Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

Das übergeordnete Ziel dieser Hochdurchsatz-16S-rRNA-Amplikon-Sequenzierung ist es, die globale Mikrobiomzusammensetzung anhand von Stuhlproben zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur globalen mikrobiellen Zusammensetzung zu beantworten, die mit vielen Interessengebieten wie Stoffwechsel, Verdauung, Darm und systemischen Entzündungen verbunden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Zählung der aeroben und anaeroben mikrobiellen Gemeinschaften ermöglicht, die in der Stuhlprobe vorhanden sind, einschließlich der Bakterien, die schwer zu kultivieren sind.

Diese Methode kann dank der schnellen, kolonfreien Verarbeitungspumpenleitung gleichzeitig große Mengen an Stuhlproben verarbeiten und führte zu einer robusten und reproduzierbaren 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung. Lassen Sie für dieses Protokoll gefrorene Kotproben, die ungefähr die Größe eines Radiergummis haben. Die Proben sollten in zwei Milliliterröhrchen mit der abgeschnittenen Spitze des Entnahmetupfers aufbewahrt werden.

Es sind Negativkontrollen einzuschließen, die aus Abstrichen ohne Kot und internen Duplikaten bestehen, und es werden Probenduplikate aus dem ursprünglichen Probenstuhl als interne Kontrolle verwendet. Beginnen Sie mit dem Auftauen der Extraktions- und Verdünnungslösungen bei Raumtemperatur zusammen mit den Stuhlproben und Kontrollproben. Nach dem Auftauen geben Sie 250 Mikroliter Extraktionslösung in jedes Probenröhrchen und mischen Sie den Kot mit einem Wirbel in die Lösung.

Führen Sie an dieser Stelle Negativregler ein, die nur Puffer enthalten. Anschließend erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad. Nach der Inkubation in kochendem Wasser geben Sie 250 Mikroliter Verdünnungslösung zu jeder Probe und wirbeln Sie die Proben zum Mischen vor.

Lagern Sie dann die Probenröhrchen bei vier Grad Celsius, bis die PCR durchgeführt werden kann. Richten Sie die PCRs an einer Prä-PCR-Workstation ein, die von potenziellen DNA-Kontaminanten wie Templates und Amplikons gereinigt wurde. Beschriften Sie die Primer entsprechend ihrem Barcode und verdünnen Sie sie in doppelt destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 50 Mikromolaren.

Lagern Sie die Vorräte an verdünntem Primer bei minus 20 Grad Celsius und tauen Sie sie vor Gebrauch vollständig auf. Bereiten Sie für jede Probe eine 96-Well-Platte für 32 Reaktionen in dreifacher Ausfertigung vor. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur verdünnen Sie die Aliquote des vorderen Primers und der 32 umgekehrten Primer für die PCR auf fünf Mikromolare.

Bereiten Sie dann genügend Basen-PCR-Mischung für 100 Reaktionen vor. Kombinieren Sie 100 Mikroliter eines fünfmikromolaren Forward-Primers mit einem Milliliter 2X PCR-Mastermix und 400 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Wirbeln Sie diese Mischung und laden Sie dann 15 Mikroliter dieser Mischung in jede der 96 Vertiefungen.

Als nächstes werden Sätze von jeweils drei Vertiefungen mit einem Mikroliter fünf mikromolaren Reverse-Primern geladen. Laden Sie also alle 32 verschiedenen Umkehrindizes in die Platte. Geben Sie dann vier Mikroliter der extrahierten DNA-Probe in jede Plattenvertiefung.

Dies geschieht auf einer sauberen Bank. Führen Sie nun die PCR mit einer dreiminütigen Erstdenaturierung durch, gefolgt von 35 Zyklen mit einer Minute Denaturierung und Knien bei 55 Grad Celsius und einer Minute Verlängerung. Beenden Sie mit einer 10-minütigen letzten Verlängerung.

Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, arbeiten Sie in einer speziellen Post-PCR-Werkbank. Kombinieren Sie dort jeden Satz dreifacher PCR-Produkte in einem einzigen Röhrchen für 60 Mikroliter pro Probe. Lassen Sie dann vier Mikroliter jeder Probe auf ein mit Ethidiumbromid gefärbtes 1%Agarose-Gel laufen.

Die positiven Amplicons erscheinen zwischen 375 und 425 Basenpaaren. Die Negativkontrollen werden dargestellt und zusammen mit den positiven Amplikons der Studie verarbeitet. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentrationen der positiven Reaktionsprodukte gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Kombinieren Sie dann 500 Nanogramm DNA von jedem der Produkte in einem einzigen Röhrchen. Wirbeln Sie diese Mischung ein und lassen Sie dann wie zuvor 200 Mikroliter auf einem 1%-Gel auslaufen. Extrahieren Sie nun die Banden aus dem Gel zwischen 375 und 425 Basenpaaren.

Bereiten Sie als Nächstes die Bibliothek für die Sequenzierung vor. Messen Sie die Konzentration mit einem hochempfindlichen doppelsträngigen DNA-Detektionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, gefolgt von der Verwendung eines hochempfindlichen Trenn- und Analysekits. Verdünnen Sie dann die Bibliothek auf sieben Picomolare und kombinieren Sie sie vier zu eins mit einer Kontrollbibliothek.

Jetzt, da die Probe für die Sequenzierung bereit ist, übertragen Sie sie in die Sequenziermaschine. Das beschriebene Verfahren für eine Bibliotheksvorbereitung aus Stuhlproben wurde verwendet, um das Mikrobiom von hospitalisierten Patienten mit Verdacht auf infektiösen Durchfall zu analysieren. Parallel dazu wurden Stuhlproben auch einer traditionellen Kultivierung in einem mikrobiologischen Labor unterzogen.

Stuhlproben von gesunden Erwachsenen wurden zum Vergleich sequenziert. Es wurden mehrere negative Kontrollproben eingeschlossen, PCR ohne Vorlage, PCR auf sauberen und sterilen Tupfern in Extraktions- und Verdünnungslösung und PCR auf gemischten Extraktions- und Verdünnungslösungen. Jeder von ihnen hatte insgesamt weniger als 118 Reads, bei denen es sich hauptsächlich um Mykoplasma-Taxa handelte.

Standardproben erreichten durchschnittlich mehr als 10.000 Reads, ohne dass Mykoplasmen nach der Qualitätskontrolle identifiziert wurden. Die Konsistenz und Variabilität der Proben wurde anhand von 16 Stuhlproben gemessen, die mit zwei verschiedenen Barcode-Primern präpariert wurden, um somit aus jeder Probe zwei verschiedene Bibliotheken zu erstellen. Die Hälfte der Proben war positiv auf Campylobacter-Salmonellen oder Shigellen in traditioneller Kultivierungstechnik.

Unter Verwendung der 16S-Sequenzierungsergebnisse zeigt ein Flächendiagramm auf Phyloebene die Konsistenz zwischen Bibliotheken, die aus denselben Proben erstellt wurden, unabhängig von den traditionellen Kultivierungsergebnissen. Aus diesem Pool von 16 gepaarten Proben ergab die Hauptkoordinatenanalyse, dass die Probenpaare eng aufeinander abgestimmt sind und dass die positiven Kulturproben einen signifikant anderen PC1-Wert als die negativen Kulturproben aufwiesen. Eine weitere Analyse der Proben ergab, dass hohe Konzentrationen von Proteobakterien nur bei den hospitalisierten Patienten gefunden wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine große Anzahl von Stuhlproben gleichzeitig mit einer dickdarmfreien DNA-Extraktion und PCR verarbeiten können, um Barcode-Sequenzierungsbibliotheken der mikrobiellen Variablen V4 zu erstellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, in einer organisierten und sauberen Umgebung zu arbeiten, insbesondere bei der Vorbereitung der Bibliotheken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Stuhlproben gefährlich ist und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer persönliche Schutzausrüstung getragen werden sollte.