Name: Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie die CiDER-Methode zur chemisch induzierbaren DNA-Hydroxymethylierung in Säugetierzellen. Diese Technik ermöglicht zeitliche Kontrolle epigenetischer Zustände und eröffnet neue Einblicke in die Genregulation.

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Wir bedanken uns bei den finanziellen Unterstützungen von den National Institutes of Health zu gewähren (R01GM112003, YZ), Welch Foundation (BE-1913 bis YZ), der American Cancer Society (RSG-16-215-01 FSME, YZ) und Cancer Prevention Research Institute of Texas (RR140053, YH, RP170660, YZ), der American Heart Association (16IRG27250155, YH), und John S. Dunn Stiftung Verbundforschung Award Programm.

(1) Zell-Kultur, Plasmid Transfection und chemische Induktion
<ol>
	<li>Kultur eine adhärente Zell-Linie (z. B. der menschlichen embryonalen Niere HEK293T Zelle) in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Transfizieren Sie Zellen mit dem Apfelwein-Plasmid.
	<ol>
		<li>Mindestens 18 Stunden vor Transfektion, 0,3 x 106 Samenzellen in 2,5 mL des entsprechenden DMEM pro auch in eine 6-Well-Platte und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C über Nacht um 60-80 % Konfluenz zu erreichen.</li>
		<li>Vorwärmen des Transfection Reagens vor Gebrauch auf Raumtemperatur.</li>
		<li>Platz 250 µL serumfreien Medium in ein steriles Röhrchen. Hinweis: Dieser Betrag ist für eine 6-Well-Platte mit 80 % Konfluenz zugeschnitten. Passen Sie ggf. anteilig die mittlere Beträge entsprechend den Größen von Platten oder Zellzahlen.</li>
		<li>Fügen Sie 2,5 µg des Plasmids Apfelwein18 oder die katalytische Domäne von TET2-Codierung (TET2CD als Positivkontrolle)12,13 in serumfreien Medium und sanft durch Pipettieren mischen.</li>
		<li>7.5 µL Transfection Reagens zur verdünnten DNA-Mischung hinzugeben und vorsichtig mischen durch pipettieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20-30 min.</li>
		<li>Ändern Sie vorgewärmte Medien und fügen Sie die Mischung tropfenweise in die Vertiefungen und schütteln Sie der Zellplatte Kultur um die Transfection Reagens und DNA-Gemisch gleichmäßig zu verteilen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen und Mischung über Nacht, und ersetzen Sie die Transfektion Reagenz, Medien mit 2ml frische komplette DMEM enthält.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chemische Induktion
	<ol>
		<li>Verdünnte 2 mM von Rapamycin Lager (in DMSO gelöst) zu einer Konzentration von 20 µM in geeignete vollständige Medium.</li>
		<li>Transfizierten Zellen gepflegt in 2 mL Medium, eine Endkonzentration von 200 erreichen 20 µL verdünnter Rapamycin hinzufügen nM. Hinweis: Nach der Inkubation für 48 h sind Zellen für die Quantifizierung der 5hmC Generation oder downstream-Anwendungen bereit. Bei Bedarf kann die Induktion Effizienz überwacht durch Herausnehmen der Zellen alle 3 h für weitere 5hmC Quantifizierung wie unten beschrieben und in Abbildung 1dargestellt.</li>
		<li>Für bessere Quantifizierung der 5hmC Induktion Effizienz trennen Samen Brunnen um Zellen überwachen alle 3 Stunden.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Quantifizierung der Rapamycin-induzierte 5hmC Produktion von Immunostaining
<ol>
	<li>5hmC Immunfluoreszenz Färbung Hinweis: Fügen Sie ausreichende Mengen an die Fixierung-Lösung, bestehend aus 4 % Paraformaldehyd, 0,2 % Tensid (z. B. Triton x-100) in PBS mit 3 N HCl, um alle Zellen im Teller zu decken. Beispielsweise wäre genug für einen Brunnen in einem 6-Well-Platte 500 µL Lösung. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur.<ol>
		<li>Um Zellen zu beheben, fügen Sie 4 % Paraformaldehyd in PBS Rapamycin-behandelten Zellen für 15 min bei Raumtemperatur. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe Zellen mit dem Ausdruck mCherry-Apfelwein ohne Rapamycin Behandlung. Nicht schütteln. Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Angemessenen Schutz zu tragen.</li>
		<li>Fixativ Lösung zu verwerfen. Inkubieren Sie fixe Zellen mit 0,2 % Tensid mit PBS-Puffer für 30 min zur Zellmembran permeabilize.</li>
		<li>Permeabilisierung Lösung zu verwerfen. Die permeabilized Zellen 3 N HCl hinzu und inkubieren Sie für 15 min, um die DNA zu denaturieren.</li>
		<li>HCl. Add 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) auf die Zellen für 10 min für die Neutralisierung des pH-Wertes zu verwerfen.</li>
		<li>Die Lösung zu verwerfen. Zellen mit PBS für gründlich waschen 3-5 Mal. Entfernen Sie PBS gründlich. Hinweis: Fügen Sie ausreichende Mengen an PBS für jedem Waschschritt. Zum Beispiel ist 1 mL PBS genug für eine 6-Well-Platte.</li>
		<li>Zellen zu blockieren, indem man die blockierenden Puffer, bestehend aus 1 % BSA und 0,05 % des Tensids (z. B. Tween 20) mit PBS-Puffer für 1 h mit sanft schütteln.</li>
		<li>Entsorgen Sie die blockierende Lösung. Die Zellen der verdünnten 5hmC Antikörper (1: 200) hinzu und 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit PBS drei Mal für 15 Minuten.</li>
		<li>Hinzufügen einer verdünnten Fluorophor (FITC)-konjugierten Sekundärantikörper (1: 200) zu den Zellen und 1 h inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit PBS dreimal ausgiebig um verbleibende Antikörper zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 250 ng/mL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) die Keimzelle für 5 min. Fleck entfernen der Färbelösung.</li>
		<li>Montieren Sie die Folie oder Glasboden Kulturschale mit Immunostained Zellen für die konfokale Bildgebung. Ein repräsentatives Ergebnis zeigte sich in Abbildung 1 b.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Durchflusszytometrie Hinweis: Verwenden Sie eine 96-Well-Runde Bodenplatte für folgende Färbeverfahren. In der Regel genügt für jedes gut 150 µL Reagenzien.<ol>
		<li>Aufschwemmen Sie transfizierte und Rapamycin-induzierte Zellen in FACS Puffer (PBS mit 1 % BSA, 2 mM EDTA). Verwenden Sie für die Kontrollgruppe Apfelwein exprimierenden Zellen ohne Rapamycin Behandlung.</li>
		<li>Fix und permeabilize der Zellen, wie in Schritt 2.1 beschrieben.</li>
		<li>Fügen Sie 2 N HCl zu den Zellen, die DNA für 10 min zu denaturieren.</li>
		<li>Verwerfen Sie HCl. neutralisieren und blockieren Sie die Zellen zu, wie in Schritt 2.1 beschrieben.</li>
		<li>Die Zellen einen verdünnten Anti-5hmC-Antikörper (1: 200) hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit FACS Puffer dreimal. Entfernen Sie FACS Puffer gründlich.</li>
		<li>Hinzufügen einer verdünnten Fluorophor (FITC)-konjugierten Sekundärantikörper (1: 400) für Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Analyse und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit FACS Puffer dreimal.</li>
		<li>Muster sind für die FACS-Analyse bereit. Ein repräsentatives Ergebnis zeigte sich in Abbildung 1-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(3) Dot-Blot-Test, 5hmC und 5-Methylcytosine (5mC) quantifizieren beträgt
<ol>
	<li>Genomischen DNA aus transfizierten und Rapamycin-induzierte Zellen mit einem kommerziellen DNA Extraktion Kit zu isolieren. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe Apfelwein-transfizierten Zellen ohne Rapamycin Behandlung.</li>
	<li>Erhitzen Sie die Vakuum Ofen auf 80 ° C und Pre-Einweichen Nitrozellulose-Membran in bidestilliertem H2O und dann 6 x Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) Puffer für 10 min.</li>
	<li>Laden Sie 60 µL gleiche Mengen von DNA (insgesamt 2 µg in TE-Puffer), eine 96-Well-PCR-Platte. Die übrigen Brunnen 30 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) hinzufügen.</li>
	<li>Stellen Sie zweifache Verdünnungsreihen vertikal auf der 96-Well-Platte durch die Übertragung von 30 µL Lösung auf Zeile 1 in der gleichen Spaltenposition in Zeile 2. Nochmals mischen und 30 µL der Lösung in die Vertiefungen in der nachfolgenden Zeile bis zum Erreichen der Grenze zu übertragen.</li></ol>Entfernen Sie die letzten 30 µL.
	<li>Fügen Sie 20 µL 1 M NaOH und 10 mM EDTA in jede Vertiefung, die Dichtplatte und erhitzen Sie die Mischung für 10 min bei 95 ° C vollständig DNA Duplex denaturieren.</li>
	<li>Sofort die Proben auf Eis kühlen Sie ab und fügen Sie 50 µL der eiskalten 2 M Ammoniumacetat (pH 7,0) und inkubieren Sie für 10 min auf Eis. Hinweis: Schritte 3,7-3.10 beinhaltet die Verwendung des Vakuums.</li>
	<li>Montieren Sie die Dot-Blot Apparat mit eingeweichter Membran und entfernen Sie verbleibende Puffer mit vollem Vakuum.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran durch Zugabe von 200 µL TE-Puffer in jede Vertiefung des Dot-Blot Apparates. Schalten Sie ein Vakuum, TE-Puffer zu entfernen.</li>
	<li>Laden Sie die denaturierte DNA (vorbereitet in den vorherigen Schritten 3.1-3.6) in jede Vertiefung des Dot-Blot Apparates. Schalten Sie ein Vakuum, Lösung zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran durch Zugabe von 200 µL 2 x SSC und entfernen Sie verbleibende Lösungen komplett mit Vakuum.</li>
	<li>Dot-Blot-Apparat zu zerlegen, die Membran herausnehmen und spülen Sie die ganze Membran mit 20 mL 2 X SSC.</li>
	<li>Trocknen Sie die Membran für 20 min an der Luft.</li>
	<li>Backen der Membran bei 80 ° C unter Vakuum für 2 h.</li>
	<li>Die Membran der blockierende Lösung (5 % Magermilch in TBST) hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entsorgen Sie die blockierende Lösung. Hinzufügen einer verdünnten 5hmC (1:5 000) oder 5mC (1:1, 000) Antikörper gegen die Membran und über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie die Membran mit TBST dreimal für 10 min, verbleibende Antikörper zu entfernen. Entfernen Sie TBST gründlich.</li>
	<li>Hinzufügen einer HRP-konjugierten Sekundärantikörper (01:10, 000 für Anti-Kaninchen-HRP(5hmC) oder 1:3,000 für Anti-Maus HRP(5mC)) der Membran und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran mit TBST dreimal für 10 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie ECL western Blot-Substrat der Membran zur Visualisierung der 5hmC Signale mit einem Chemilumineszenz-Detektor hinzu. Ein repräsentatives Ergebnis zeigte sich in Abbildung 1E.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier haben wir gezeigt, die Verwendung eines technischen Split-TET2 Enzyms, zeitliche Steuerung der DNA-Hydroxymethylation zu erreichen. Nach der Entdeckung des TET-Familie von 5-Methycytosine-Dioxygenase wurden viele Studien durchgeführt, um die biologischen Funktionen von TET Proteine und ihre katalytische Hauptprodukt 5hmC1,2,3zu entschlüsseln, 4,5,</...

DNA-Methylierung, meist bezieht sich auf die Zugabe von einer Methylgruppe an die Carbon 5 Position von Cytosin, 5-Methylcytosine (5mC) zu bilden, ist durch DNA-Methyl-Transferasen (DNMTs) katalysiert. 5mC fungiert als eine wichtige epigenetische Markierung im Säugetier-Genom, das oft für transkriptionellen Repression, X-Chromosom Inaktivierung und Transposon-Stummschaltung1signalisiert. Die Umkehrung der DNA-Methylierung wird durch die zehn Elfen Translokation (TET) Protein-Familie vermittelt. TET Enzyme gehören zum Eisen (II) und 2 Oxoglutarate abhängigen Dioxygenases, die die aufeinanderfolgenden Oxidation von 5mC, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxycytosine (5caC) katalysieren. TET-vermittelten 5mC Oxidation stellt einen zusätzlichen epigenetischen Kontrolle über das Säugetier-Genom. Die Entdeckung der TET löste intensives Interesse an epigenetischen Bereich, die biologischen Funktionen von TET Proteine und ihre katalytische Hauptprodukt 5hmC zu enthüllen. 5hmC ist nicht nur ein Zwischenprodukt während der TET-vermittelte aktive DNA Demethylierung2,3,4, aber auch Handlungen als stabile epigenetische markieren,5,6,7,8 . Zwar DNA Hydroxymethylation hoch korreliert mit Genexpression und aberrante sind Veränderungen der DNA-Hydroxymethylation mit einige menschliche Störungen9,10,11, die kausale Beziehungen verbunden zwischen epigenetische Veränderungen an der DNA und die Phänotypen bleiben oft anspruchsvoll eingerichtet werden, die teilweise zugeschrieben werden kann, um den Mangel an zuverlässigen Werkzeug genau hinzufügen oder Entfernen von DNA-Veränderungen im Genom an definierten zeitlichen und räumlichen Auflösung.
Hier berichten wir über die Verwendung von einer Chemikalie-induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug (Apfelwein) zur Überwindung der Hürde mit Blick auf Studien von Kausalbeziehungen zwischen DNA-Hydroxymethylation und gen-Transkription. Das Design basiert auf der Annahme, dass die katalytische Domäne von TET2 (TET2CD) in zwei inaktive Fragmente ausgedrückt in Säugetierzellen aufgeteilt werden kann und seine enzymatische Funktion wiederhergestellt werden kann, indem ein chemisch induzierbare Dimerisierung Ansatz ( Abbildung 1A). Um ein Split-TET2CD-System zu etablieren, haben wir sechs Standorte in TET2CD, bestehend aus einem Cys-reiche Region und eine doppelsträngige β-Helix (DSBH) Falte, auf der Grundlage einer gemeldeten Kristallstruktur von TET2-DNA-Komplex, der eine geringe Komplexität Region12fehlt. Ein synthetisches Gen Kodierung Rapamycin-induzierbaren Dimerisierung Modul FK506 bindendes Protein 12 (FKBP12) und FKBP Rapamycin bindende Domäne (FRB) des Säugetier-Ziel von Rapamycin14,15, zusammen mit einem selbst anhaftenden Peptid T2A Polypeptid Sequenz16,17, wurde einzeln in ausgewählten Teilen Websites innerhalb TET2CD eingefügt. Die Auswahl von TET2 als unser engineering Ziel basiert auf folgenden Überlegungen. Erste, somatische Mutationen im TET2 mit gleichzeitiger Reduzierung der DNA-Hydroxymethylation sind häufig zu beobachten bei menschlichen Erkrankungen einschließlich myeloische Erkrankungen und Krebs10, liefert nützlichen Informationen auf sensiblen Standorten vermieden werden sollen einsetzen. Zweitens ist ein großer Teil der TET2 katalytische Domäne, besonders in die geringe Komplexität der Region, für die enzymatische Funktion12, so dass wir eine minimierte Split-TET2 für induzierbaren epigenetische Modifikationen Handwerk entbehrlich. Nach der Durchleuchtung über 15 Konstrukte, wurde ein Konstrukt, das höchste Rapamycin-induzierbaren Wiederherstellung der seine enzymatische Aktivität im Säugetier-System ausgestellt gewählt und als Apfelwein18bezeichnet. Wir beschreiben hier die Verwendung des mCherry-Tags Apfelwein induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau mit Rapamycin zu erreichen, und drei Methoden zur Validierung von Apfelwein-vermittelten 5hmC Produktion in einem Modell Zellsystem HEK293T zu präsentieren.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% Lösung</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, </td><td>Rind Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosin (5-hmC) Antikörper (pAb)</td><td>Aktives Motiv</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Economy-Vakuumofen, 0,6 Kubikfuß (17 L)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparat</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-Methylcytosin (5mC) Antikörper, Klon 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG, HRP-linked Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen IgG, HRP-linked Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Lösung</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

ein veränderter split-tet2 enzym für chemische-induzierbaren dna hydroxymethylation und epigenetische umbau

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA-Methylierung ist eine stabile und vererbbare epigenetische Modifikation im Säugetier-Genom und engagiert sich bei der Regulierung der Genexpression Zellfunktionen steuern. Die Umkehrung der DNA-Methylierung und DNA Demethylierung wird durch die zehn-elf-Translokation (TET)-Proteinfamilie von Dioxygenases vermittelt. Obwohl es weit berichtet wurde, dass aberrante DNA-Methylierung und Demethylierung Entwicklungsschäden und Krebs zugeordnet sind, tragen wie diese epigenetischen Veränderungen unmittelbar auf die nachträgliche Veränderung im gen-Expression oder Krankheit Fortschreiten bleibt unklar, hauptsächlich aufgrund der Mangel an zuverlässigen Tools genau hinzufügen oder Entfernen von DNA-Veränderungen im Genom mit definierten zeitlichen und räumlichen Auflösung. Um diese Hürde zu überwinden, entwarfen wir ein Split-TET2 Enzym, zeitliche Steuerung der 5-Methylcytosine (5mC) Oxidation und anschließenden Umbau des epigenetischen Staaten in Säugerzellen durch einfaches Hinzufügen von Chemikalien zu ermöglichen. Hier beschreiben wir Methoden für die Einführung einer Chemikalie-induzierbaren Epigenom umgestaltet Tools (Apfelwein), basierend auf ein Enzym entwickelt Split-TET2 in Säugetierzellen und Quantifizierung der chemischen induzierbaren Produktion des 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) mit Immunostaining, Durchflusszytometrie oder eine Dot-Blot-Test. Diese Chemikalie-induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug finden breite Verwendung in Verhören zellulare Systeme ohne Veränderung des genetischen Codes sowie in Epigenotype−phenotype Beziehungen in verschiedenen biologischen Systemen zu sondieren.

Chemische induzierbaren 5mC-5hmC-Umwandlung kann durch Immunostaining auf einzellige, Flow-Zytometrie-Analyse auf transfizierten (mCherry-positiv) Zell-Populationen, oder eine mehr quantitative Dot-Blot-Test wie in Abbildung 1dargestellt validiert werden. Die katalytische Domäne von TET2 oder TET2CD, wurden während der Studie als Positivkontrolle verwendet. Siehe Referenzen 18-20 für weitere Einzelheiten über die genomweite Kartierung von Rapamycin-induzierte...

Detaillierte Protokolle für die Einführung ein veränderter Split-TET2 Enzym (Apfelwein) in Säugerzellen für chemische induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau werden vorgestellt.

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Das übergeordnete Ziel dieser Versuchsreihe ist es, ein künstlich hergestelltes Split-TET2-Enzym namens CiDER in Säugetierzellen einzuführen, um induzierbare DNA-Modifikationen wie Hydroxymethylierung sowie epigenetische Remodellierung zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Epigenetik zu beantworten, wie z. B. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das manipulierte Split-TET2-Enzym die zeitliche Kontrolle der 5-Methylcytosin-Oxidation und den anschließenden Umbau epigenetischer Zustände in Säugetierzellen mit chemischen Zusätzen ermöglicht. Um dieses Verfahren zu beginnen, kultivieren Sie eine adhärente Zelllinie in DMEM, die mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS sowie 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin ergänzt wird.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2. Transfizieren Sie die Zellen mit dem CiDER-Plasmid, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius.Ersetzen Sie am nächsten Tag das Transfektionsreagenzien-haltige Medium durch frisches vollständiges DMEM. Um die Zellen chemisch zu induzieren, geben Sie 20 Mikroliter verdünntes Rapamycin zu den transfizierten Zellen, die in zwei Millilitern Medium gehalten werden, um eine Endkonzentration von 200 Nanomolar zu erreichen. Um eine Durchflusszytometrie durchzuführen, resuspendieren Sie die transfizierten und Rapamycin-induzierten Zellen in FACS-Puffer.Verwenden Sie für die Kontrollgruppe CiDER-exprimierende Zellen ohne Rapamycin-Behandlung. Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie dann zwei normale Salzsäure in die Zellen, um die DNA 10 Minuten lang zu denaturieren.Nach der Neutralisierung und Blockierung der Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, geben Sie den verdünnten Anti-5hmC-Antikörper zu den Zellen. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit FACS-Puffer.Entfernen Sie den FACS-Puffer gründlich. Geben Sie einen verdünnten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper für die FACS-Analyse hinzu und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit FACS-Puffer.Nach dem Waschen sind die Proben bereit für die FACS-Analyse. Isolierung genomischer DNA aus transfizierten und Rapamycin-induzierten Zellen mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe CiDER-transfizierte Zellen ohne Rapamycin-Behandlung.Heizen Sie den Vakuumschrank auf 80 Grad Celsius vor. Weichen Sie die Nitrozellulosemembran in doppelt destilliertem Wasser und dann 10 Minuten lang in 6X SSC-Puffer ein. Laden Sie als Nächstes 60 Mikroliter der gleichen Menge DNA auf eine 96-Well-PCR-Platte.Geben Sie 30 Mikroliter TE-Puffer in die Rest-Wells. Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen vertikal auf der 96-Well-Platte durch, indem Sie 30 Mikroliter Lösung in Reihe eins auf die gleiche Säulenposition in Reihe zwei übertragen. Erneut mischen und 30 Mikroliter Lösung in die Vertiefungen in der folgenden Reihe umfüllen, bis die Grenze erreicht ist.Entnehmen Sie dann die letzten 30 Mikroliter aus der Vertiefung. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids und 10 millimolare EDTA in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und erhitzen Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um den DNA-Duplex vollständig zu denaturieren.Kühlen Sie die Proben sofort auf Eis ab. Geben Sie 50 Mikroliter eiskaltes, zwei molare Ammoniumacetat in jede Vertiefung und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis. In der Zwischenzeit bauen Sie das Dot-Blot-Gerät mit der vorgetränkten Membran zusammen.Entfernen Sie den Restpuffer mit einem vollständigen Vakuum. Waschen Sie die Membran, indem Sie 200 Mikroliter TE-Puffer in jede Vertiefung des Dot-Blot-Geräts geben. Schalten Sie das Vakuum ein, um den TE-Puffer zu entfernen.Laden Sie als Nächstes die denaturierte DNA in jede Vertiefung des Dot-Blot-Geräts. Schalten Sie das Vakuum ein, um die Lösung zu entfernen. Waschen Sie die Membran durch Zugabe von 200 Mikrolitern 2X SSC und entfernen Sie die Restlösungen vollständig mit einem Vakuum.Zerlegen Sie das Dot-Blot-Gerät. Nehmen Sie dann die Membran heraus und spülen Sie die gesamte Membran mit 20 Millilitern 2X SSC aus. Trocknen Sie die Membran 20 Minuten lang an der Luft.Um die Membran weiter zu trocknen, backen Sie sie bei 80 Grad unter Vakuum zwei Stunden lang. Geben Sie die Blockierungslösung in die Membran und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach dem Verwerfen der Blockierungslösung werden die verdünnten 5-hmC- oder 5-mC-Antikörper zur Membran hinzugefügt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.Waschen Sie die Membran dreimal 10 Minuten lang mit TBST, um restliche Antikörper zu entfernen. Nachdem Sie den TBST gründlich entfernt haben, fügen Sie der Membran einen HRP-konjugierten Sekundärantikörper hinzu. Inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Membran dreimal 10 Minuten lang mit TBST. Fügen Sie der Membran schließlich ECL-Western-Blotting-Substrat hinzu, um 5-hmC-Signale mit einem Chemilumineszenzdetektor zu visualisieren. Ein repräsentatives Quantifizierungsergebnis der CiDER-vermittelten 5-hmC-Produktion mittels Durchflusszytometrie ist hier dargestellt.Nur Zellen, die CiDER unter Rapamycin-behandelten Bedingungen exprimieren, zeigen einen signifikanten Anstieg der 5-hmC-Spiegel. Ein repräsentatives Ergebnis der globalen Veränderung des 5-hmC-Spiegels in der gesamten Zellpopulation mittels Dot-Blot-Assay ist hier dargestellt. Die Beladungskontrolle wird durch die Ethylenblau-Färbung der Gesamtmengen der Eingangs-DNA visualisiert.Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Rapamycin eine robuste Produktion von 5-hmC in CiDER-exprimierenden HEK293T Zellen mit vernachlässigbarer Hintergrundaktivität induziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Epigenetik, um die zelluläre Funktion zu erforschen, ohne den genetischen Code zu verändern, und die Beziehungen zwischen Epigenotyp und Phänotyp in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Beschrieben wird ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung Kennzeichnung β-Glucosyltransferase (β-GT), um ein Azid-Glukose zu 5-HMC übertragen, gefolgt von Klickchemie einen Linker Biotin für die einfache und dichteunabhängigen Anreicherung zu übertragen. Dieses effiziente und spezifische Kennzeichnung Methode ermöglicht die Anreicherung von 5-HMC mit extrem niedrigen Hintergrund und hohem Durchsatz epigenomischen Mapping über Next-Generation-Sequenzierung.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

DNA und Proteine ​​sequenzspezifisch mit Affinität oder fluoreszierenden Reportergruppen mit DNA- oder Protein-Methyltransferasen und synthetischen Cofaktor-Analoga bezeichnet. Abhängig von der Cofaktor-Spezifität der Enzyme, Aziridin- oder doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden für ein- oder zweistufige Kennzeichnung verwendet.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Restriktionsendonukleasen mit neuer Sequenzspezifität können aus Enzymen entwickelt werden, die eine teilweise degenerierte Sequenz erkennen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das wir erfolgreich verwendet haben, um die Sequenzspezifität des NlaIV-Enzyms zu verändern. Wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die In-vitro-Kompartimentisierung der Transkriptions-/Übersetzungsreaktion und die Auswahl von Varianten mit neuen Sequenzspezifitäten.

In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um DNA-Modifikationen in Bakteriophagen mit Hilfe des NgTET-Enzyms zu reduzieren, das eine effiziente und narbenfreie CRISPR-Cas-Mutagenese ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Gentechnik von Phagen für Anwendungen in der Biotechnologie und Phagentherapie.

Präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen

Dieses Protokoll beschreibt ein nicht-integratives, episomales CRISPR/dCas9-basiertes System zur gezielten epigenetischen Editierung in K562-Zellen, das dCas9-DNMT3A- und dCas9-HDAC1-Effektoren mit spezifischen sgRNAs kombiniert, um eine locusspezifische DNA-Methylierung mit Präzision und reduzierten Off-Target-Effekten zu induzieren.

Epigenetisches Engineering von K562-Zellen: Dual-Vektor-Episomalstrategie für eine stabile gezielte DNA-Methylierung mit dCas9-DNMT3A- und -HDAC1-Fusionsproteinen

Erfahren Sie die CiDER-Methode zur chemisch induzierbaren DNA-Hydroxymethylierung in Säugetierzellen. Diese Technik ermöglicht zeitliche Kontrolle epigenetischer Zustände und eröffnet neue Einblicke in die Genregulation.

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

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