Name: Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Lernen Sie die 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung zur Charakterisierung des Mikrobioms aus Stuhlproben. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse zahlreicher Proben mit robusten und reproduzierbaren Ergebnissen.

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Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von Programms-CORE (Zuschüsse Nr. 41/11), Israel Science Foundation (Grant Nr. 908/15), und die europäischen Morbus Crohn und Colitis Organisation (ECCO).

Ethische, Genehmigung für die Studie wurde von der lokalen Forschungsethikkommission Sheba gewährt und alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Verordnungen durchgeführt. Das Protokoll erhalten eine Zustimmung des Patienten-Ausnahme von der lokalen ethischen Review Board, seit der Fäkalien, die verwendet wurden wurden bereits vorgelegt der Mikrobiologie-Kern im Rahmen des klinischen Aufarbeitung und ohne erkennbare Patienteninformationen als Alter, Geschlecht und mikrobielle Ergebnisse. Geschrieben, wurde die Einwilligung von gesunden Probanden und der Institutional Review Board bewilligt. Einige dieser Proben wurden bereits in einer vorherigen Analyse1aufgenommen.
1. Probe Handhabung
<ol><li>Sammeln eine ca. 5 mm2 Abstrich (etwa die Größe von einem Radiergummi) aus einer frischen Kotprobe mit einem sterilen Tupfer in einem Test tube (siehe Tabelle der Materialien). Speichern Sie alle Tupfer mit Stuhlproben bei-80 ° C innerhalb von 24 h. Die fäkale Tupfer können es bleiben, bis die Weiterverarbeitung.</li>
</ol>(2) DNA-Extraktion
<ol><li>Die Extraktion und Verdünnung Lösungen bei Raumtemperatur auftauen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Übertragung der fäkale Tupfer in eine leere 2 mL Sammlung Rohr (siehe Tabelle der Materialien). Passen Sie die Tupfer Stick Größe durch Schneiden sie mit einer sauberen Schere Rohr Verschluss mit minimalen Cross-Kontamination zu ermöglichen. Jede Sammlung-Röhrchen mit der fäkalen Tupfer und Vortex mischen fügen Sie 250 μL der Extraktionslösung hinzu.</li>
	<li>Die Proben für 10 min in ein kochendes Wasserbad erwärmen (95-100° C). Jede Probe und Vortex mischen fügen Sie 250 μL der Verdünnung der Lösung hinzu.</li>
	<li>Lagern Sie die 2 mL Röhrchen mit der extrahierten DNA und den Tupfer bei 4 ° c</li>
</ol>(3) PCR und Bibliothek-Vorbereitung
Arbeiten Sie für Schritt 3.1 und 3.2 in einer PCR-Workstation, die sauber, bietet Vorlage und Amplifikate Umgebung.
<ol><li>Beschriften Sie die Primer (Tabelle 1) entsprechend ihren Barcode. Verdünnen Sie jede Grundierung in doppelt destilliertem Wasser (DDW) zu einer 50 μM Konzentration und speichern bei-20 ° C.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 96-Well-Platte für PCR-Reaktionen. Jede Platte kann 32 verschiedene Proben enthalten, die von 32 verschiedenen Index Primer versehen sind. Tauen Sie der forward Primer und die 32 reverse Primer bei Raumtemperatur auf und verdünnen sie bis 5 μM.</li>
	<li>100 Reaktionen (Endvolumen in jede Vertiefung werden 20 µl) bereiten Sie PCR Reaktionsmischungen durch das Mischen von 100 μL von 5 μM Forward Primer, 1 mL 2 X PCR Master Mix und 400 μl DDW vor. Legen Sie 15 μl dieser PCR Mischung in jede Vertiefung (insgesamt 96 Wells). 3 verschiedene Brunnen (32 verschiedene Grundierungen in Triplicates bietet insgesamt 96 Wells) fügen Sie 1 μL jeder 5 μM Reverse indizierten Grundierung hinzu.</li>
	<li>In einem Pre-PCR eigene Zone, was bedeutet einen sauberen Werkbank, die Vorlage und Amplifikate frei, ist hinzufügen 4 μL jeder extrahierten DNA-Probe Reaktionsgemischen (jede extrahierte DNA-Probe ist in dreifacher Ausfertigung verstärkt — 32 Proben pro 96-Well-Platte).</li>
	<li>Führen PCR mit den folgenden Einstellungen: erste Denaturierung von 94 ° C für 3 min; gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 1 min, bei 55 ° C für 1 min und Erweiterung bei 72 ° C für 1 min Glühen; und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Kombinieren Sie auf einer anderen Bank, die als ein Post-PCR-eigene Zone definiert wird jeweils dreifacher PCR-Reaktion in einem Einzelband-Rohr (60 μl pro Probe).</li>
	<li>Zur Beurteilung der Qualität der PCR Amplifikate laufen Sie 4 μL jeder kombiniert PCR-Reaktion auf eine Interkalation Bromid-gefärbten 1 % Agarose-Gel. Unter UV-Wellenlänge von 260 nm, die positive Amplifikate erscheint in einem erwarteten Bandgröße von 375-425 bp. Nur diese Amplifikate werden in den nachfolgenden Schritten berücksichtigt. Hinweis: Jede Probe wird in dreifacher Ausfertigung, Bedeutung verstärkt, dass jede Probe in 3 verschiedenen PCR-Reaktionen verstärkt wird. Nicht skalieren.</li>
</ol>(4) Bibliothek Quantifizierung und Reinigung
<ol><li>Um einen Pool äquimolaren Konzentration aller PCR Proben zu erhalten, zu quantifizieren jedes Amplifikate durch eine doppelte stranded DNA (DsDNA quantifizieren Reagenz) fluoreszierendes Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien), geeignet für die gleichzeitige Quantifizierung eines großen Höhe der Proben. Hinweis: Da der Größenbereich der Amplifikate zweideutig ist, dient die tatsächliche Höhe in Nanogramm eine äquimolaren Konzentration zu laden.</li>
	<li>Kombinieren Sie 500 ng jeder Probe in ein einziges, sterilen Röhrchen. Vortex mischen.</li>
	<li>Führen Sie 200 μL der gepoolten Bibliothek auf einer Interkalation Bromid-gefärbten 1 % Agarosegel. Extrahieren Sie die 375-425-bp-Bands aus dem Gel mit einem Gel Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien) und die gepoolte Bibliothek in 80 μl DDW eluieren. Hinweis: Die gepoolte Bibliothek Größe ausgewählt, um unspezifische Amplifikationsprodukte vom Host DNA reduzieren sollte.</li>
	<li>Messen Sie die endgültige Bibliothek Konzentration mit Hilfe eines hochsensiblen DsDNA Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erkennen (siehe Tabelle der Materialien). Messen Sie die genaue Bibliotheksgröße mit einem hochsensiblen Trennung und Analyse-Kit für DNA-Bibliotheken nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>(5) Sequenzierung
<ol><li>Verdünnen die gepoolte Bibliothek bis 19:00 mit Zusatz von 20 % Steuerelementbibliothek (siehe Tabelle der Materialien), nach der Sequenzierung Maschine Protokoll.</li>
	<li>Für die Sequenzierung lesen Verwendung kundenspezifisch angefertigt, Grundierungen, die komplementär zu den V4 Verstärkung Zündkapseln sind (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Verwendung einer dritten benutzerdefinierten gestaltete Sequenzierung Grundierung, die den Barcode in einer zusätzlichen liest (siehe Tabelle 1) und erzeugt gepaart Ende liest 175 Basen Länge in jeder Richtung, entsprechend den Vorgaben des Herstellers.</li>
	<li>Laufen Sie die Sequenzierung Maschine und erhalten Sie FASTQ Dateien nach Protokoll des Herstellers.</li>
</ol>6. Datenverarbeitung
<ol><li>Zusammen nähen Sie und verarbeiten Sie die überlappenden gepaart-End FASTQ Dateien in einer Daten-Kuration-Pipeline in QIIME 2 Version 2017.7.017umgesetzt. Demultiplex liest nach Probe bestimmten Barcodes.</li>
	<li>Verwenden Sie DADA218 für Qualitätskontrolle und Sequenz-Variante (SVs)-Erkennung. Kürzen Sie liest am 13 Basen aus dem 3'-Ende und 15 Stützpunkte von 5'-Ende, verwerfen liest mit mehr als 2 erwartete Fehler. Erkennen und Entfernen der Chimären verwenden die Konsensmethode — Chimären sind in Proben einzeln erkannt und Sequenzen gefunden Chimären in Sekundenbruchteilen genügend Proben werden entfernt.</li>
	<li>SVs taxonomische Klassifikation mit eine Naive Bayes ausgestattet-Sichter durchführen, ausgebildet am August 2013 99 % Identität Greengenes Datenbank-6, für 175 lange Lese- und der vorwärts/rückwärts-Primer eingestellt.</li>
	<li>Verdünnen Sie alle Proben zu Tiefe von 2.146 Sequenzen.</li>
	<li>Nutzen Sie ungewichteten UniFrac für Messung der β-Vielfalt (zwischen Probe Vielfalt19,20) auf die verdünnten Proben, um eine Probe-Größe-Effekt zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie die daraus resultierenden Distanzmatrix um eine Analyse der wichtigsten Koordinaten (HKoA) durchzuführen. Hinweis: Die Datenverarbeitung Skript und Mapping-Dateien dienen als ergänzendes Material (ergänzende Material 1 und 2).</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

16 s rRNA-Amplifikate und Metagenomik Shotgun Sequencing haben Popularität in klinischer Mikrobiologie Anwendungen21,22,23gewonnen. Diese Techniken sind vorteilhaft in ihre erhöhte Fähigkeit, kultivierbare und nicht-kultivierbare Taxa, die Bereitstellung von Daten über die relative Häufigkeit der pathogenen Inokulum und ihre Fähigkeit, genauer gesagt eine infektiöse Biofilm zu identifizieren zu erfassen Fingerabdruck-24. Die Fortschritte a...

Konzentrierte Anstrengungen wurden unternommen, Microbiome Vielfalt und Fülle, als ein weiterer Aspekt für den Fang von Unterschiede und Ähnlichkeiten zwischen den Individuen in gesunden und pathologischen Bedingungen besser zu verstehen. Alter2,3, Geographie4, Lebensstil5,6, und Krankheit5 zeigten sich die Zusammensetzung der Darm Microbiome zugeordnet werden, aber viele Bedingungen und Populationen wurden noch nicht vollständig gekennzeichnet. Vor kurzem wurde berichtet, dass das Mikrobiom für therapeutische Anwendungen7,8,9geändert werden kann. Daher ist zusätzliche Einblicke in die Beziehung zwischen verschiedenen physiologischen Bedingungen und der mikrobiellen Zusammensetzung der erste Schritt zur Optimierung der potenzielle zukünftige Änderungen.
Die traditionelle mikrobielle Kultur-Methoden sind durch niedrige Erträge10,11begrenzt und sind konzipiert als einen binären Zustand, wo ein Bakterium ist entweder, im Darm zu präsentieren, oder nicht. Hochdurchsatz-DNA-basierte Sequenzierung hat mikrobielle Ökologie, ermöglichen die Erfassung aller Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft revolutioniert. Länge und Qualität bleiben erhebliche Hindernisse für genaue Taxonomie Zuordnung12lesen Sequenz jedoch. Darüber hinaus können Batch-Effekte, Hochdurchsatz-basierte Experimente leiden an denen Messungen von nicht-biologischen oder nichtwissenschaftlichen Variablen13betroffen sind. In den letzten Jahren haben mehrere Programme eingerichtet, um der menschlichen Mikrobiom, einschließlich der amerikanischen Darm-Projekt, die Vereinigten Staaten (US) Human Microbiome Project und das Vereinigte Königreich (UK) MetaHIT Projekt zu studieren. Diese Initiativen haben Unmengen an Daten generiert, die nicht aufgrund mangelnder Konsistenz in ihren Ansätzen leicht vergleichbar sind. Eine Vielzahl von internationalen Projekten wie International Human Microbiome Consortium, das Projekt International Human Microbiome Standards und der National Institute of Standards and Technology (NIST) versucht, einige dieser Probleme14-Adresse , und entwickelt Standards für Microbiome Messungen, die das Erreichen der reproduktiven Ergebnisse ermöglichen sollte. Hier beschriebene ist ein integriertes Protokoll mehrere allgemein verwendeten Methoden15,16 für die 16 s rRNA Hochdurchsatz-Sequenzierung (16 s-Seq) ab Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen. Das Protokoll beschreibt einen stützenfreien PCR-Ansatz, ursprünglich für direkte Extraktion von pflanzlichen DNA16, ermöglichen das gleichzeitige Handling einer großen Zahl von fäkalen Proben in relativ kurzer Zeit mit hoher Qualität verstärkt DNA für eine gezielte Sequenzierung der mikrobiellen Variable V4 Region auf einer gemeinsamen Plattform der Sequenzierung. Dieses Protokoll soll Wissenschaftler, die Verwendung der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung gewissermaßen robuste, reproduktive, einfach zu bedienen, ausführliche Einleitung mit wichtigen Kontrollen führen. Eine geführte und detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll kann Batch-Effekt minimieren und so wird mehr vergleichbare Ergebnisse der Sequenzierung zwischen Labors zulassen.

<table><tbody><tr><td>Primer</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extraktionslösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>Verdünnungslösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR Master Mix</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagenzienkit</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA Quantifizierung des Reagenzes</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser Dnase- und RNASE-frei</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Molekulare Sonden</td><td>Q32854</td><td>dsDNA-Detektionskit</td></tr><tr><td>Hohe Empfindlichkeit D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>Screen Tape 5067-5582</td><td>Trennung und Analyse</td></tr><tr><td>Screen Tape Assay</td><td>Agilent</td><td>Technologies Reagenzien 5067-5583</td><td>für DNA-Bibliotheken</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>15017666</td><td>Kontrollbibliothek</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 Zyklen)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Kollektion Röhrchen</td><td>SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>Safe Seal Sammelröhrchen</td></tr><tr><td>Kunststoff-Stabtupfer im PP-Reagenzglas</td><td>STERILER INNENRAUM</td><td>23117</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR-Maschine</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720 Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Sequenziermaschine</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Workstation</td><td>Biosan</td><td>UV-Reiniger</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

geführte protokoll für fäkale mikrobielle charakterisierung von 16 s rrna-amplifikate sequenzierung

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Der menschliche Darm Microbiome spielt eine zentrale Rolle beim Schutz der Zellen vor Verletzungen, bei der Verarbeitung von Energie und Nährstoffen und bei der Förderung der Immunität. Abweichungen von was als eine gesunde Mikrobiota Komposition (Dysbiose gilt) können lebenswichtige Funktionen führt zu pathologischen Bedingungen beeinträchtigen. Bisherigen und laufenden Forschung Bemühungen haben auf die Charakterisierung der Zusammenhänge zwischen mikrobiellen Zusammensetzung und menschliche Gesundheit und Krankheit.
Fortschritte in der Sequenzierung von Hochdurchsatz-Technologien ermöglichen Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung Darm. Diese Methoden umfassen 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung und Schrotflinte Sequenzierung. 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung wird verwendet, um taxonomische Zusammensetzung Profil während Schrotflinte Sequenzierung zusätzliche Informationen über Gene Vorhersagen und funktionellen Annotation bietet. In einer gezielte Sequenzierung Methode der 16 s rRNA Gens Variable Region von Vorteil ist die wesentlich geringeren Kosten im Vergleich zu Schrotflinte Sequenzierung. Sequenzunterschiede in der 16 s rRNA-Gen dienen als mikrobieller Fingerabdruck zur Identifikation und Quantifizierung von verschiedenen Taxa innerhalb einer einzelnen Probe.
Große internationale Anstrengungen haben Standards für die 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung eingetragen. Mehrere Studien berichten jedoch eine Sourceschaltung der Variation von Batch-Effekt verursacht. Zur Minimierung dieser Effekt, uniformierten Protokolle für die Probenentnahme, müssen Verarbeitung und Sequenzierung umgesetzt werden. Dieses Protokoll schlägt die Integration von allgemein verwendeten Protokolle ab Kotprobe Sammlung auf Datenanalysen. Dieses Protokoll beinhaltet einen stützenfreie, direkt-PCR Ansatz, der gleichzeitige Handling und DNA-Extraktion einer großen Zahl von Stuhlproben, zusammen mit PCR Verstärkung der V4 Region ermöglicht. Darüber hinaus wird das Protokoll beschreibt die Analyse Pipeline und liefert ein Skript mit der neuesten Version des QIIME (QIIME-2-Version 2017.7.0 und DADA2). Dieses schrittweise Protokoll zielt darauf ab, die Interessenten bei der Einleitung der Verwendungdes der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung in einer robusten, reproduktive, einfach zu bedienen, detaillierte Weise zu führen.

Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
Wir haben prospektiv Stuhlproben von hospitalisierten Patienten mit vermuteten infektiösen Durchfall gesammelt. Diese Proben wurden klinische Mikrobiologielabor am Sheba Medical Center zwischen Februar und Mai 2015 vorgelegt wie zuvor beschrieben1war. Stuhlproben wurden herkömmliche mikrobiologische K...

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Hochdurchsatz-16S-rRNA-Amplikon-Sequenzierung ist es, die globale Mikrobiomzusammensetzung anhand von Stuhlproben zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur globalen mikrobiellen Zusammensetzung zu beantworten, die mit vielen Interessengebieten wie Stoffwechsel, Verdauung, Darm und systemischen Entzündungen verbunden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Zählung der aeroben und anaeroben mikrobiellen Gemeinschaften ermöglicht, die in der Stuhlprobe vorhanden sind, einschließlich der Bakterien, die schwer zu kultivieren sind.Diese Methode kann dank der schnellen, kolonfreien Verarbeitungspumpenleitung gleichzeitig große Mengen an Stuhlproben verarbeiten und führte zu einer robusten und reproduzierbaren 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung. Lassen Sie für dieses Protokoll gefrorene Kotproben, die ungefähr die Größe eines Radiergummis haben. Die Proben sollten in zwei Milliliterröhrchen mit der abgeschnittenen Spitze des Entnahmetupfers aufbewahrt werden.Es sind Negativkontrollen einzuschließen, die aus Abstrichen ohne Kot und internen Duplikaten bestehen, und es werden Probenduplikate aus dem urspr

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt das DNA-Isolationsprotokoll aus Stuhlproben von Dickdarmtumor-tragenden Mäusen. Die extrahierte DNA wird mittels PCR amplifiziert und das Produkt mit einem auf magnetischen Kügelchen basierenden Ansatz weiter gereinigt. Mit dieser Methode kann der Effekt der Umweltanreicherung auf die Dickdarmmikrobiota und die Tiersterblichkeit bestimmt werden.

Mikrobielle DNA-Isolierung im Stuhl: Untersuchung des Effekts der Umweltanreicherung auf die Mikrobiomdiversität im Maustumormodell

Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung der Darm Microbiota des Dickdarms in-vitro-, mit einer Reihe von Bioreaktoren, die die physiologischen Bedingungen des Magen-Darm-Trakt zu simulieren.

In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung

Dieses Protokoll beschreibt ein In-vitro-Batchkultur-Fermentationssystem menschlicher Fäkalienmikrobiota unter Verwendung von Inulin (einem bekannten Präbiotikum und einem der am häufigsten untersuchten Mikrobiotamodulatoren), um die Verwendung dieses Systems bei der Abschätzung der Interventionen auf fäkale Mikrobiota Zusammensetzung und metabolische Aktivitäten.

Ein In-Vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventionaler Regimen auf humane fäkale Mikrobiota

Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

Wir stellen den Prozess der Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von Bakterien, die Identifizierung mit der 16S-rRNA-Methode und die Prüfung ihres Kohlenwasserstoffabbaupotenzials. Dieser Artikel würde Forschern helfen, die mikrobielle Biodiversität in Umweltproben zu charakterisieren und insbesondere nach Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu suchen.

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies identifizieren, diskriminieren Bakterienstämme und erkennen genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. In diesem Video, wird das Verfahren für die mikrobielle Amplikon Generation Amplikon pyrosequencing und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen werden.

Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Lernen Sie die 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung zur Charakterisierung des Mikrobioms aus Stuhlproben. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse zahlreicher Proben mit robusten und reproduzierbaren Ergebnissen.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

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