Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

Das übergeordnete Ziel dieser Versuchsreihe ist es, ein künstlich hergestelltes Split-TET2-Enzym namens CiDER in Säugetierzellen einzuführen, um induzierbare DNA-Modifikationen wie Hydroxymethylierung sowie epigenetische Remodellierung zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Epigenetik zu beantworten, wie z. B. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das manipulierte Split-TET2-Enzym die zeitliche Kontrolle der 5-Methylcytosin-Oxidation und den anschließenden Umbau epigenetischer Zustände in Säugetierzellen mit chemischen Zusätzen ermöglicht. Um dieses Verfahren zu beginnen, kultivieren Sie eine adhärente Zelllinie in DMEM, die mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS sowie 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin ergänzt wird.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2. Transfizieren Sie die Zellen mit dem CiDER-Plasmid, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das Transfektionsreagenzien-haltige Medium durch frisches vollständiges DMEM. Um die Zellen chemisch zu induzieren, geben Sie 20 Mikroliter verdünntes Rapamycin zu den transfizierten Zellen, die in zwei Millilitern Medium gehalten werden, um eine Endkonzentration von 200 Nanomolar zu erreichen. Um eine Durchflusszytometrie durchzuführen, resuspendieren Sie die transfizierten und Rapamycin-induzierten Zellen in FACS-Puffer.

Verwenden Sie für die Kontrollgruppe CiDER-exprimierende Zellen ohne Rapamycin-Behandlung. Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie dann zwei normale Salzsäure in die Zellen, um die DNA 10 Minuten lang zu denaturieren.

Nach der Neutralisierung und Blockierung der Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, geben Sie den verdünnten Anti-5hmC-Antikörper zu den Zellen. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit FACS-Puffer.

Entfernen Sie den FACS-Puffer gründlich. Geben Sie einen verdünnten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper für die FACS-Analyse hinzu und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit FACS-Puffer

Nach dem Waschen sind die Proben bereit für die FACS-Analyse. Isolierung genomischer DNA aus transfizierten und Rapamycin-induzierten Zellen mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe CiDER-transfizierte Zellen ohne Rapamycin-Behandlung.

Heizen Sie den Vakuumschrank auf 80 Grad Celsius vor. Weichen Sie die Nitrozellulosemembran in doppelt destilliertem Wasser und dann 10 Minuten lang in 6X SSC-Puffer ein. Laden Sie als Nächstes 60 Mikroliter der gleichen Menge DNA auf eine 96-Well-PCR-Platte.

Geben Sie 30 Mikroliter TE-Puffer in die Rest-Wells. Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen vertikal auf der 96-Well-Platte durch, indem Sie 30 Mikroliter Lösung in Reihe eins auf die gleiche Säulenposition in Reihe zwei übertragen. Erneut mischen und 30 Mikroliter Lösung in die Vertiefungen in der folgenden Reihe umfüllen, bis die Grenze erreicht ist.

Entnehmen Sie dann die letzten 30 Mikroliter aus der Vertiefung. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids und 10 millimolare EDTA in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und erhitzen Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um den DNA-Duplex vollständig zu denaturieren.

Kühlen Sie die Proben sofort auf Eis ab. Geben Sie 50 Mikroliter eiskaltes, zwei molare Ammoniumacetat in jede Vertiefung und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis. In der Zwischenzeit bauen Sie das Dot-Blot-Gerät mit der vorgetränkten Membran zusammen.

Entfernen Sie den Restpuffer mit einem vollständigen Vakuum. Waschen Sie die Membran, indem Sie 200 Mikroliter TE-Puffer in jede Vertiefung des Dot-Blot-Geräts geben. Schalten Sie das Vakuum ein, um den TE-Puffer zu entfernen.

Laden Sie als Nächstes die denaturierte DNA in jede Vertiefung des Dot-Blot-Geräts. Schalten Sie das Vakuum ein, um die Lösung zu entfernen. Waschen Sie die Membran durch Zugabe von 200 Mikrolitern 2X SSC und entfernen Sie die Restlösungen vollständig mit einem Vakuum.

Zerlegen Sie das Dot-Blot-Gerät. Nehmen Sie dann die Membran heraus und spülen Sie die gesamte Membran mit 20 Millilitern 2X SSC aus. Trocknen Sie die Membran 20 Minuten lang an der Luft.

Um die Membran weiter zu trocknen, backen Sie sie bei 80 Grad unter Vakuum zwei Stunden lang. Geben Sie die Blockierungslösung in die Membran und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach dem Verwerfen der Blockierungslösung werden die verdünnten 5-hmC- oder 5-mC-Antikörper zur Membran hinzugefügt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.

Waschen Sie die Membran dreimal 10 Minuten lang mit TBST, um restliche Antikörper zu entfernen. Nachdem Sie den TBST gründlich entfernt haben, fügen Sie der Membran einen HRP-konjugierten Sekundärantikörper hinzu. Inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Membran dreimal 10 Minuten lang mit TBST. Fügen Sie der Membran schließlich ECL-Western-Blotting-Substrat hinzu, um 5-hmC-Signale mit einem Chemilumineszenzdetektor zu visualisieren. Ein repräsentatives Quantifizierungsergebnis der CiDER-vermittelten 5-hmC-Produktion mittels Durchflusszytometrie ist hier dargestellt.

Nur Zellen, die CiDER unter Rapamycin-behandelten Bedingungen exprimieren, zeigen einen signifikanten Anstieg der 5-hmC-Spiegel. Ein repräsentatives Ergebnis der globalen Veränderung des 5-hmC-Spiegels in der gesamten Zellpopulation mittels Dot-Blot-Assay ist hier dargestellt. Die Beladungskontrolle wird durch die Ethylenblau-Färbung der Gesamtmengen der Eingangs-DNA visualisiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Rapamycin eine robuste Produktion von 5-hmC in CiDER-exprimierenden HEK293T Zellen mit vernachlässigbarer Hintergrundaktivität induziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Epigenetik, um die zelluläre Funktion zu erforschen, ohne den genetischen Code zu verändern, und die Beziehungen zwischen Epigenotyp und Phänotyp in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen.