Name: Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Lernen Sie die Messung okulärer Kinematik bei der Rotwangen-Schmuckschildkröte durch In-vitro-Stimulation der Hirnnerven. Diese Elektrophysiologie-Methode ermöglicht präzise Augenbewegungsanalysen ohne Verhaltenstraining.

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Die Autoren danken Frau Paulette McKenna und Lisa Pezzino in dieser Studie für Sekretariat und Herr Phil Auerbach für den technischen Support. Die Autoren danken auch DRS. Michael Ariel und Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) für die Einführung von uns, die in-vitro- isoliert Kopf Vorbereitung. Unterstützung dieser Zusammenarbeit wurde von der Fakultät für Biologie (Robert S. Chase Fund), Academic Research Committee und die Neurowissenschaften Programm am Lafayette College finanziert. Schließlich ist diese Arbeit Herr Phil Auerbach, gewidmet der 28. September 2016 verstorben; er ein Rasterelektronenmikroskop stillgelegt und erkannte den Nutzen seiner 5-Achs-Bühne für den Einsatz in diesem Protokoll. Seine Freundschaft und Einfallsreichtum werden sehr vermisst werden.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wichtige Schritte:
Die entscheidenden Schritte innerhalb dieses Protokolls sind die folgenden: 1) die Zerlegung und die Sorgfalt, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der durchtrennten Nerven; (2) die passenden Größen von saugelektroden, Hirnnerven, konsistente Antworten bereitzustellen; und 3) die Platzierung des Kopfes in den Gimbal, adäquate Kalibrierung der Umdrehungen des Auges zu bieten.
Fehlerbehebung:
Die Dissektion kann eine H...

Begründung für die Verwendung von rot-eared Slider Schildkröten in elektrophysiologischen Experimenten:
Rot-eared Slider Schildkröten (ist Scripta Elegans), gelten als eine der weltweit schlimmsten invasiven Arten1 und können angeben, dass ein Ökosystem in Schwierigkeiten ist. Rot-eared Slider Schildkröten sind deshalb so erfolgreich ist wenig bekannt, aber es kann teilweise durch ihre tolerante Physiologie und des Besitzes von Nervengewebe, die unter hypoxischen Bedingungen2,3,4 überleben können . Verwenden sie für Experimente nicht ihre Zahl gefährdet und mit minimalem Aufwand, elektrophysiologische Vorbereitungen lebensfähig über längere Dauer, so lange wie 18 Stunden5,6 bleiben können. Der Vorteil ist ähnlich wie der Vorteil der Verwendung von wirbellosen Tiere wie Krebse7, die auch geringe Mengen an Sauerstoff8standhalten können.
Techniken zur Messung der Augenbewegungen:
Ansätze zur Messung der Augenbewegungen in Frontal-eyed Tiere mit nicht-menschlichen Primaten sind gut entwickelte9gewesen. Das Auge dreht sich im Orbit um drei Achsen: horizontale, vertikale und Torsionssteifigkeit. Die magnetische Spule Suchmethode gilt allgemein als die zuverlässigste Messung Umdrehungen, aber ist invasiv und erfordert kleine Spulen in den Scleras der Tiere10,11eingefügt werden soll. Video-basierte Systeme können auch Rotationen Messen und haben den Vorteil, nicht-invasiv. Die Entwicklung von besseren Kameras zusammen mit innovativen Bildverarbeitung verbessert ihre Funktionalität, Video-basierte Systeme eine attraktive Alternative zu erwägen,12,13,14.
Techniken entwickelt, die zur Messung der Augenbewegungen in Nonmammals wurden viel weniger bedeutend. Maßnahmen sind entweder niedrige Auflösung oder beschreiben nur einige Umdrehungen15,16,17,18. Der Mangel an Entwicklung kann teilweise auf die Schwierigkeiten bei der Ausbildung Nonmammals, visuellen Ziele Folgen verantwortlich gemacht werden. Obwohl Augenbewegungen auch in rot-eared Slider Schildkröten19,20,21,22,23,24,25 untersucht wurden ,26,27,28,29,30, wegen der Herausforderung in Ausbildung Tiere verfolgen Ziele, die präzise Kinematik des ihre Augenbewegungen ist schlecht verstanden.
Rot-eared Slider Schildkröten gelten in der Regel Lateral-eyed Wirbeltiere, sondern weil sie ihre Köpfe in ihre Schale31vollständig zurückziehen können, erhebliche Okklusion der seitlichen Gesichtsfeld durch die Panzer tritt32. Das Ergebnis ist, dass ihre visuelle Sichtverbindung nach vorne, so dass sie eher wie Frontal-eyed Säugetiere Verhalten gezwungen ist. Ihre Verwendung als Modell für die Entwicklung von Ansätzen zur Messung der Augenbewegungen bietet daher auch eine einzigartige evolutionäre Perspektive.
In dieser Arbeit beschriebene Protokoll verwendet eine in-vitro- isoliert Kopf Vorbereitung um die Kinematik der Augenbewegungen in rot-eared Slider Schildkröten zu identifizieren. Gehirne sind aus den Schädeln der Hirnnerven intakt seziert. Köpfe sind in eine kardanische kalibrieren Augenbewegungen und evozieren Reaktionen durch elektrische Stimulation der Hirnnerven innervieren die Augenmuskeln gelegt. Maßnahmen der Rotationen von den Augen erfolgt durch ein Video-basiertes System mit Software-Algorithmen, die die dunkle Pupille und die Markierungen der Iris zu verfolgen. Die Vorbereitung bietet die Möglichkeit, die Kinematik der beiden extraokulären (d.h., horizontale, vertikale und Torsionssteifigkeit Rotationen) messen32 und intraokularen (d.h. Schüler Änderungen)33 Bewegungen.
Modellsystem zur Analyse der ableitenden Nervenbahnen:
Im Allgemeinen bietet der Ansatz Ermittler die Möglichkeit zu studieren wie ableitenden neuralen Signale generieren Augenbewegungen, wenn Muskeln aus ihren entspannten Zuständen und in Ermangelung von integrierten Sinnesinformationen verarbeitet das Gehirn32beginnen, 33. Daher kann die Auge Kinematik im Modellsystem untersucht werden, in denen sie ausschließlich durch den ableitenden neuronale Weg verlassen das Gehirn und an den muskelsegmenten synapsing verarbeitet werden.

<table><tbody><tr><td>Rotwangen-Gleitschildkröten</td><td>Kons Scientific</td><td>Trachemys scripta elegans</td><td>Große Größe (Panzerlänge 15-20 cm)</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium-Chorid</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M7304</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>C5767</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrierte Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>H7020</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Oakton</td><td>pH 6+</td><td></td></tr><tr><td>Saugstimulationselektrode</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>Bipolare Saugelektrode. Beachten Sie, dass 573000 durch 573050 ersetzt wurde.</td></tr><tr><td>Kapillarglas</td><td>A-M systems</td><td>626000</td><td>Einläufiges Borosilikat-Kapillarglas ohne Mikrofilament, Länge 10 cm, Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,50 mm</td></tr><tr><td>Alternative Sauganregungselektrode</td><td>A-M Systems</td><td>573050</td><td>Bipolare Saugelektrode. Erfordert Kapillarglas mit größerem Durchmesser: 627000, Außendurchmesser 1,2 mm, Innendurchmesser 0,68 mm</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td></td><td>Lieca GZ7</td><td>Vergrößerungsbereich, 10x &ndash; 70x</td></tr><tr><td>Faseroptische Lichtquelle</td><td>Amscope</td><td>HL250-A</td><td>150W Lichtkasten für faseroptische Mikroskopbeleuchtung</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>625654</td><td>Edelstahl, gerade Feder, 5,25"</td></tr><tr><td>Stumpfe Präpariersonde</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>627405</td><td>Huber Mall-Sonde, doppelseitige Sonde und Sucher, 6"</td></tr> <tr><td>Mikroschere</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>Iris Mikrodisparierschere, Edelstahl, 0,5" Klingen, 4,75" lange</td></tr><tr><td>Feinzange</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>F6521</td><td>Juwelierzange, Dumont Nr. 5, Inox-Legierung, 4,25"</td></tr> <tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>Z168696</td><td>Mittlere Spitze, gebogene Pinzette, Edelstahl, 4"</td></tr> <tr><td>Skalpellgriff</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2896</td><td>Skalpellgriffe, Nr. 3, Edelstahl</td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2771</td><td>Skalpellklingen, Nr. 11, Stahl</td></tr><tr><td>Guillotine</td><td>Harvard Gerät</td><td>73-1918</td><td>Kleine Guillotine Typ 7575</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Sigma</td><td>Z648299</td><td>Mikrolöffel und Spatel Wiegeset. Verwenden Sie einen kleinen Spatel: 5,9" lang x 0,07" Durchmesser Griff mit quadratischem Ende: 0,17" x 1,3" lang, andere Endrunde: 0,17" x 1,27" </td></tr><tr><td>langer Haken</td><td>Autozone</td><td>98069</td><td>SureBilt Haken- und Plektrum-Set. Verwenden Sie den Schleifer, um scharfe Spitzen des Hakens zu stumpf zu machen, um Verletzungen des Mauls des Tieres zu vermeiden.</td></tr><tr><td>95/5 % O2/CO2</td><td>Airgas, Inc.</td><td>X02OX95C2003102</td><td>5 % Kohlendioxidbilanz sauerstoffzertifiziertes Standardgasgemisch, Größe 200 Zylinder, CGA-296</td></tr><tr><td>Regler</td><td>Airgas, Inc.</td><td>Y11244D296-AG</td><td>Einstufiger Analysezylinderregler aus Messing 0-100 psi CGA-296 mit Nadelauslass. Verwenden Sie ein verstellbares Luftleitungsventil aus Messing, um von einem Innendurchmesser von 3/8 Zoll zu wechseln, einen Vinylschlauch, der mit dem Regler verbunden ist, einen Innendurchmesser von 3/16 Zoll, einen Luftleitungsanschluss, der zu einer Airstone- oder Glaspasteurpipette führt.</td></tr><tr><td>Verstellbares Airline-Rohrventil</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-12061</td><td>Messingventil</td></tr><tr><td>Starrer Tisch</td><td>Unbekannt</td><td>Unbekannt</td><td>Autoklaventür auf einem stabilen Tisch gelegt. Neun Tennisbälle mit einem Durchmesser von 5 Zoll isolieren Vibrationen von der Oberseite des Tisches.</td></tr><tr><td>5" Tennisball</td><td>Petco Animal Supplies, Inc.</td><td>712868</td><td>Petco Jumbo Pet Tennisball: Die Bälle werden ungeschnitten und in einem integrierten Rahmen an der Unterseite der Autoklaventür gehalten.</td></tr><tr><td>Alternativer Schwingungsisolationstisch</td><td>Newport Corporation</td><td>INT1-36-6-N</td><td>Starres Schwingungskontrollsystem, Integrität 1: Oberflächenabmessungen, 3' x 6'</td></tr> <tr><td>Gimbal</td><td>ISI, International Scientific Instruments, Inc.</td><td>Tisch aus SUPER III-A Scanning EM</td><td>5-Achsen-Euzentertisch: X-, Y- und Z-Linearbewegungen &plusmn; 20 mm, 0,1 mm Präzision; Rotationen, vertikal und plusmn; 10&deg; und horizontal, &plusmn; 12,5 Grad, mit 1,25 Grad; Präzision. Hinweis: aus dem Stilllegungsinstrument.</td></tr><tr><td>Spannfutter für Gimbal</td><td>Unbekannt</td><td>Unbekannt</td><td>Das Spannfutter aus einem alten Mikrotom unbekannter Herstellung wurde so bearbeitet, dass es auf den Schaft des Probenhalters des Scanning EM Tisches</td></tr><tr><td>passt Alternativer Gimbal</td><td>ThorLabs, Inc.</td><td>GN2/M mit MBT602/M</td><td>Zweiachsiges Goniometer (GN2/M), montiert auf einem 3-Achsen-Mikroblocktisch mit Rändelschraubeneinstellern (MBT602/M): Entwerfen Sie ein Spannfutter, um den Schildkrötenkopf mit dem Auge 12,7 mm über der Oberseite des Goniometers zu halten (Abstand zum Drehpunkt)</td></tr><tr><td>Videobasiertes Eye-Tracking-System</td><td>Arrington Research, Inc.</td><td>ViewPoint EyeTracker, PC-60 Tracking-Methode</td><td>: Infrarot-Video mit dunkler Pupille; Schwarz-Weiß-Kamera (Artikel BC02): 30 Hz, 640 x 480; Systemanforderungen: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Sichtbereich: Horizontal +/- 44°; vertikal +/- 20°; Genauigkeit ~0,5&deg;; Räumliche Auflösung ~0,15&deg;; Auflösung der Pupillengröße ~0,03 mm; Augendaten: X, Y-Position des Blicks, Pupillenhöhe und -breite, Torsion, Delta-Zeit, Gesamtzeit und interessante Regionen (ROI); Echtzeitkommunikation (Artikel 0022): 4-Kanal-Analogausgang mit acht TTL-Eingangskanälen zum Markieren von Codes in die Datendatei</td></tr><tr><td>Magnetfuß mit mehreren Positionen</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>Pittsburg, Artikel #5645</td><td>Der Magnethalter erreicht bis zu 12" und erzeugt einen magnetischen Zug von 45 lbs. Verwenden Sie diese Option, um die Kamera zu positionieren. Gewindebohrungen an das Ende der Stange zur Montage von Kameras.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Kopf</td><td>900</td><td>5-Achsen-Manipulation für die Aufnahme der Saugelektrode: X, Y, Z linearer Weg, 2 Drehachsen</td></tr><tr><td>Präparierbereich am Ausleger</td><td>Lieca</td><td>GZ6</td><td>Vergrößerungsbereich, 6,7x &ndash; 40x</td></tr><tr><td>Nerven-/Muskelstimulator</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>Grass S88</td><td>Dual-Puls-Spannungsstimulator: zwei Ausgangskanäle, die unabhängig voneinander betrieben oder synchronisiert werden können, um nicht isolierte Konstantspannungsimpulse (10 mV bis 150 V) zu erzeugen. Die Impulse können einzeln sein (10 &mu; sec bis 10 sec), repetitive (0,01 Hz bis 1 KHz) und Züge (1 ms bis 10 s) und synchronisiert mit TTL-Ein- und Ausgängen. Senden Sie TTL-Ausgänge über die Ausgangskanäle eines DB25-Anschlusses an die TTL-Eingangskanäle des ViewPoint EyeTrackers. Hinweis: Astro-Med Grass Telefactor ist nicht mehr im Geschäft.</td></tr><tr><td>Stromabschaltung</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>PSIU6</td><td>Strom-Stimulus-Isolationseinheit: ermöglicht die sichere Abgabe von Konstantströmen durch das S88 an die Präparation. Der PSIU6 wird über ein BNC-Kabel mit einem der Ausgangskanäle des S88 verbunden. Multiplikatorschalter an der PSIU6 ermöglichen es dem S88, eine breite Palette von Stromamplituden zu erzeugen, die von 0,1 und Mikro reichen. A bis 15 mA.</td></tr><tr><td>Alternativer Nerven-/Muskelstimulator mit Isolierung</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>Isolierter Impulsstimulator: Das Gerät verfügt über einen eingebauten Isolator zur Erzeugung konstanter Ströme.</td></tr></tbody></table>

okuläre kinematik gemessen durch in-vitro- stimulation der hirnnerven in die schildkröte

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Nachdem Tiere eingeschläfert werden, beginnen ihre Gewebe zu sterben. Schildkröten bieten einen Vorteil wegen eine längere Überlebenszeit von ihrem Gewebe, vor allem im Vergleich zu warmblütige Wirbeltiere. Aus diesem Grund können in-vitro- Experimente in der Schildkröten für längere Zeit zu untersuchen, die neuronale Signale und Kontrolle ihrer Ziel-Aktionen durchgeführt werden. Mit einem isolierten Leiter Vorbereitung, wir Maßen die Kinematik der Augenbewegungen in Schildkröten und deren Modulation durch elektrische Signale, die von Hirnnerven durchgeführt. Nachdem das Gehirn aus dem Schädel entfernt wurde, war intakt die Hirnnerven, seziert Kopf in eine kardanische Augenbewegungen zu kalibrieren platziert. Glaselektroden wurden angebracht, um Hirnnerven (okulomotorischen, trochlear, und rectus) und stimulierte mit Strömungen, Augenbewegungen zu erwähnen. Wir überwachen Augenbewegungen mit einem Infrarot-Video-tracking-System und quantifizierte Rotationen der Augen. Strom-Impulse mit einer Reihe von Amplituden, Frequenzen, und Zug Dauer wurden verwendet, um die Auswirkungen auf die Reaktionen zu beobachten. Da die Vorbereitung vom Gehirn getrennt ist, kann der ableitenden Weg zu Muskel-Ziele isoliert untersuchen neuronale Signalisierung bei fehlender zentral verarbeitet sensorische Informationen untersucht werden.

Abbildung 1 zeigt Standbilder von Bilder aus einem Video beschreibt die Dissektion. Bilder bieten typische Standorte der Nerven vor dem Schneiden aus dem Gehirn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56864/56864fig1.jpg"> Abbildung 1: Standbilder von Bildern aus dem Video von der Dissektion anzuzeigenden Standorte der Sehnerv (nII), Oculomotor Nerv (nIII), trochlearis...

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine in-vitro- isoliert Schildkröte Kopf Vorbereitung zu verwenden, um die Kinematik des ihre Augenbewegungen zu messen. Nach der Entnahme des Gehirns aus dem Schädel können Hirnnerven mit Strömungen, Drehungen des Auges und Veränderungen der Pupille Größen quantifizieren angeregt werden.

Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Das übergeordnete Ziel dieses elektrophysiologischen Protokolls ist es, die Möglichkeit zu bieten, die Kinematik der Augenbewegungen der Rotwangenschildkröte mit Hilfe eines in vitro isolierten Kopfpräparats zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im okulär-motorischen Bereich zu beantworten, z. B. wie sich das Sehen bei Schildkröten entwickelt hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Tiere nicht trainiert werden müssen, um Ziele zu verfolgen, und dass ein Gimbal verwendet wird, um ihre Augenbewegungen zu kalibrieren.Diese Technik wird von Steven Nesbit, einem Studenten in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Schildkrötenkopf in einer Sezierschale. Halten Sie genügend Turtle Ringer-Lösung bereit, um das Gewebe zu spülen.Halten Sie das Taschentuch auf vier Grad Celsius, indem Sie Eis um die Außenseite der Schale legen. Führen Sie eine stumpfe Dissektionssonde durch den Mund ein, um die Handhabung des Kopfes zu erleichtern. Schneiden Sie dann bei der Arbeit unter einem Präpariermikroskop mit dem Skalpell das Gelenk durch, das den Zahnknochen mit dem Schädel verbindet.Ziehen Sie anschließend mit Rongeuren den Unterkiefer vom Schädel weg. Ziehen Sie dann die Haut und die Muskeln von ihren Ansätzen im dorsalen und lateralen Bereich des Schädels ab. Nachdem Sie die Wirbelsäule am Cavum-Ende des Schädels identifiziert haben, beugen Sie die Wirbelsäule nach ventral, um das Rückenmark freizulegen, und schneiden Sie das Rückenmark mit einer Mikroschere ab.Verwenden Sie Rongeure, um die Wirbelsäule und anderes Gewebe aus dem Schädel zu entfernen, indem Sie kaudal ziehen. Machen Sie dann zwei oberflächliche Schnitte am dorsalen Schädel, beginnend am Foramen magnum, und ziehen Sie vorsichtig den hinteren Schädel ab. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die Hirnhäute zu entfernen und den Rest des Gehirns freizulegen.Entfernen Sie genügend Hirnhäute, um die Identifizierung der Riechkolben in der vorderen Schädelhöhle zu ermöglichen. Fahren Sie fort, das Gehirn bei Bedarf mit Turtle Ringer-Lösung zu spülen. Als nächstes zogen Sie mit einer gebogenen Pinzette sanft nach kaudal und erzeugten eine leichte Spannung auf die Hirnnerven.Schneiden Sie vorsichtig die Riechkolben und das Großhirn mit einer gebogenen Pinzette ab und entfernen Sie sie. Schieben Sie dann mit einer Mikroschere das Mittelhirn sanft in Richtung Mittellinie und legen Sie die Hirnnerven frei. Hirnnerv drei ist vor Hirnnerv vier zu sehen.Der Durchmesser von Nerv vier ist etwas kleiner als der von Nerv drei. Schneiden Sie dann die linke und rechte Fahrt des Sehnervs oder des Hirnnervs zwei ab. Durchtrennen Sie die Nerven drei und vier, wo sie am Mittelhirn ansetzen.Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite. Kippen Sie den Hirnstamm zur Seite und beobachten Sie, wie der sechste Hirnnerv, der Nervus abducens, in der Nähe des Übergangs von Pons und Medulla aus der ventralen Oberfläche austritt. Den sechsten Hirnnerv sowohl auf der linken als auch auf der rechten Seite durchtrennen.Entfernen Sie die restlichen Teile des Hirnstamms mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere vom Kopf. Sobald der Schädel leer ist, untersuchen Sie den Boden der Schädelhöhle und identifizieren Sie die Nerven drei, vier und sechs. Zum Schluss entfernen Sie die oberen und unteren Augenlider mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere.Setze den Schildkrötenkopf in das Gimbal-Futter ein. Verwenden Sie dann eine kleine Wasserwaage, um zu überprüfen, ob die Rückenfläche des Kopfes parallel zum Horizont ist. Positionieren Sie eines der Augen in der Mitte der horizontalen und vertikalen Drehungen des Gimbal.Richten Sie eine Infrarotkamera 45 Grad über der Sichtlinie des Auges aus. Die Infrarot-LED sollte sich beim Betrachten des Kameraobjektivs auf der 11-Uhr-Position befinden, um die LED entlang des optischen Zugangs des Auges zu zentrieren. Passen Sie den Abstand der Kamera zum Auge so an, dass die Kameraansicht maximal vom Augapfel ausgefüllt wird.Stellen Sie sicher, dass sich die Augenwinkel an den Rändern der horizontalen Ansicht befinden. Fokussieren Sie die Kamera, um ein klares Bild des Auges zu erhalten. Verwenden Sie dann die drei Stufen der linearen Einstellung, die mit dem Gimbal geliefert werden, um das Auge in der Mitte des Kamerabildes fein zu positionieren.Erkennen Sie die Pupille des Kanals, indem Sie den Schwellenwert und den Kontrast mit dem Programm entsprechend einstellen, das mit dem videobasierten Eye-Tracking-System geliefert wird. Klicken Sie mit der Maus auf das Menü Video und wählen Sie unter Modus die Option Hohe Präzision, um Bilder mit einer Abtastrate von 30 Hertz aufzunehmen, was eine Auflösung von 640 Pixeln x 480 Zeilen ergibt. Öffnen Sie außerdem unter Video den Pupillentyp, und wählen Sie Dunkle Pupille und Ellipse, gedrehte Ellipse, für die Pupillensegmentierungsmethode aus.Klicken Sie im EyeCamera-Fenster auf das Symbol zur Anpassung des Pupillensuchbereichs. Ziehen Sie mit der Maus ein Rechteck heraus, das einen Bereich um die Pupille herum begrenzt und dunkle Bereiche vermeidet, die mit der Pupille verwechselt werden könnten. Vergewissern Sie sich dann, dass im Fenster Steuerelemente die Kontrollkästchen für AutoImage und Schwellenwertnachverfolgung für positive Sperren aktiviert sind.Klicken Sie auf AutoThreshold, um die Scandichte zu optimieren, die als grüne Punkte über der dunklen Pupille angezeigt wird. Kalibrieren Sie die Videoanzeige des videobasierten Eye-Tracking-Programms auf die Rotationen des Gimbals und kalibrieren Sie die Torsionsrotation, wie im Text beschrieben. Platzieren Sie ein Lineal in der gleichen Fokusebene wie die Pupille und zeichnen Sie die Breite der gesamten Kameraansicht auf.Um die Elektroden zu positionieren, führen Sie zunächst eine Stift-Referenzelektrode in das am Kopf verbleibende Binde- oder Muskelgewebe ein. Passen Sie die Größe des zu stimulierenden Nervs an eine feuerpolierte Kapillarglasspitze an und platzieren Sie die Glasspitze auf der Saugelektrode. Füllen Sie die Saugelektrode mit Ringerlösung und stellen Sie das Volumen in der Spritze auf etwa die Hälfte ihrer Kapazität ein.Achten Sie darauf, dass die Hirnnerven gut sichtbar sind. Dann, während Sie durch ein am Ausleger montiertes Disparierskop schauen, verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Glasspitze der Elektrode vorsichtig in eine Position über dem geschnittenen Ende des ausgewählten Nervs und unter der Oberfläche der Ringerlösung zu bewegen, die den Schädel füllt. Ziehen Sie den Kolben der Spritze zurück.Das Vakuum zieht den Nerv in das Ende der Kapillarspitze. Verbinden Sie die Saugelektrode über ein Kabel mit der Stromtrennvorrichtung. Verbinden Sie das Kabel von der Pin-Referenzelektrode mit dem Masseanschluss des Trenngeräts.Verwenden Sie die Drehregler und Schalter am Stimulator und an der Isolationsvorrichtung, um die Stimulationsparameter einzugeben. Verwenden Sie einen Strombereich von einem bis 100 Mikroampere mit einer Frequenz von 10 bis 400 Hertz. Verwenden Sie ein oder zwei Millisekundenimpulse in Zügen mit einer Dauer von 100, 500, 1000 Millisekunden.Um das Timing der aktuellen Anwendungen und deren Einfluss auf die Augenbewegungen zu visualisieren, klicken Sie auf das Menü PenPlots. Wählen Sie "X-Blickposition", "Y-Blickposition", "Torsion" und "Pupillenbreite" aus, um Echtzeit-Rohdatendarstellungen der X- und Y-Augenpositionen, der Torsion und der Pupillenbreite anzuzeigen. Wählen Sie außerdem im Menü "Stiftplots" die Optionen "Sekunden" und "Marker" aus, um das Timing-Diagramm mit Teilstrichen anzuzeigen, die in Intervallen von einer Sekunde angezeigt werden.Um den Überblick über die Art der angewendeten Ströme zu behalten, klicken Sie auf das Windows-Menü und wählen Sie DataPad. Das Fenster KeyPad, DataMarker wird angezeigt. Klicken Sie auf den Buchstaben oder die Zahl, um die Parameter der aktuellen Stimulationen zu identifizieren, die an den Nerv abgegeben werden, und analysieren Sie die Daten, wie im Protokolltext beschrieben.Diese Spur zeigt den mittleren Pupillendurchmesser von sechs Stimulationen in einem Präparat, die gestrichelten Linien zeigen die Standardabweichung. Die rechteckige Wellenform auf der x-Achse bezeichnet den Beginn und Offset eines 100-Hertz-Zuges von Ein-Millisekunden-Impulsen mit einer Amplitude von 50 Mikroampere. Diese Skizze zeigt die Ausrichtung der Irislinie im Auge vor der Stimulation.Dieses Bild zeigt ein Standbild aus einer repräsentativen Studie vor der Stimulation. Dieses Bild zeigt das Auge während der Stimulation. Hier ist das Auge nach der Stimulation zu sehen.Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, dass Sie sich während der Dissektion Zeit nehmen, um die Größe der Saugelektrode an jeden Hirnnerv anzupassen und den Kopf richtig im Gimbal zu platzieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie das Testen verschiedener Temperaturen oder die Anwendung pharmakologischer Wirkstoffe, einschließlich Analgetika, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie diese Faktoren die Augenbewegungen und die Überlebensfähigkeit des Nervengewebes beeinflussen.

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In diesem Video führen wir Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme mit dem amerikanischen...

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Neuronale Steuerung und kognitive Prozesse durch Augenbewegungen untersucht werden. Die Visualeyes Software ermöglicht es dem Bediener, Reize auf zwei Computer-Bildschirme unabhängig voneinander mit Hilfe eines einfachen, benutzerdefinierten Skriptsprache programmieren. Das System kann Tandemaugenbewegungen (Sakkaden und glatten Streben) oder gegenüberliegende Augenbewegungen (Konvergenz) oder eine beliebige Kombination stimulieren.

Visualeyes: ein modulares Softwaresystem für oculomotorius Experimentieren

Video-EOG ist ein sehr quantitative Methode zur okularen motorischen Leistungsfähigkeit zu untersuchen sowie motorischen Lernens. Hier beschreiben wir, wie man Video-Okulographie bei Mäusen zu messen. Die Anwendung dieser Technik auf normalen, pharmakologisch behandelt oder gentechnisch veränderten Mäusen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu Grunde liegenden Physiologie der motorischen Verhaltensweisen zu erforschen.

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Die Entfernung der Augen, auch als Enukleation, bietet eine nützliche Strategie, um Aspekte der visuellen, Cross-Modal und Entwicklungs Plastizität entlang der Säugetier-visuelle System zu studieren, da es teilweise irreversible induziert (monokulare) oder komplett (Fernglas) Verlust der Sehkraft. Hier beschreiben wir eine hoch reproduzierbare und unkomplizierte Ansatz zur in vivo Enukleation durchzuführen.

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Ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung der strukturellen und optischen Anzeigen bei Nagetieren durch optische Kohärenz Tomographie und optokinetischen Reaktion wird vorgestellt. Die Ergebnisse liefern wertvolle Erkenntnisse für die Augenheilkunde sowie neurologische Forschung.

Mit optischen Kohärenztomographie und optokinetischen Antwort als strukturelle und funktionelle visuelles System auslesen bei Mäusen und Ratten

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

VisualEyes2020 (VE2020) ist eine benutzerdefinierte Skriptsprache, die visuelle Augenbewegungsreize darstellt, aufzeichnet und synchronisiert. VE2020 liefert Stimuli für konjugierte Augenbewegungen (Sakkaden und sanfte Verfolgung), diskonjugierte Augenbewegungen (Vergenz), Akkommodation und Kombinationen aus beidem. Zwei Analyseprogramme vereinheitlichen die Datenverarbeitung aus dem Eye-Tracking- und dem Unterkunftsaufzeichnungssystem.

Quantifizierung okulomotorischer Reaktionen und Akkommodation durch Instrumentierung und Analyse-Toolboxen

Hier beschreiben wir ein Standardprotokoll zur Quantifizierung des optokinetischen Reflexes. Es kombiniert virtuelle Trommelstimulation und Video-Okulographie und ermöglicht so eine präzise Bewertung der Merkmalsselektivität des Verhaltens und seiner adaptiven Plastizität.

Quantifizierung der visuellen Merkmalsselektivität des optokinetischen Reflexes in Mäusen

Wir beschreiben hier PyOKR, eine halbautomatische quantitative Analysemethode, die Augenbewegungen direkt misst, die sich aus visuellen Reaktionen auf zweidimensionale Bildbewegungen ergeben. Eine Python-basierte Benutzeroberfläche und ein Analysealgorithmus ermöglichen einen höheren Durchsatz und genauere quantitative Messungen von Eye-Tracking-Parametern als bisherige Methoden.

PyOKR: Eine halbautomatische Methode zur Quantifizierung der Fähigkeit zur Verfolgung optokinetischer Reflexe

Die Methodik untersuchte visuelle und vestibuläre Beiträge zur Blickstabilisierung während optokinetischer und Ganzkörperrotationen. Die Stimulation erfolgte durch visuelle, vestibuläre und visuovestibuläre Studien. Die Torsions-Augenbewegungsverstärkung und die Nystagmusfrequenzen dienten als Indikatoren für die subkortikale Weiterleitung sensorischer Bewegungsinformationen an die reflexive Hirnstammreaktion für jeden Versuch.

Verwendung von Eye-Tracking zur Beurteilung der relativen Bedeutung von visuellem und vestibulärem Input für die subkortikale Bewegungsverarbeitung in der Rollebene

Lernen Sie die Messung okulärer Kinematik bei der Rotwangen-Schmuckschildkröte durch In-vitro-Stimulation der Hirnnerven. Diese Elektrophysiologie-Methode ermöglicht präzise Augenbewegungsanalysen ohne Verhaltenstraining.

Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte

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