Name: Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer humaner Keratinozyten aus Haut von Erwachsenen für in-vitro-Studien zur kutanen Biologie. Diese Methode ermöglicht Forschern, epidermale Zellbiologie und entzündliche Hauterkrankungen zu untersuchen.

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Der Autor bedankt sich bei Annette Blak Rasmussen und Kristine Moeller für ihre technische Unterstützung

Die Sammlung von Hautproben von gesunden Erwachsenen Probanden einer plastischen Operation erfordert Genehmigung durch die Ethik-Kommission in den Einrichtungen. Dieses Protokoll wurde von der regionalen ethischen Ausschuss der Region Midtjylland, Dänemark (M-20110027) genehmigt. Die hier beschriebene Methode leitet sich von ähnlichen Studien von Maciaq Et al. 10 und Liu und Karasek11.
1. Isolation von Keratinozyten aus der menschlichen Haut
<ol>
	<li>Beginnen, indem Sie die folgenden Lösungen: 50 mL Lösung von 0,25 % Trypsin und 0,1 % Glukose in DPBS. Mischung und Filter zu sterilisieren (0,2 µm) die Lösung. 10 mL RPMI-1640 + 2 % FBS Lösung, 50 mL des DPBS und Keratinozyten serumfreien Medium (KSFM) vorzubereiten. 500 mL KSFM KSFM Ergänzungen und 250 µL Gentamycin hinzufügen. Vorwärmen der Lösungen auf 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Haut von gesunden Erwachsenen Probanden einer plastischen Operation zu sammeln. Die Hautproben verwendet sind ca. 10 cm x 15 cm, aber können in der Größe variieren. Halten Sie die Haut kühl unter Transport durch den Transport der Hautproben in einer Styropor-Box mit einem Kühlelement. Bei Bedarf kann die Hautprobe über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Fett unter der Haut-Sektion mit sterilisierten Scheren, Skalpelle und Pinzetten.</li>
	<li>Schnalle aus Abschnitt Haut (ca. 10 cm x 15 cm) auf eine sterile Abdeckung oben auf einen Teller mit Nadeln. Zuerst reinigen Sie die Haut mit einem trockenen steriler Gaze-Pad. Dann reinigen Sie die Haut mit einem sterilen Tupfer mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Mit einem Fuß-Hobel, der obersten Hautschicht (Epidermis) des Abschnitts Haut schneiden Sie und legen Sie es in einem 9 cm Petrischale. Fügen Sie dann sofort 25 mL der DPBS/Trypsin/Glucose-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1) in der Petrischale. 30 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Mit einer Pipette entfernen Sie die DPBS/Trypsin/Glukose-Lösung aus der Petrischale und 10 mL RPMI-1640 + 2 % FBS, die Trypsin zu inaktivieren.</li>
	<li>Mit zwei Pinzetten, lassen Sie jetzt die Epidermiszellen in das Medium durch sanft kratzen und rühren die epidermalen und dermalen Abteil des die Hautpartien.</li>
	<li>Filtern der epidermalen Zellsuspension durch einen Metallfilter (1 mm Lochgröße), und sammeln Sie in einem 50 mL-Tube. Hinzu kommt der übrigen Haut eine 50 mL-Tube mit 10 mL RPMI-1640 ohne FBS und Vortex für 10 S. Filter filtern die Aussetzung durch das Metall in ein 50 mL-Tube mit der epidermalen Zellsuspension. Einem Gesamtvolumen von 50 mL DPBS hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 450 X g bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der epidermalen Zelle Pellet in ca. 10 mL von 37 ° C KSFM abhängig von der Größe des Pellet-Zelle. Zählen Sie die Zellen mit dem Trypan blau Färbung Methode unter Mikroskop. Die Anzahl der Zellen aus einen 10 x 15 cm-Haut-Abschnitt ist ca. 50-100 x 106 Zellen. Übertragen Sie an jedem 75 cm2 Kultur Kolben, 8 x 106 Zellen zusammen mit 12 mL von 37 ° C KSFM. Schütteln Sie die Kulturflaschen um gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Keratinozyten in einem Inkubator 37 ° C mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Ändern Sie das Medium nach 2 Tagen und dreimal wöchentlich. Durchgang-Zellen, wenn die Kultur Zusammenfluss von 70-80 %, was ungefähr 2 Wochen je nach die Proliferationsrate der Keratinozyten dauert.</li>
</ol>
(2) Passagierung der Keratinozyten
<ol>
	<li>Erhitzen Sie die entsprechende Menge an Trypsin-EDTA-Lösung 0,05 % auf 37 ° C im Brutschrank. Verwenden Sie 4,5 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung für eine 75 cm2 Kultur Kolben.</li>
	<li>Entfernen Sie Mittel aus den Zellen zu, und fügen Sie 4,5 mL/75 cm2 Kultur Flasche 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen vorgewärmt. Legen Sie den Kultur-Kolben in den Inkubator (37 ° C) und nach ca. 5 min unter dem Mikroskop zu prüfen Sie, ob die Zellen lösen gestartet haben.</li>
	<li>Bei etwa 50 % der Zellen gelockert haben, schlagen Sie sanft den Kultur-Kolben gegen die Hand, die restlichen Zellen zu lösen. Fügen Sie dann um die Trypsin zu inaktivieren, 6 mL RPMI-1640 + 2 % FBS (37 ° C) in den 75 cm2 Kultur Kolben und übertragen Sie die Zellsuspension auf 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie die Kulturflaschen mit 3 mL RPMI 1640 + 2 % FBS und Hinzufügen der 50 mL-Tuben. Zentrifugieren Sie Zellen für 10 min bei 450 X g bei Raumtemperatur.
	<ol>
		<li>Aufschwemmen der gebeizte Zellen in 10 mL KSFM (37 ° C). Zählen der Zellen und 3 x 106 Zellen auf ein 150 cm2 Kultur Fläschchen mit 20 mL KSFM (37 ° C) übertragen. Schütteln Sie den Kultur-Kolben um gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Einfrieren der Zellen, wenn die Kultur ist 80-90 % konfluierende, die dauert ca. 4-6 Tage je nach die Proliferationsrate der Keratinozyten (siehe Abschnitt 3, Einfrieren Protokoll unten). Erweitern Sie die Keratinozyten um entsprechende gefrorenen Vorräte zu generieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(3) Einfrieren von Keratinozyten
<ol>
	<li>Erhitzen Sie die entsprechende Menge an Trypsin-EDTA-Lösung 0,05 % auf 37 ° C im Brutschrank. Verwenden Sie 9 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung für ein 150 cm2 Kultur Kolben.</li>
	<li>Entfernen Sie Mittel aus den Zellen zu, und fügen Sie 9 mL/150 cm2 Kultur Flasche 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen vorgewärmt. Legen Sie den Kultur-Kolben in den Inkubator (37 ° C) und nach ca. 5 min unter dem Mikroskop zu prüfen Sie, ob die Zellen lösen gestartet haben.</li>
	<li>Bei etwa 50 % der Zellen gelockert haben, schlagen Sie sanft den Kultur-Kolben gegen die Hand um die verbleibenden Zellen zu lösen. Fügen Sie dann um die Trypsin zu inaktivieren, 12 mL RPMI-1640 + 2 % FBS (37 ° C) in den 150 cm2 Kultur Kolben und aspirieren der Zellsuspension auf 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie die Kulturflaschen mit 6 mL RPMI 1640 + 2 % FBS und Hinzufügen der 50 mL-Tuben. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 450 X g bei 4 ° C. Bereiten Sie eiskalte Zelle Medium (KSFM + 10 % DMSO) Einfrieren.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in KSFM + 10 % DMSO, zählen die Zellen und Zellen bei einer Dichte von 6 x 106 Zellen/mL mit standard langsam-Einfrieren Kryokonservierung Methoden12einfrieren.</li>
	<li>Die Keratinozyten in flüssigem Stickstoff (Dampfphase) erst unmittelbar vor Gebrauch zu speichern.</li>
</ol>
(4) Auftauen und Kultivierung gefrorenen Keratinozyten
<ol>
	<li>Tauen Sie schnell die entsprechenden gefrorenen Fläschchen in einem 37 ° C-Wasserbad. Verwenden Sie 70 % Ethanol, reinigen Sie die Außenseite der Cryoröhrchen. Die entsprechende Anzahl von Zellen (ca. 15.000 Zellen/cm2) auf einem Kultur-Kolben übertragen und sofort den Kultur-Kolben vorgewärmt Wachstumsmedium (KSFM) hinzufügen. Jede Größe von Kulturflaschen kann je nach Aufbau des Experiments verwendet werden.</li>
	<li>Verwenden Sie 5 mL Kulturmedium für eine 25 cm2 Kultur Kolben.</li></ol>Die Anzahl der Zellen hinzugefügt, dass die Kultur-Flasche variieren kann, da das Wachstum der Zellen vom Spender, Spender variiert. Inkubieren Sie Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
	<li>Änderung des Mediums nach 2 Tagen und dreimal Verwendung wöchentlich frisch vorgewärmte KSFM. Hinweis: Unsere Daten haben gezeigt, dass durchschnittlich 95 % der Zellen isoliert von dem hier beschriebenen Protokoll positiv für die Keratinozyten-Marker-Cytokeratine-14-13 sind.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
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<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. Der Autor hat keinen Interessenskonflikt.

Hier beschreiben wir, wie primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut leicht zu isolieren und sie in-vitro-Kultur. Dieses Modell kann nützlich sein für Forscher, die Interesse an einem Studium Haut-Krankheiten kann haben eine breite Anwendung für die Untersuchung der epidermalen Zelle Biologie
Einige der Vorteile von dem hier beschriebenen Protokoll ist, dass im Gegensatz zu Keratinozyten isoliert von Neugeborenen Vorhaut erhalten von Neugeborenen männlichen Beschneidung ...

Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers und dient als eine schützende Barriere gegen die Außenwelt. Die Haut besteht aus zwei Schichten: die Dermis und Epidermis, wo die Epidermis die äußerste Schicht der Haut bildet. Die am häufigsten vorkommenden Zelltyp in der Epidermis ist die Keratinozyten, bestehend aus mehr als 95 % der Zelle Masse1,2. Die Keratinozyten werden in verschiedenen Stadien der Differenzierung in der Epidermis und gliedern sich in basalen, abstehenden, körnige und verhornten Schichten, die bestimmte Phasen der Differenzierung3entsprechen. Die primäre Funktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, wodurch eine intakte Barriere nach außen zur Verfügung zu stellen.
Die Keratinozyten auch die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger in der Haut darstellen und daher eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunantwort4,5. Exposition der Keratinozyten auf äußere Reize führt zu einer Aktivierung der intrazellulären Signalwege und anschließend Produktion einer Reihe von verschiedenen Entzündungsmediatoren wie Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide. Diese Keratinozyten gewonnenen Proteinen beteiligt die entzündliche Reaktion durch die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen wie dendritische Zellen, Neutrophilen und spezifische T-Zellen6,7. So weil Keratinozyten in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen, war das Grundprinzip hinter der hier vorgestellten Technik erzeugen eine in-Vitro -Modell, um die Haut Biologie zu studieren. Primären Keratinozyten Kulturen gewonnenen neonatale Vorhaut werden häufig verwendet, um Haut Biologie8,9zu studieren. Jedoch mit der hier beschriebenen Technik Keratinozyten aus beiden Geschlechtern ergeben sich wiederum eine höhere biologische Vielfalt der Zellen.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Generierung von primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Haut, einschließlich Wartung und das Einfrieren der Keratinozyten. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die primären menschlichen Keratinozyten zu generieren, die als Modell kann, zur kutanen Biologie in-vitro-Studie verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>KSFM Ergänzungen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Ergänzungen für KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimethylsulfoxid</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Zellkulturmedium Additiv</td></tr><tr><td>Sterilisationsfilter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Spritzenvorsatzfilter mit einer Porengröße von 0,2 &; Mikro; m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Wird verwendet, um Zellen zu trypsinisieren</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Wird verwendet, um Trypsin zu inaktivieren</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td></td> <td>-</td> <td>Pinzetten von jedem Unternehmen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Schere</td><td>-</td><td>-</td><td>Scheren von jeder Firma können verwendet werden</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Skalpelle von jeder Firma können verwendet werden</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td> <td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mullpolster</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Mullpolster von jedem Anbieter können verwendet werden</td></tr><tr><td>Fußhobel</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Fußhobel von jedem Anbieter kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Petrischalen aller Anbieter können verwendet werden</td></tr><tr><td>Metallfilter</td><td></td> <td>-</td> <td>Hauseigene Metallfilter mit 1 mm Lochgröße</td></tr><tr><td>75 cm2 Kulturflaschen</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>156499-150 cm2 Kulturflaschen</td><td>TTP</td><td>90151-0,05</td><td></td></tr><tr><td>% Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Zur Trypsinisierung von Zellen während der Passage</td></tr></tbody></table>

generation und kultivierung der primären menschlichen keratinozyten von erwachsenen

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Die Hauptfunktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, eine mechanische Barriere für die Außenwelt erhalten bleibt. Darüber hinaus spielen die Keratinozyten eine wesentliche Rolle bei der Initiierung, Wartung und Regelung der epidermalen Immunantworten als Teil des angeborenen Immunsystems Reaktion auf Antigene Reize schnell und unspezifisch. Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Isolierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut und zeigen, dass diese Zellen auf Kalzium-induzierte terminal Differenzierung, gemessen durch eine erhöhte Expression von Differenzierung Marker Involucrin reagieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass die isolierte Keratinozyten, IL-1β-induzierte Aktivierung des intrazellulären Signalwege reagieren, wie durch die Aktivierung der p38 MAPK Weg gemessen. Zusammengenommen, beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Da die Keratinozyten die vorherrschenden Zelltyp in der Epidermis sind, eignet sich diese Methode zu molekulare Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-Studie.

Kalzium-induzierte Terminal Differenzierung Menschlichen Keratinozyten unterziehen terminal Differenzierung bei der Behandlung mit Kalzium14,15,16. Primären menschlichen Keratinozyten waren isoliert und kultiviert wie im obigen Protokoll beschrieben. Bei ca. 50-60 % Zusammenfluss, die Zellen wurden mit Kalzium (1,2 mM) stimuliert oder Fahrzeug und Bilder der Zellen wurden am Tag 0, 1 und 2. <strong class="xfi...

Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre humane Keratinozyten zu erzeugen, die als Modell für die Untersuchung der kutanen Biologie in vitro verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der epidermalen Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie die Differenzierung menschlicher Keratinozyten reguliert wird oder als Modell für die Untersuchung entzündlicher Hauterkrankungen. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass primäre humane Keratinozyten konventionell aus der Haut von Erwachsenen sowohl von Männern als auch von Frauen isoliert werden können und Haut von Menschen jeden Alters über 18 Jahren umfassen können.Das Verfahren wird von Annette Blak Rasmussen, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Bereiten Sie zunächst eine 50-Milliliter-Lösung aus 0,25 % Trypsin und 0,1 % Glukose in DPBS vor. Mischen und sterilisieren Sie dann die Lösung.Bereiten Sie 10 Milliliter RPMI 1640 plus 2 % FBS, 50 Milliliter DPBS und keratinozyten-serumfreies Medium oder KSFM vor. Fügen Sie KSFM-Ergänzungen und 250 Mikroliter Gentamicin zu 500 Millilitern KSFM hinzu. Dann die Lösungen vor Gebrauch auf 37 Grad Celsius vorwärmen.Sammeln Sie 10 Zentimeter x 15 Zentimeter große Hautproben von gesunden erwachsenen Freiwilligen, die sich einer plastischen Operation unterziehen. Halten Sie die Haut kühl, indem Sie die Hautproben in einer Styroporbox transportieren, die ein Kühlelement enthält. Lagern Sie die Hautprobe bei Bedarf über Nacht bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie mit einer sterilisierten Schere, einem Skalpell und einer Pinzette das Fett unter der Hautpartie. Schnallen Sie dann mit Nadeln den Hautabschnitt auf einer sterilen Abdeckung auf einer Platte aus. Reinigen Sie die Haut mit einem trockenen, sterilisierten Mullkissen.Anschließend 70% Ethanol auf ein sterilisiertes Mullkissen auftragen. Schneiden Sie anschließend mit einem Fußhobel die obere Epidermisschicht des Hautabschnitts ab und geben Sie sie in eine neun Zentimeter große Petrischale. Geben Sie dann sofort 25 Milliliter der zuvor vorbereiteten DPBS-Trypsin-Glukoselösung in die Petrischale.Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie mit einer Pipette die DPBS-Trypsin-Glukoselösung aus der Petrischale und fügen Sie 10 Milliliter RPMI 1640 plus 2 % FBS hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Geben Sie nun mit zwei Pinzetten die Epidermiszellen in das Medium ab, indem Sie sowohl das epidermale als auch das dermale Kompartiment der Hautpartien sanft abkratzen und bewegen.Die epidermale Zellsuspension wird durch einen Metallfilter filtriert und das Filtrat in ein 50-Milliliter-Röhrchen abgefüllt. Die restlichen Hautabschnitte in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern RPMI 1640 ohne FBS geben und 10 Sekunden lang vortexen. Filtern Sie diese Suspension durch den Metallfilter in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das die epidermale Zellsuspension enthält.Fügen Sie dann DPBS zu einem Gesamtvolumen von 50 Millilitern hinzu. Die Zellsuspension wird 10 Minuten lang bei 450-facher G-Temperatur und Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das epidermale Zellpellet je nach Größe des Zellpellets in etwa 10 Millilitern mit 37 Grad Celsius KSFM.Zählen Sie die Zellen mit der Trypanblau-Färbemethode unter dem Mikroskop. Dann wird in jeden 75 Quadratzentimeter großen Kulturkolben achtmal 10 bis zu den sechsten Zellen zusammen mit 12 Millilitern 37 Grad Celsius KSFM überführt. Schütteln Sie die Kulturflaschen vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.Inkubieren Sie die Keratinozyten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium nach zwei Tagen und dann dreimal wöchentlich. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70-80 % erreichen, halten Sie die entsprechende Menge an 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator.Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und geben Sie 4,5 Milliliter pro 75 Quadratzentimeter Kulturkolben mit vorgewärmter 0,05%iger Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen. Nachdem Sie den Kulturkolben etwa fünf Minuten lang in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator gelegt haben, prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen zu lösen begonnen haben. Wenn sich etwa 50 % der Zellen gelöst haben, schlagen Sie den Kulturkolben vorsichtig gegen die Hand, um die verbleibenden Zellen zu lösen.Um das Trypsin zu inaktivieren, geben Sie dann sechs Milliliter 37 Grad Celsius RPMI 1640 plus 2 % FBS in den 75 Quadratzentimeter großen Kulturkolben und überführen Sie die Zellsuspension in 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Kulturkolben mit drei Millilitern RPMI 1640 plus 2 % FBS und geben Sie das Medium in die 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen 10 Minuten lang bei 450-facher G-Temperatur und Raumtemperatur.Verwenden Sie 10 Milliliter 37 Grad Celsius KSFM, um die pelletierten Zellen wieder zu suspendieren. Zählen Sie dann und überführen Sie dreimal 10 zu den sechsten Zellen in einen 150 Quadratzentimeter großen Kulturkolben, zusammen mit 20 Millilitern 37 Grad Celsius KSFM. Schütteln Sie den Kulturkolben vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, bevor Sie die Zellen wieder in den Inkubator einsetzen.Wenn die Kultur zu 80-90 % konfluent ist, spülen Sie die Kulturflaschen nach der Trypsinisierung und dem Transfer der Zellen in 50-Milliliter-Röhrchen, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, mit sechs Millilitern RPMI 1640 plus 2 %FBS und geben Sie es in die 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 450 mal G und vier Grad Celsius. Bereiten Sie dann eiskaltes Gefriermedium vor.Suspendieren Sie das Zellpellet erneut in KSFM plus 10 % DMSO. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, frieren Sie sie bei einer Dichte von sechsmal 10 bis zum sechsten Zellchen pro Milliliter ein, wobei Sie standardmäßige, langsam einfrierende Kryokonservierungsmethoden anwenden. Lagern Sie die Keratinozyten bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff.Wie hier zu sehen ist, wurden humane Keratinozyten isoliert und kultiviert, wie in diesem Video gezeigt, und dann mit Kalzium stimuliert. Diese Bilder zeigen die morphologischen Veränderungen aufgrund der Zugabe von Kalzium an den Tagen eins und zwei im Vergleich zu kontrolliert behandelten Zellen. Neben morphologischen Veränderungen führte die Zugabe von Calcium auch zu einer Erhöhung der Transkription der mRNA für den Differenzierungsmarker Involucrin, 5,5-fach nach 24 Stunden und 3,5-fach nach 48 Stunden.In diesem Experiment wurden kultivierte Keratinozyten über einen unterschiedlichen Zeitraum mit IL-1 beta stimuliert. Wie beim Western Blot zu sehen war, führte die IL-1-beta-Stimulation innerhalb von fünf Minuten zu einer schnellen Aktivierung der Phosphorylierung der p38-MAP-Kinase, da die IL-1-beta-Stimulation keinen Einfluss auf die Gesamtproteinspiegel der p38-MAP-Kinase hatte. Nach einer Stunde kehrte die IL-1-beta-induzierte p38-MAP-Kinase-Phosphorylierung auf das Basalniveau zurück.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der menschlichen epidermalen Zellbiologie, um die Rolle von Keratinozyten bei der angeborenen Immunantwort sowie bei der Hautentwicklung zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre Keratinozyten aus erwachsener menschlicher Haut isoliert und kultiviert, die als Modell für die Untersuchung der Hautbiologie in vitro verwendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Dieses Video beschreibt die Isolierung von Keratinozyten – den prominentesten Zellen der Epidermisschicht der menschlichen Haut, indem eine Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischen Aufschlussmethoden angewendet wird. Diese Methode hilft bei der bevorzugten Züchtung von Keratinozyten gegenüber anderen Hautzelltypen unter Verwendung eines selektiven Wachstumsmediums.

Keratinozytenisolierung in der menschlichen Haut: Eine Methode zur Kultivierung primärer Keratinozyten aus Hautproben

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von genetisch veränderten primären humanen Keratinozyten rekombinanten Retroviren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Genexpression in Keratinozyten zu manipulieren.

Genetische Modifikation primärer humaner Keratinozyten: Eine Methode zur genetischen Manipulation von Keratinozyten mit rekombinanten Retroviren

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein umfassendes und detailliertes Protokoll darüber bereitzustellen, wie genetisch veränderte menschliche organotypische Haut aus epidermalen Keratinozyten und devitalisierter menschlicher Dermis erzeugt werden kann.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um dreidimensionale rekonstituierte menschliche Epidermis reproduzierbar und robust zu kultivieren. Zusätzlich charakterisiert es die Struktur-Funktions-Beziehung des epidermalen Barrieremodells. Die biologischen Reaktionen der rekonstituierten menschlichen Epidermis auf proinflammatorische Reize werden ebenfalls vorgestellt.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen. Eine Bewertungsmethode unter Verwendung von Immunfärbung wird ebenfalls berichtet.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung von frisch gewonnenen (Passage 0) Keratinozyten für die Verwendung in der Lebendzellbildgebung.

Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

Lernen Sie die Isolierung primärer humaner Keratinozyten aus Haut von Erwachsenen für in-vitro-Studien zur kutanen Biologie. Diese Methode ermöglicht Forschern, epidermale Zellbiologie und entzündliche Hauterkrankungen zu untersuchen.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

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