B. Zink Nuklease (ZFN), Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) und CRISPR/Cas9 Systeme. Diese Strategien gezielte DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) im Genom zu erstellen und profitieren Sie von inneren DNA-Reparatursysteme, wie homologe Rekombination (HR)1,2, Microhomology-vermittelte Ende verbinden (MMEJ)3 , 4 , 5und nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)6,7,8 , gezielte Integration der transgene1,9zu induzieren. Die HR-Strategie ist derzeit die am häufigsten verwendeten Genom Bearbeitung Ansatz, der in Zell-Linien sehr effizient, aber nicht teilenden Zellen aufgrund seines beschränkten Auftretens in der Spätphase der S/G2 nicht ohne weiteres zugänglich ist. Der HR-Strategie gilt somit nicht für in Vivo Genom-Bearbeitung. Vor kurzem wurde die Grundstrategie des NHEJ für effiziente gen-Knock-in Maus Gewebe8entwickelt. Dennoch stellt die NHEJ-basierte Methode in der Regel Indels an den Verbindungsstellen, macht es schwierig, präzise Genom-Bearbeitung, vor allem wenn Sie versuchen, im Rahmen Fusion Gene8konstruieren zu generieren. MMEJ-basierte gezielte Integration ist in der Lage, präzise Genom-Bearbeitung. Es erhöht jedoch nur in bescheidenem Maße die gezielte Integration Effizienz in vorherigen Berichten5. Verbesserung der Effizienz der präzise gezielte Integration in Vivo ist daher für breite therapeutische Anwendungen3dringend erforderlich.
In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit zeigten wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie, die die höchste Effizienz der gezielte Integration in alle gemeldeten Strategien sowohl in Vitro und in Vivo10zeigte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung des HMEJ Systems, und auch der Bau der Einzel-Guide RNA (SgRNA) Vektoren gezielt das gen des Interesses und des Spenders Vektoren beherbergen SgRNA Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Wappen (Abbildung 1) . In diesem Protokoll erläutern wir im folgenden die einzelnen Schritte zur Erzeugung von DNA-Knock-in Mäusen und kurze Schritte für die gezielte Integration in Geweben in Vivo. Darüber hinaus zeigte eine Proof-of-Concept-Studie über die HMEJ-basierte Strategie seine Fähigkeit, Fah Mutation zu korrigieren und Fah- / - Leber Versagen Mäuse, die weiter seine therapeutische Potenzial offenbart zu retten.

<table><tbody><tr><td>pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Vektor</td><td>Addgene</td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td><td>AAV-Vektor zur Kodierung eines humanen Codon-optimierten SpCas9, angetrieben durch EFs-Promotor</td></tr><tr><td>AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td><td>Addgene</td><td>97308</td><td>HMEJ-Donor für die Fusion eines p2A-mCherry-Reporters mit Maus-Actb. EGFP, angetrieben durch EF1a-Promotor und U6-getriebene sgRNAs, die auf Actb abzielen. AAV-Rückgrat.</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 HMEJ-Spender</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>HMEJ-Spender für die Fusion eines p2A-mCherry-Reporters mit Maus-Cdx2.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagenz</td><td>Life Technology</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonuklease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid EndoFree-Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Braun Mikropipetten-Abzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>&nbsp; Mikropipettenabzieher (Parameter: Wärme, 74; Zug, 60; Geschwindigkeit, 80; Zeit/Verzögerung, 200; Druck, 300)</td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-78-10</td><td>Art von Kapillaren (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,78 mm mit Filament)&nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet Mikroinjektor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefriermikrotom</td><td>Leica</td><td>CM1950-Kryostat</td><td>Dicke&nbsp; von&nbsp; 40&nbsp; &mu; M&nbsp; für&nbsp; Gehirn,&nbsp; 10 &mu; M&nbsp; für&nbsp; Leber</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-mCherry</td><td>GeneTex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Jackson Immunforschung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen, Strepto, Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Ningbo Sansheng Medizin</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Ningbo Sansheng Medizin</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>CAT#C6762</td><td></td></tr><tr><td>KSOM+AA mit D-Glukose und Phenolrot</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium mit Phenolrot</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9-vermittelten gezielte integration in vivo mit einer homologie-vermittelte ende verbinden-basierte strategie

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Als eine viel versprechende Genom-editing-Plattform hat das CRISPR/Cas9 System großes Potential für effiziente Genmanipulation, vor allem für die gezielte Integration von transgenen. Aufgrund der geringen Effizienz der homologen Rekombination (HR) und verschiedenen Indel Mutationen von nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)-basierte Strategien in nicht-teilenden Zellen, in Vivo Genom Bearbeitung bleibt eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basiertes CRISPR/Cas9 System zur effizienten in Vivo präzise gezielte Integration. In diesem System, das gezielte Genom und der Spender Vektor mit Homologie Arme (~ 800 bp) flankiert von einzelnen Guide RNA (SgRNA) Ziel Sequenzen sind durch CRISPR/Cas9 gespalten. Diese HMEJ-basierte Strategie erzielt effiziente Transgen Integration in Maus Zygoten sowie in Hepatozyten in Vivo. Darüber hinaus eine HMEJ-basierte Strategie bietet einen effizienten Ansatz zur Korrektur von Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Mutation in den Hepatozyten und rettet Fah-Mangel induziert Leberversagen Mäuse. Zusammen genommen, mit Schwerpunkt auf Integration ausgerichtet, diese HMEJ-basierte Strategie bietet ein viel versprechendes Instrument für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodelle und gezielte Gentherapien.

HMEJ-basierte Genom-Bearbeitung in Mausembryonen: Um die Effizienz Knock-in der HMEJ-basierte Methode Maus Zygoten definieren, lieferten wir Cas9 mRNA, SgRNA gezielt das Gen Cdx2 und der HMEJ Spender in Maus Zygoten, die entworfen wurde, um ein Reportergen p2A-mCherry zu den letzten Codon Cdx2 Sicherung gen (Abbildung 2A). Die injizierten Zygoten entwickelte sich zu Blastozysten in der Kultur. Um die Knock-i...

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Das übergeordnete Ziel dieser HMEJ-Strategie ist es, ein vielversprechendes genetisches Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungen bereitzustellen, einschließlich der Generierung gentechnisch veränderter Tiermodelle und gezielter Gentherapien. Dieses HMEJ hat die Maßnahme bestanden. Kann auch Schlüsselfragen im genetischen und im neurologischen Bereich haben.Zum Beispiel, wie die Effizienz der präzisen, gezielten Integration von Transgenen in vivo verbessert werden kann. Der Hauptvorteil dieser HMEJ-basierten Strategie ist die Fähigkeit, Genmutationen mit hoher Effizienz in vivo zu korrigieren. Was folgte, hat therapeutisches Potenzial.Xing Wang, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Zu Beginn des Protokolls werden 5000 N2a-Zellen gesammelt, die zuvor mit Cas9 sgRNA EGFP-Expressionsvektoren durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder FACS transfiziert wurden, wobei nicht transfizierte Zellen als Kontrolle verwendet werden. Verdauen Sie die gesammelten Zellen in 2 bis 5 Mikrolitern Lysepuffer bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten.Anschließend erhitzen und aktivieren Sie die Proteinase K bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Amplifizieren Sie die Probe durch Nested PCR unter Verwendung des Herstellerprotokolls. Mischen Sie einen Mikroliter des Lyseprodukts mit DNA-Polymerase und einem Paar äußerer Primer, wobei die Sequenz um die sgRNA-Zielstelle erkannt wird, und führen Sie die primäre PCR in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern durch.Aktivieren Sie anschließend die DNA-Polymerase bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten und führen Sie dann die primäre PCR mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 Grad Celsius für 5 Minuten durch. Führen Sie die Sekundär-PCR mit einem Mikroliter Primär-PCR-Produkt und einem Paar verschachtelter Innenprimer durch. Denaturierung und erneutes Glühen von 300-600 Nanogramm des gereinigten PCR-Produkts in 20 Mikrolitern 1x TC7EI-Reaktionspuffer.Geben Sie einen Mikroliter T7EI-Enzym zu den geglühten PCR-Produkten und verdauen Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend wird das Aufschlussprodukt auf 2%Agarose-Gel und 1x TAE-Puffer bei 120 Volt für 40 Minuten laufen lassen, bis die Fragmente getrennt sind. Verwenden Sie ImageJ, um die Bandenintensitäten von geschnittener und ungeschnittener DNA zu bestimmen und die Indelfrequenz zu berechnen.Für die Cas9-mRNA-Präparation fügen Sie die T7-Promotorsequenz durch PCR-Amplifikation zur Cas9-kodierenden Region hinzu. Als nächstes fügen Sie den Primer Cas9 FR in einer Endkonzentration von 0,1 Mikromolar und 20 Nanogramm Cas9-Expressionsvektor zum 1x High-Fidelity-DNA-Polymerase-Mix hinzu. Stellen Sie das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 50 Mikroliter ein.Aktivieren Sie die DNA-Polymerase bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten und führen Sie die PCR durch. Reinigen Sie das T7-, Cas9- und PCR-Produkt für die In-vitro-Transkription (IVT). Transkribieren Sie dann 0,5 bis 1 Mikrogramm DNA mit einem mRNA-Transkriptionskit bei 37 Grad Celsius für 8 Stunden in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern.Fügen Sie der Mischung 1 Mikroliter DNase hinzu, um die DNA-Vorlage 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius zu entfernen. Nachdem Sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius einen Poly(A)schwanz hinzugefügt haben, gewinnen Sie die Cas9-mRNA mit einem RNA-Aufreinigungskit zurück. Generieren Sie das sgRNA-Template, das von einem T7-Promotor mit DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit gesteuert wird, wie im vorherigen Abschnitt durchgeführt, und wählen Sie ein sgRNA-Gerüst mit Vektor als Template.Nach der Aufreinigung des T7-sgRNA-PCR-Produkts verwenden Sie 0,5 bis 1 Mikrogramm DNA als Vorlage für die In-vitro-Transkription von sgRNA unter Verwendung eines kurzen RNA-Transkriptionskits bei 37 Grad Celsius für 6 Stunden in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Nach 6 Stunden Inkubation fügen Sie der Mischung 1 Mikroliter DNase hinzu und setzen Sie die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten fort, um die DNA-Vorlage zu entfernen. Aufreinigung von sgRNAs erneut mit dem RNA-Aufreinigungskit.Verdünnen Sie die sgRNA auf 500 Nanogramm pro Mikroliter in RNase-freiem Wasser und lagern Sie die Proben bis zu drei Monate bei minus 80 Grad Celsius. Eine hohe Qualität der Cas9-mRNA und sgRNA ohne Degeneration und die korrekte Linie der HMEJ-Donorparameter sind die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von Knock-in-Mäusen. Legen Sie die befruchteten Embryonen in KSOM-Medium bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator mit 5% Kohlendioxid.Mischen Sie 100 Nanogramm pro Mikroliter Cas9-mRNA, 50 Nanogramm pro Mikroliter sgRNA und 100 Nanogramm pro Mikroliter HMEJ-Donorvektor und fügen Sie Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 10 Mikroliter einzustellen. Pipettieren Sie die Mischung auf und ab und legen Sie sie auf Eis. Ziehen Sie anschließend die Kapillarnadeln mit einem Mikropipettenabzieher.Injizieren Sie ein wahrscheinliches Volumen des Gemisches in das Zytoplasma von Zygoten mit gut definierten Vorkernen in einem Tröpfchen HEPES-CZB-Medium, das 5 Mikrogramm pro Milliliter Cytochalasin B enthält, unter Verwendung eines Mikroinjektors mit konstanten Flusseinstellungen. Zum Schluss kultivieren Sie die injizierten Zygoten in KSOM-Medium bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid bis zum Blastozystenstadium nach 3 1/2 Tagen zur Fluoreszenzbeobachtung. Nach 3-tägiger Injektion waren 12,9 % der Blastozysten, die HMEJ-Spender erhielten, positiv für mCherry, das ausschließlich im Trophektoderm exprimiert wurde.Bei der Sequenzierung der PCR-positiven Mäuse handelte es sich bei allen untersuchten Integrationsereignissen um präzise In-Frame-Integrationen sowohl an 5 Prime- als auch an 3 Prime-Übergängen. Nach 7-tägiger Injektion zeigten Immunfluoreszenzbilder, dass fast die Hälfte der transfizierten Hepatozyten mCherry exprimierte, wie es auf den Leberschnitten gefärbt wurde. Nach dem Absetzen von NTBC zeigte die immunhistochemische Leberfärbung von Fah-korrigierten Hepatozyten von Fah-negativen Mäusen, die Fah-HMEJ- und Cas9-Konstrukte erhielten, eine effektivere Proliferation als die MMEJ-basierte Methode.Die HMEJ-basierte Strategie könnte eine ideale Plattform sein, um mutierte Sequenzen, wie z. B. einen Teil der Mutation, durch die richtige zu ersetzen. Dies gilt nicht für eine HHEJ-basierte Methode. Nach diesem Experiment ebnet diese Therapie den Weg für Forscher in ein Feld, in dem eine präzise Zielintegration zur Erforschung breiter Therapieanwendungen möglich ist.

crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In diesem Video demonstrieren wir die All-in-One-CRISPR-Cas9-basierte Genomeditierung in kultivierten Zellen, bei der Cas9 und sgRNA den Zellen als ein einziges Plasmidkonstrukt zur Verfügung gestellt werden. Das CRISPR-Cas9-System und das gewünschte einzubringende Gen wurden durch Elektroporationstechnik in die Zellen eingeführt, um eine erfolgreiche Geneditierung zu ermöglichen.

All-in-One-CRISPR-Genom-Editing: Eine Methode für den homologiegesteuerten reparaturbasierten Gen-Knock-in in kultivierten Zellen mit dem CRISPR-Cas9-System

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow eines CRISPR/Cas9-basierte Gens editing-System für die Reparatur von Punktmutationen in Säugetierzellen. Hier verwenden wir einen kombinatorischen Ansatz zur gen Bearbeitung mit einer detaillierten Follow-on experimentelle Strategie zur Messung von Indel Bildung an die Ziel-Site-Analyse im Wesentlichen vor-Ort-Mutagenese.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Diese Arbeit liefert ein systematisch optimiertes Verfahren zur CRISPR/Cas9-Ribonuklease-basierten Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten sowie eine detaillierte Methode zur Kryokonservierung und Reanimation der Heuschreckeneier.

Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

Ein wesentliches Hindernis für Technologien wie CRISPR sind die Off-Target-Ereignisse, die lebenswichtige Gene stören können. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) ist eine Technik zur Identifizierung unbeabsichtigter Spaltstellen. Diese Methode bildet die genomweite Aktivität von CRISPR-Cas9 mit hoher Sensitivität und ohne Verzerrung ab.

CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Erfahren Sie die CRISPR/Cas9-vermittelte HMEJ-Strategie für gezielte DNA-Integration in vivo. Diese Methode ermöglicht effiziente Korrektur von Genmutationen mit therapeutischem Potenzial für Gentherapie.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

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