Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen in C.elegans zu induzieren. Diese Methode kann dabei helfen, die Bedeutung biologischer Prozesse, wie z.B. Signalwege oder Epigenetik, bei der Regulation der zellulären Schicksalsumprogrammierung zu untersuchen. Der Hauptvorteil der in diesem Video beschriebenen Methode besteht darin, dass in lebenden Tieren Keimzellen durch die Überexpression eines schicksalsauslösenden Transkriptionsfaktors herausgefordert werden können.

Parallel dazu kann ein genetisches Screening, wie z. B. ein RNAi-Screening, durchgeführt werden, um neue Faktoren zu identifizieren, die an der Regulierung der zellulären Reprogrammierung beteiligt sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die regenerative Therapie. Denn mit dieser in vivo-Methode könnte die zelluläre Reprogrammierung unter verschiedenen Entwicklungs- und Umweltbedingungen untersucht werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Neuprogrammierung schwer zu erlernen sind. Denn der Phänotyp der Umwandlung von Keimzellen in Neuronen nach Erschöpfung von lin-53 findet nur unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen statt. Für die RNAi-Platten laden Sie sechs Zentimeter große Platten mit NGM-Agar, der IPTG und Carbenicillin enthält.

Lassen Sie sie 24 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Übertragen Sie sie dann für bis zu 14 Tage auf vier Grad Celsius. Als nächstes werden selektive Platten, die Carbenicillin und Tetracyclin enthalten, mit RNAi-Bakterienklone mit L4440-Plasmid versehen, das das lin-53-Gen trägt.

Verwenden Sie ein dreiphasiges Streifenmuster, und stellen Sie sicher, dass Sie ein leeres Vektorsteuerelement plattieren. Lass die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen. Am nächsten Tag wählen Sie mindestens drei einzelne Völker aus und impfen Sie jede von ihnen in ein separates Kulturröhrchen mit zwei Millilitern LB, ergänzt mit Carbenicillin, aber nicht mit Tetracyclin.

Planen Sie drei gesunde Kulturen pro Zustand ein. Als nächstes züchten Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius, bis sie eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,6 bis 0,8 erreichen. Geben Sie dann 500 Mikroliter jeder Bakterienkultur auf eine sechs Zentimeter große NGM-Agar-RNAi-Platte.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dieses Protokoll ist optimiert für BAT28-Stammwürmer, die bei 15 Grad Celsius gehalten werden, bei denen die Transgene am stabilsten sind. Details zur Genetik der Stämme finden Sie im Text.

Die Alterssynchronisierung der Würmer ist entscheidend. Verwende die Bleichtechnik. Waschen Sie sechs Zentimeter große NGM-Agarplatten mit adulten Tieren und Eiern mit 800 Mikrolitern M9. Dann werden die Würmer durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand entfernt.

Geben Sie anschließend 1/2 bis einen Milliliter Bleichlösung zu den Würmern. Und während Sie die Würmer unter einem Stereoskop beobachten, schütteln Sie die Röhre, bis die erwachsenen Würmer aufplatzen, und sammeln Sie dann die Eier ein. Trennen Sie nun den Abfall von den Eiern.

Zuerst zentrifugieren Sie das Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie dann das Pellet aus dem Taschentuch dreimal mit 800 Mikrolitern M9. Achten Sie darauf, eine Zentrifugation zu verwenden, um das Gewebe zwischen den Waschgängen zu sammeln.

Übertragen Sie nun die gereinigten Eier auf frische NGM-Platten, die mit OP50-Bakterien besiedelt sind. Überprüfen Sie kurz, ob die Embryonen erfolgreich isoliert und auf die NGM-Platten übertragen wurden. Züchten Sie die Tiere bei 15 Grad Celsius.

Um eine Umwandlung von Keimzellen in Neuronen nach der Erschöpfung von lin-53 zu erreichen, muss die Erschöpfung in der elterlichen Generation beginnen. Um lin-53 zu depletieren, werden L4-Tiere RNAi unterzogen. Übertragen Sie 50 L4-Würmer pro Replikat manuell auf eine NGM-RNAi-Platte ohne Bakterien.

Verwende einen Platindraht. L4-Würmer sind an einem weißen Fleck etwa auf halber Höhe ihrer Bauchseiten zu erkennen. Inkubieren Sie die Würmer nun bei 15 Grad Celsius im Dunkeln für etwa sieben Tage.

Das IPTG ist lichtempfindlich. Wenn die F1-Nachkommen die Stadien L3 und L4 erreichen, trennen Sie sie von den größeren, dickeren Elterntieren. Zu diesem Zeitpunkt wird das F1 auf den hervorstehenden Vulva-Phänotyp untersucht, was darauf hindeutet, dass die RNAi gegen lin-53 erfolgreich war.

Die RNAi-Aktivität kann auch zur Letalität führen, die auf über 15 Grad Celsius ansteigt. Um che-1 zu aktivieren und die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen in den F1-Nachkommen zu induzieren, schocken Sie die Würmer 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Verwenden Sie einen belüfteten Inkubator, da er einen effizienteren Hitzeschock ermöglicht.

Nach dem Hitzeschock die Platten über Nacht bei 25 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Es ist wichtig, eine Überexpression von che-1 durch Hitzeschock zu vermeiden, bevor die Tiere das mittlere L3-Stadium erreichen. Dies kann zur Expression des che-1-Proteins in nicht zielgerichteten Geweben führen.

Am nächsten Tag stellten Sie eine Fluoreszenzlichtquelle und einen GFP-Filter auf, um die Tiere auf transgene Fluoreszenz im Mittelkörperbereich zu untersuchen. Um die Penetranz des Phänotyps zu beurteilen, ermitteln Sie das Verhältnis der Tiere, die ein Fluoreszenzsignal aussenden. In der Regel zeigen etwa 30 % ein diskretes GFP-Signal.

Zum Vergleich: Bei Tieren, die den leeren Vektor RNAi tragen, ist bei mehr als 5 % der Population nicht einmal ein diffuses Signal in der Keimbahn zu sehen. F1-Tiere, die den hervorstehenden Vulva-Phänotyp aufweisen, verdeutlichen die erfolgreiche Anwendung von lin-53 RNAi. Bei diesen Tieren ist die Umwandlung von Keimzellen in ASE-Neuronen-ähnliche Zellen nach Hitzeschock-Induktion von che-1 üblich.

Bei näherer Betrachtung werden neuronenähnliche Fortsätze sichtbar, die typisch für Neuronen aus Keimbahnzellen sind. Im Gegensatz dazu zeigten leere Vektorkontrollen eine minimale Expression von GFP, die höchstens diffus war. Den Keimzellen dieser Tiere fehlten neuronenähnliche Merkmale.

Wenn die Tiere zum Zeitpunkt der Induktion der che-1-Überexpression noch zu jung waren, zeigten sie oft eine ektopische Transgenexpression in anderen Regionen des Körpers, wie z. B. in der sich entwickelnden Vulva. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Experimente mit lebenden Würmern sorgfältig planen und durchführen, um Keimzellen in Neuronen umzuprogrammieren. Die hier in diesem Video beschriebene Methode ermöglicht es Ihnen nun, die Auswirkungen einer Reihe verschiedener Faktoren auf die Regulation der zellulären Reprogrammierung zu untersuchen.

Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in 10 Tagen durchgeführt werden. Während des Versuchs des Experiments ist es wichtig, die Tiere vor der Einleitung der Reprogrammierung sorgfältig zu inszenieren und den BAT28-Stamm bei 15 Grad zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie doppelte RNAi durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Was sind die zugrundeliegenden Mechanismen, die bei der Umwandlung des Zellschicksals eine Rolle spielen?