Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Western-Blotting-Protokolls ist es, Western Blots an einer kleinen Anzahl von Zellen durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der hämatopoetischen Stammzellen zu beantworten, wie z. B. das Vorhandensein oder die Häufigkeit bestimmter Proteine oder die Aktivierung von Signalwegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass weniger als 20.000 Zellen benötigt werden, so dass weniger Tiere benötigt werden, um seltene Populationen von Primärzellen zu analysieren.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir versuchten, Wege zu finden, die Anzahl der Mäuse zu reduzieren, die wir für hämatopoetische Stammzellanalysen einsetzen mussten. Das Verfahren wird von Xiongwei Cai, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert. Verwenden Sie einen schwingenden Schaufelrotor, um 1,5-Milliliter-Röhrchen mit sortierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen bei der 500-fachen Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren.

Sobald die Zentrifugation beendet ist, verwerfen Sie alle bis auf 100 Mikroliter Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Wenn weniger als 5.000 Zellen vorhanden sind und das Volumen der sortierten Probe weniger als 0,2 Milliliter beträgt, werden die Zellen vor der Zentrifugation zunächst in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen mit geringer Bindung überführt. Wenn es jedoch weniger als 5.000 Zellen sind, aber das Volumen der sortierten Probe mehr als 0,2 Milliliter beträgt, zentrifugieren Sie die Zellen bei der 500-fachen Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation sind alle bis auf 200 Mikroliter Überstand zu verwerfen. Dann das Pellet und die restlichen 200 Mikroliter Überstand wieder suspendieren. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut.

Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 20 bis 30 Mikrolitern Überstand und entsorgen Sie den Rest. Falls erforderlich, geben Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung in 2 % fötalem Rinderserum oder 2 % Rinderserumalbumin zu den resuspendierten Zellen. Verwenden Sie dann einen automatisierten Zellzähler, um die zelluläre Konzentration anhand von zwei bis fünf Mikrolitern resuspendierter Zellen zu bestimmen.

Verwenden Sie anschließend eine 20- oder 100-Mikroliter-Pipettenspitze, um ein Volumen von 500, 1.000 und 2.000 hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Mit einem schwingenden Schaufelrotor zentrifugieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius und der 500-fachen Schwerkraft fünf Minuten lang. Befolgen Sie dann die Anweisungen des Herstellers, um Phosphatase- und Proteasomhemmer und DMSO aufzulösen, um eine 100-fache Stammlösung herzustellen.

Als nächstes verdünnen Sie den vierfachen Laemmli-Probenpuffer mit äquivalenten Volumina destilliertem Wasser, um einen zweifachen Laemmli-Probenpuffer herzustellen. Fügen Sie dann geeignete Mengen der 100-fachen Stammlösung aus Phosphatase und Proteasominhibitor hinzu, um die Endkonzentration auf zweifache Inhibitoren und zweifachen Laemmli-Probenpuffer einzustellen. Das Volumen des Restüberstands im Röhrchen wird so angepasst, dass durch Zugabe gleicher Volumina von zweifachem Laemmli-Puffer zusammen mit dem Phosphatase- und Proteasom-Inhibitor eine Endkonzentration von 500 Zellen pro Mikroliter und ein facher Laemmli-Puffer erreicht wird.

Und dann erneut suspendieren, um das Lysat zu bilden. Erhitzen Sie die Probenlysate vor dem Laden des Gels fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius in einem Wärmeblock. Unter Verwendung von Standardprotokollen wird die Elektrophorese von einem bis 40 Mikrolitern Lysat, was 500 bis 20.000 Zellen entspricht, über die SDS-Seite bei 100 Volt elektrophoresisch behandelt.

Polyvinyliden-Membran für Sekunden mit Methanol behandelt haben, waschen Sie die Membran kurz mit destilliertem Wasser. Übertragen Sie dann das Protein aus dem Gel auf die Membran gemäß den Anweisungen des Herstellers der Übertragungsvorrichtung. Nach dem Transfer wird die Membran mit zwei Millilitern 2 % Rinderserumalbumin und phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Zwischenzeit über Nacht bei vier Grad Celsius gemäß Standardprotokollen blockiert.

Nachdem Sie die Membran blockiert haben, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit verdünnten Antikörpern. Waschen Sie dann die Membran dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 %Tween 20 für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes inkubieren Sie die Membran mit zwei Millilitern verstärktem Chemilumineszenzpuffer für eine Minute bei Raumtemperatur.

Erfassen Sie die Signale mit einem bildgebenden System. Zum Vergleich der Beta-Aktin-Signale wurden Lysate aus hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des Urins hergestellt und einer westlichen Parzellenanalyse unterzogen. Aus dem Amino-Blot geht klar hervor, dass es eine Abnahme des Beta-Aktin-Signals aus den Lysaten gibt, die von 2.000 auf 500 hämatopoetische Vorläuferzellen und Stammzellen hergestellt wurden, die in 1,5-Millimeter-Wells auf einem 12%-SDS-Seitengel geladen wurden.

Des Weiteren sollen die Beta-Aktin-Signale verglichen werden, die aus verschiedenen Well-Größen gewonnen wurden, die auf das Gel gegossen wurden. Die Lysate wurden in 1,5- und Drei-Millimeter-Wells auf das Gel geladen und dann einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Der Blot zeigt, dass das Beta-Aktin-Signal, das aus dem Lysat gewonnen wird, das von 500 hämatopoetischen Vorläuferzellen hergestellt wurde, die in einem 1,5-Millimeter-Well geladen wurden, viel stärker ist als wenn es in einem drei Millimeter großen Well geladen wird.

Um die Signale für den eukaryotischen Initiationsfaktor 4G, das Aktin und die Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6 als Reaktion auf die Stimulation des Zytokinstammzellfaktors zu vergleichen, wurden die erhaltenen Lysate mittels Aminoblot analysiert. Der Blot zeigt das Vorhandensein stärkerer Signalintensitäten für alle drei Proteine in den hämatopoetischen Neuritoren mit Stimulation des Zytokinstammzellfaktors. Im Vergleich zur Kontrolle in vitro ist auch deutlich, dass es eine zunehmende Signalintensität für alle drei Proteine aus unterschiedlichen hämatopoetischen Stammzellvolumina gibt.

Einmal gemeistert, kann dies technisch in 48 Stunden erledigt werden. Wenn man sich ihm richtig nähert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen genau zu zählen und die Lysatzellen mit einem Ladepuffer zu leiten.

Nach dieser Entwicklung wird es für die Forscher im Bereich der Stammzellforschung technisch vernichtet, um Signalwege in einer kleinen Anzahl von Zellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Western-Plotten mit einer kleinen Anzahl von Adressstücken durchführt. Seien Sie vorsichtig mit den Regionen, die Sie für die SDS-Seite verwenden.

Danke für das Aufpassen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.