Name: Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Western-Blot-Protokoll für hämatopoetische Stammzellen mit nur 500 Zellen. Diese Methode ermöglicht Proteinanalysen bei minimalen Zellzahlen und reduziert den Tierverbrauch in der Forschung erheblich.

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National Institutes of Health gewähren R01 CA149976 (N.A.S) unterstützt diese Arbeit.

Alle Verfahren müssen im Einklang mit institutionellen Tiernutzung und Pflege-Richtlinien durchgeführt werden. Das Verfahren wurde entwickelt für die Analyse von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSCs und HPs), aber für die Analyse von anderen Zellpopulationen angepasst werden kann.
1. Flow Cytometry Isolation der murinen HSCs und HPs
<ol><li>Murine Knochenmarkzellen zu ernten, wie in der Literatur6beschrieben. Hinweis: In die in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellten Daten, Knochenmark von Mäusen C57BL/6J geerntet wurde.</li>
	<li>Führen Sie Linie Erschöpfung der Knochenmarkzellen mit einem Maus-Linie Erschöpfung Kit, nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen die Zelle oberflächenmarker von Interesse wie beschrieben7. In den Experimenten, die in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt werden Antikörper gegen Sca-1, Kit, Flt3 und Abstammung (Lin) Marker Mac1, Gr1, CD3e, B220 und Ter119 verwendet.</li>
	<li>Sortieren von 2.000-20.000 Lin– Sca1++ Flt3 Kit– Zellen (HSCs) oder Lin–Sca1–Kit+ Zellen (HPs) in 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen mit 0,1 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % fetalen Rind Serum (FBS). Hinweis: Für die Daten, die in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt, wurden Zellen mit einem Flow Cytometer mit einer Düse 70 µM sortiert. Die maximale Auffangvolumen beträgt 1,4 mL.</li>
</ol>2. die Probenvorbereitung
Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig. Die Probe sehr sorgfältig verarbeitet. Beim Entfernen des Überstands vorsichtig nicht zu stören das Pellet Zelle sein.
<ol><li>Zentrifuge die 1,5 mL Röhrchen mit sortierten Zellen in eine schwingende Eimer-Rotor bei 4 ° C, 500 X g, für 5 min. entfernen Sie alle, aber rund 100 µL des Überstands aus der Zelle pellet sehr sanft mit einer Pipette und ein 20 µL pipettieren Tipp. Stören Sie das Pellet nicht.<ol>
<li>Wenn die Probe weniger als 5.000 Zellen enthält, und das Gesamtvolumen der sortierte Probe weniger als 0,2 mL beträgt, übertragen Sie die Zellen zunächst auf geringe Bindung 0,2 mL PCR-Röhrchen vor der Zentrifugation.</li>
		<li>Wenn die Probe enthält weniger als 5.000 Zellen und Volumen beträgt mehr als 0,2 mL, die Zellen spin-down mit einer Zentrifuge bei 4 ° C, 500 X g für 5 min, und entfernen Sie alle 200 µL des Überstands. Wieder aussetzen der gebeizte Zellen in die restlichen 200 µL überstand, dann übertragen die Zellen, die 0,2 mL PCR-Röhrchen und spin-down wieder. Entfernen Sie alle aber 20-30 µL aus der Pellets nach der zweiten Runde und auszusetzen Sie Zellen wieder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen im linken überstand in die Röhre. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche PBS in 2 % FBS/PBS (Sie können auch 2 % Rinderserumalbumin (BSA) / PBS oder PBS allein) zu einer Konzentration von 5 X104 bis 5 x 105 Zellen/mL. Hinweis: Verwendung die Zelle zählt erfassten zytometrie einzuschätzen, das Volumen, um die Zellen zu unterbrechen.</li>
	<li>Verwenden Sie 2 bis 5 µL der neu suspendierten Zellen, um eine genaue Zellkonzentration mit einem automatisierten Zelle Zähler (nach Herstellerangaben) oder eine Hemocytometer9bestimmen.</li>
	<li>Ein Volumen von neu suspendierten Zellen, in denen die gewünschte Anzahl von Zellen, die neue 1,5 mL Röhrchen zu übertragen. Für das Experiment in Abbildung 1wurden 2.000, 1.000, 500 HSCs oder HPs übertragen. Die gewünschte Anzahl von Zellen hängt von der Stärke des Signals durch die Western-Blot und empirisch ermittelt. Führen Sie die Übertragung mit 20 µL oder 100 µL Eppendorf PIPETTENSPITZE.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen in eine schwingende Eimer-Rotor bei 4 ° C, 500 X g für 5 min.</li>
	<li>Um 100 x Stammlösungen zu generieren, lösen Sie Proteasom und Phosphatase Inhibitoren in DMSO nach den Anweisungen des Herstellers auf.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 X Laemmli Probenpuffer durch die 4 X Laemmli Probenpuffer des Herstellers mit einer äquivalenten Menge an destilliertem Wasser verdünnen. Fügen Sie eine entsprechende Menge an die 100 X Aktien von Proteasom und Phosphatase-Inhibitoren, eine Endkonzentration von 2 X Inhibitoren in 2 X Laemmli Probenpuffer zu erhalten. Hinweis: Die 2 X Laemmli Probenpuffer kann im Voraus gebucht werden, aber die Proteasom und Phosphatase-Inhibitoren sollte unmittelbar vor dem Hinzufügen der 2 X Laemmli Probenpuffer (plus Inhibitoren), die Zelle Pellet zur lyse der Zellen, wie beschrieben im folgenden Schritt hinzugefügt werden.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie einen Teil des Überstands aus der Zelle Pellet und der überstand noch in die Röhre mit der Pellet-Zelle, fügen Sie ein gleiches Volumen von 2 X Laemmli Probenpuffer plus Proteasom und Phosphatase-Hemmer, eine Endkonzentration von 500 zu erreichen Zellen/µL in 1 X Laemmli Probenpuffer. Hinweis: zum Beispiel, wenn 2.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 20 µL zu übertragen, um ein Rohr in Schritt 2.5, nach dem Zentrifugieren der Zellen (Schritt 2.6) sollten Sie 18 µL des Überstands von Pellets, entfernen und 2 µL des Überstandes, die ausgeführt wird fügen Sie zum gleichen Volumen (2 µL hinzu) 2 x Laemmli Probenpuffer, eine Endkonzentration von 500 Zellen/µL in 1 X Laemmli Probenpuffer zu erreichen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Pellet um so schnell wie möglich die lysate zu generieren. An dieser Stelle die Proben können sofort durch SDS-PAGE Gelen electrophoresed werden, oder kann Snap in Flüssigkeit N2 eingefroren und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.</li>
</ol>(3) Elektrophorese
<ol><li>Erhitzen Sie Lysates im Heizblock bei 95 ° C oder in kochendem Wasser für 5 Minuten.</li>
	<li>1-40 µL der Lysates (mit von 500 bis 20.000 Zelle äquivalente) durch SDS-PAGE Gelen bei 100V mit Standardprotokollen10electrophorese. Hinweis: Das Volumen der lysate in das Gel geladen wird bestimmt durch die Anzahl der Zellen benötigt, um das wünschenswerte Signal zu erzeugen, und richtet sich nach der Fülle des Proteins des Interesses und der Qualität des Antikörpers. Die Daten in Abbildung 1 wurden mit 2.000, 1.000 und 500 Zelle äquivalente lysate erhalten. Die Breite des Brunnens sollte im Bereich von 3 mm bis 1,5 mm. 1,5 mm, die Zähne werden können aus einem handelsüblichen Kamm mit breiteren Zähnen mit einer Schere geschnitten werden.</li>
</ol>4. transfer und blockieren
Hinweis: Führen Sie ein Western-Blot nach Standardprotokollen11. Die Schritte werden hier kurz beschrieben:
<ol><li>Vorbehandeln einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran mit Methanol für 10 s, dann waschen die Membran kurz mit Wasser destilliertem.</li>
	<li>Übertragen Sie das Protein aus dem SDS-PAGE-Gel an die Membran nach den Anweisungen in der Bedienungsanleitung des Herstellers des Geräts übertragen.</li>
	<li>Nach der Übertragung, die Membran mit 2 mL 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBST blockieren (PBS mit 0,1 % Tween) über Nacht bei 4 ° C nach Standardprotokollen11.</li>
</ol>5. Antikörper Labeling
<ol><li>Inkubieren Sie die Membran mit Antikörpern auf einen Shaker über Nacht bei 4 ° C vom Hersteller empfohlene Antikörper-Verdünnungen verwenden. Hinweis: In der Tabelle der Materialien, sind Antikörper, die wir für HSCs und HPs und die entsprechenden Antikörper-Verdünnungen überprüft haben, angezeigt. Führen Sie die Antikörper Kennzeichnung mit Standardverfahren8.</li>
</ol>6. Nachweis
<ol><li>Waschen Sie die Membran 3 mal 5 min für jede Wäsche in PBST bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 2 mL verstärkte Chemilumineszenz-Puffer für 1 min bei Raumtemperatur. Erkennen Sie die Signale mit Hilfe eines abbildenden Systems nach Anweisungen, oder Autoradiographie Film und Film-Prozessor des Herstellers.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Western Blot ist ein verbreitetes Verfahren zur Erkennung von spezifischen Proteinen und die Aktivierung der Signalwege in Geweben oder Zellen. Durch die Einführung von kleinen Anpassungen zu einem häufig verwendeten Verfahren, konnten wir routinemäßig 15 verschiedene Proteine (Table of Materials) in 15.000 HSCs und in einigen Fällen in so wenig wie 500 HSCs erkennen. The Most wichtige Schritte in diesem Protokoll sind: (1) genau zählen die Zellen, 2) minimieren die Anzahl der Transfers zwischen Röhren u...

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selbst erneuernde Zellen, die zu allen Blut Linien führen können. Sie sind relativ seltene Zellen im Knochenmark, biochemische Analysen schwierig zu rendern. Geeignet für die Analyse von seltenen Zellen, wie Durchflusszytometrie, Ansätze wurden äußerst nützlich zur Quantifizierung der relativer Mengen der Zelle oberflächenmarker und intrazelluläre Proteine. Aber die Analyse von intrazellulären Proteinen erfordert den Einsatz von Zelle Permeabilisierung Verfahren zur Antikörper-Zugriff zu ermöglichen, und nicht alle Zelle Oberfläche Epitope überleben diese Verfahren1,2. Darüber hinaus Antikörper, die Unterscheidung zwischen verschiedenen Isoformen oder das Dekolleté Proteinprodukte sind oft nicht für Durchflusszytometrie zur Verfügung, und daher die Ermittler noch setzen auf Western Blots für bestimmte Arten von Analysen.
Western-Blot Analyse der Zelle Lysates ist ein Routineverfahren in den meisten Labors. Zellen können unter heimischen Bedingungen, die die Epitope der Zelle Oberfläche Moleküle zu bewahren gereinigt werden, und anschließend Zelle Lysates vorbereitet und analysiert werden können. Jedoch kann die Analyse von Proteinen in seltenen Primärzelle, die Populationen von Western blot erforderlich euthanizing große Zahl von Tieren genügend Zellen zu erhalten. Durch kleine Anpassungen in mehreren Schritten, konnte einen konventionellen westlichen befleckenden Protokoll Proteine in relativ kleinen Stückzahlen HSCs (500-15.000, abhängig von dem Protein des Interesses) zu erkennen. Die Anpassungen beinhalten genau zählen der Zellen, Umgang mit sorgfältig die Zelle Pellet, Reduzierung der Übertragung von Zellen zwischen Rohren Zellverlust, zu minimieren und Lyse einer definierten Anzahl von Zellen mit einer konzentrierten Belastung mit Proteasom Puffern und Phosphatase-Inhibitoren. Viele veröffentlichten Berichte enthalten Western Blots erhalten mit 20.000 oder mehr HSCs3,4,5,6,7; Dieses einfache Verfahren reduziert die Anzahl der Zellen und Versuchstiere erforderlich, um entsprechende Daten von zwischen 4 und 40 Falte zu produzieren. Das Protokoll soll Ergebnisse pro Zelle und nicht um eine interne Kontrolle zu normalisieren. Dies ermöglicht eine Erfassung der allgemeine Rückgang der Protein-Ebene, die übersehen werden können, wenn Daten in eine interne Kontrolle normalisiert werden. Die Bedeutung der Normalisierung auf einer Basis pro Zelle wurde für die Analyse von Gen Ausdruck Daten8beschrieben, und das gleiche Prinzip gilt für die Quantifizierung der Proteine durch Western-Blot. Dieses optimierte Protokoll sollte nützlich für alle, die zu geringe Anzahl Zellen analysieren.

<table><tbody><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% Acrylamidel Bis-Lösung</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1,5M Tris-HCl pH8,8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1,0M Tris-HCl pH6,8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-Protean 3 Kamm</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Transfersystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>Transfer</td></tr><tr><td>PowerPac HC Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>Elektrophorese</td></tr><tr><td>Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Signaldetektion</td></tr><tr><td>4x Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS Elektrophoresepuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>Elektrophorese</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF Transfer Kit, für 40 blots</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1704272 Transfer</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Phosphatase-Inhibitor Cocktails</td><td>Gold Biotechnology</td><td>GB-450-1</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2469</td><td>WB-Antikörper, validiert in 1000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): Abb2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4858</td><td>WB Antikörper, validiert in 1000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): Abb2</td></tr><tr><td>Aktin (HRP konjugiert)</td><td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB Antikörper, validiert in 500 Zellen Antikörperkonzentration: 1:5000 Referenz (Abbildung): Abb1, Abb2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td><td>WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: Referenz 1:1000 (Abbildung): ref5 (Abb4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb4)</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb4)</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4877</td><td>WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)</td></tr><tr><td>mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>2983</td><td>WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)</td></tr> <tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)</td></tr> <tr><td>Aktin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:3000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 4)</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Reinigung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>LS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>Reinigung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>Phosphorylierungsstimulation</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit Antikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>anti-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>Küvettensortierung</td></tr><tr><td>anti-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>Küvettensortierung</td></tr><tr><td>anti-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>Küvettensortierung</td></tr><tr><td>anti-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>Küvettensortierung</td></tr><tr><td>anti-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>Küvettensortierung</td></tr><tr><td>Abstandsplatten mit 1,0 mm integriert Spacers</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International</td><td>A30075</td><td>Membran blockierendes</td></tr><tr><td>Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>Medium Supplement</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; S17040</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählflim</td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td>Signaldetektion</td></tr><tr><td>medizinischer Filmprozessor</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>Signaldetektion</td></tr><tr><td>Supersignal West Femto Substrat mit maximaler Empfindlichkeit</td><td>Therom Scientific</td><td>34096</td><td>Signaldetektion</td></tr><tr><td>Allegra X-15R Zentrifuge (Rotor SX4750A)</td><td>Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td>Probe Vorbereitung</td></tr><tr><td>BLUEstain Proteinleiter</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P007-500</td><td>Elektrophorese</td></tr><tr><td>Zellsortierer</td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>Elektrophorese</td></tr></tbody></table>

ein western-blot-protokoll für eine kleine zahl von hämatopoetischen stammzellen

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selten, mit der Maus Knochenmark enthält nur ~ 25.000 phänotypischen lange term repopulating HSCs. Ein Western Blot Protokoll wurde optimiert und eignet sich für die Analyse einer kleinen Zahl von Hsz (500-15.000 Zellen). Phänotypische HSCs wurden gereinigt, genau gezählt und direkt in Laemmli Probenpuffer lysiert. Lysates mit gleicher Anzahl von Zellen analysiert wurden durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE), und der Fleck war vorbereitet und nach standard Western Blot-Protokolle bearbeitet. Mithilfe dieses Protokolls 2.000-5.000 HSCs routinemäßig analysiert werden können, und in einigen Fällen Daten erhalten Sie von nur 500 Zellen, im Vergleich zu den 20.000 bis 40.000 Zellen in den meisten Publikationen berichtet. Dieses Protokoll sollte generell für andere hämatopoetischen Zellen, und ermöglicht die routinemäßige Analyse einer kleinen Zahl von Zellen unter Verwendung von standard-Labor-Verfahren.

Repräsentative Ergebnisse von 500-2.000 gereinigten HSCs und HPs sind in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Das β-Aktin-Signal in Abbildung 1 kann aus so wenig wie 500 HSCs erkannt werden und HPs gereinigt aus dem Knochenmark von einem einzigen Mausklick. Beachten Sie, dass die Lysates in 1,5 mm Brunnen laden ein viel stärkeres Signal von 500 HPs als laden in 3,0 mm Brunnen produziert. <strong class...

Ein standard Western Blot-Protokoll wurde für die Analyse möglichst wenige 500 Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen optimiert. Optimierung beinhaltet sorgfältige Handhabung von die Zellprobe, Begrenzung der Transfers zwischen Röhren und direkt Lyse der Zellen im Probenpuffer Laemmli.

Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Das übergeordnete Ziel dieses Western-Blotting-Protokolls ist es, Western Blots an einer kleinen Anzahl von Zellen durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der hämatopoetischen Stammzellen zu beantworten, wie z. B. das Vorhandensein oder die Häufigkeit bestimmter Proteine oder die Aktivierung von Signalwegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass weniger als 20.000 Zellen benötigt werden, so dass weniger Tiere benötigt werden, um seltene Populationen von Primärzellen zu analysieren.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir versuchten, Wege zu finden, die Anzahl der Mäuse zu reduzieren, die wir für hämatopoetische Stammzellanalysen einsetzen mussten. Das Verfahren wird von Xiongwei Cai, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert. Verwenden Sie einen schwingenden Schaufelrotor, um 1,5-Milliliter-Röhrchen mit sortierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen bei der 500-fachen Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren.Sobald die Zentrifugation beendet ist, verwerfen Sie alle bis auf 100 Mikroliter Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Wenn weniger als 5.000 Zellen vorhanden sind und das V

a-western-blotting-protocol-for-small-numbers-hematopoietic-stem

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (HIS). CD34+ hämatopoetische Stammzellen (HSCs) werden aus menschlichen Buffy-Coat-Zellen aus Nabelschnurblut mit Hilfe von Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen isoliert. Die CD34+ HSCs werden in einem mit Zytokinen angereicherten Wachstumsmedium expandiert und kryokonserviert. Schließlich werden die aufgetauten HSCs in ein immundefizientes Mausjunges injiziert, um das HIS-Mausmodell zu etablieren.

Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Vorbereitung von Proben mit geringer Zellzahl für die Analyse der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung von ruhenden humanen hämatopoetischen Stammzellen in vitro, indem die Mikroumgebung des Knochenmarks mit reichlich Fettsäuren, Cholesterin, niedrigeren Konzentrationen von Zytokinen und Hypoxie imitiert wird.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.

Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

Hier wird eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik vorgestellt, die es ermöglicht, gleichzeitig die Anzahl der Zellteilungen, den Phänotyp der Oberflächenzellen und die zelluläre Verwandtschaft zu messen. Diese Eigenschaften können statistisch mit einem auf Permutation basierenden Framework getestet werden.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Lernen Sie ein optimiertes Western-Blot-Protokoll für hämatopoetische Stammzellen mit nur 500 Zellen. Diese Methode ermöglicht Proteinanalysen bei minimalen Zellzahlen und reduziert den Tierverbrauch in der Forschung erheblich.

Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

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