Name: Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Lernen Sie die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen in C. elegans durch RNAi und Hitze-Schock-induzierte CHE-1-Expression. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Reprogrammierung in vivo für regenerative Therapieforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Alina El-Khalili und Martina Hajduskova für technische Hilfe. Wir danken Mitglieder des Arbeitskreises Tursun für Kommentare an das Manuskript. Diese Arbeit wurde gesponsert von der ERC-StG-2014-637530 und ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 und stützt sich auf die Max-Biophysik-Centrum für Molekularmedizin in der Helmholtz-Gemeinschaft.

Alle in Bezug auf die Pflege der Tiere hier beschriebene Methoden wurden von der LaGeSo Berlin genehmigt
1. Vorbereitung der Lösung
<ol>
	<li>NGM-Agarplatten (1 L)
	<ol>
		<li>3 g NaCl, 2,5 g Pepton Medien (z. B. Bacto-Pepton) und 20 g Agar-Agar hinzufügen. Nach dem Autoklavieren, fügen Sie 1 mL des Cholesterins (5 mg/mL 95 % EtOH vorrätig), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4und 1 mL Amphotericin B (2,5 mg/mL Brühe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNAi NGM-Agar-Platten (1 L)
	<ol>
		<li>3 g NaCl, 2,5 g Pepton Medien und 20 g Agar-Agar hinzufügen. Nach dem Autoklavieren fügen Sie hinzu, 1 mL des Cholesterins (5 mg/mL 95 % EtOH vorrätig), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4, 1 mL Amphotericin B (2,5 mg/mL Brühe), 1 mL 1 M IPTG , und 1 mL Carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 g Pepton Medien, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl, 20 g Agar, 10 mL von 1 M Tris pH 8.0. 1 L. H2O hinzufügen Nach dem Autoklavieren fügen Sie 1 mL 50 mg/mL Carbenicillin und 2,5 mL von 5 mg/mL Tetracyclin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Medium (1 L)
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 g Pepton Medien, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl und 10 mL 1 M Tris pH 8.0. 1 L. H2O hinzufügen Nach dem Autoklavieren hinzugeben Sie 1 mL 50 mg/mL Carbenicillin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-Puffer (1 L)
	<ol>
		<li>6,0 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl und 50 mg Gelatine hinzufügen. Hinzugeben Sie vor der Benutzung 1 mL 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bleichmittel-Lösung (10 mL)
	<ol>
		<li>Fügen Sie 1 mL NaClO und 2 mL 5 N NaOH. 10 mL H2O hinzufügen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Vorbereitung der RNAi-Platten
Hinweis: C. Elegans ist in der Regel im Labor auf 6 cm Petri Platten mit 7,5 mL Nematoden Wachstum Medium Agar (NGM-Agar)10,11kultiviert. Dieses Protokoll ist optimiert für Würmer gehalten bei 15 ° C. Zur Vorbereitung der Platten mit NGM verwenden Sie standard sterile Techniken, um Pilz- und bakterielle Kontamination zu verhindern. Im folgenden ist das Protokoll, NGM Platten ergänzt mit Reagenzien für RNAi vorzubereiten.
<ol>
	<li>Bereiten Sie 6-cm-NGM-Agar RNAi-Platten mit 1 mM Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) und 50 µg/mL Carbenicillin vor. Für 24 – 48 h bei Raumtemperatur in den dunklen12trocknen lassen.
	<ol>
		<li>Halten Sie RNAi-Platten bei 4 ° C im Dunkeln. Nicht verwenden Sie, wenn älter als 14 Tage.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wählen Sie die RNAi Bakterien (Escherichia coli HT115) Klon mit dem L4440-Plasmid mit Lin-53 -gen-DNA-Sequenz aus dem gefrorenen Glycerin bestand von den verfügbar RNAi Bibliothek13 auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL Carbenicillin und 12,5 µg/mL Tetracyclin mit der Drehstrom-Streifen-Muster. Wachsen Sie die Bakterien bei 37 ° C über Nacht12. Dieser Klon ermöglicht IPTG-abhängige Produktion von Lin-53 DsRNA in den Bakterien.
	<ol>
		<li>Darüber hinaus wachsen Sie RNAi-Bakterien, die das Plasmid L4440 ohne jede Gensequenz als leerer Vektor-Kontrolle-14enthalten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzige Kolonie von Lin-53 oder leerer Vektor LB-Agar-Platten mit einer 200 µL Pipette Tipp und jeder von ihnen in einer eigenen Kultur-Röhrchen mit 2 mL liquid LB mittlere14 ergänzt mit 50 µg/mL Carbenicillin zu impfen. Kulturen über Nacht bei 37 ° C zu wachsen bis zum Erreichen einer optischen Dichte (OD) bei 600 nm von 0,6-0,8. Messen Sie mit einem Spektrophotometer15OD. Achtung: Die Flüssigmedien LB sollte nicht Tetracyclin im Gegensatz zu der LB-Agar-Platte verwendet für die Bakterien aus dem Glycerin bestand seit Aufnahme von Tetracyclin während der Fütterung führt zu einer verminderten RNAi Effizienz 12 Streifen enthalten.</li>
	<li>6 cm RNAi NGM-Agar-Platten mit einem Multipipette fügen Sie 500 µL jeder Bakterienkultur (Lin-53 oder leerer Vektor hinzu). Inkubieren Sie Platten mit einem geschlossenen Deckel über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Während dieser Zeit wird die IPTG in die NGM Platten Produktion von DsRNA in den Bakterien induzieren.
	<ol>
		<li>Verwenden Sie mindestens 3 Platten pro Bakterienkultur pro Versuch. Dies bietet für jedes Experiment 3 Technische repliziert.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lagern Sie getrocknete RNAi NGM-Agar-Platten mit Bakterien bei 4 ° C bis zu zwei Wochen im Dunkeln.</li>
</ol>
3. Vorbereitung von C. Elegans Strain BAT28
<ol>
	<li>Pflegen die Wurm Belastung BAT288 , enthält die transgene otIs305 [Hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] und ntIs1 [Gcy-5prom::gfp] auf OP50 Bakterien mit standard NGM-Agarplatten bei 15 ° C. Hinweis: Für ausführliche Protokoll über Nematoden Kultur, siehe10. Die rol-6(su1006) ist eine dominante Allel und gängigen phänotypischen Injektion Marker16 , die die typische rollende Bewegung verursacht. Es dient zur Nachverfolgung in der otIs305 -Transgen Hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Halten die BAT28 Belastung bei 15 ° C zu allen Zeiten vorsichtig Aktivierung der Vermeidung der Hsp-16.2prom::che-1 Transgen. Reduzieren Sie Temperaturen über 15 ° C beim Umgang mit der Belastung so weit wie möglich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um Alter zu synchronisieren-Würmer nutzen Sie die bleichen Technik17.
	<ol>
		<li>6 cm NGM-Agar-Platten mit Erwachsenen und Eiern von BAT28 mit 900 µL M9 Puffer abwaschen. Pellet-Würmer durch Zentrifugieren bei 900 X g für 1 min. entfernen den überstand.</li>
		<li>Fügen Sie 0,5 – 1 mL der Lösung bleichen und schütteln Sie das Rohr für ca. 1 min bis Erwachsenen Würmer beginnen zu platzen geöffnet. Monitor mit einem standard Stereomikroskop.</li>
		<li>Pellet-Würmer durch Zentrifugieren bei 900 X g für 1 min. entfernen den überstand.</li>
		<li>Waschen Sie das Wurm-Pellet 3 Mal durch Hinzufügen von 800 µL M9 Puffer und bei 900 X g zentrifugieren.</li>
		<li>Legen Sie die gereinigten Eiern auf frischen NGM-Platten mit OP50 Bakterien ausgesät. Wachsen sie gebleicht Einwohner auf OP50 Bakterien bei 15 ° C, bis sie L4-Stadium (ca. 4 Tage) zu erreichen. L4-Larven können durch einen weißen Fleck etwa in der Mitte entlang der Bauchseite der Wurm18 mit einem standard Stereomikroskop erkannt werden. Hinweis: Um die Keimzelle zu Neuron Konvertierung Phänotyp nach Erschöpfung des Lin-53zu erreichen, muss es in der elterlichen Generation (P0) aufgebraucht werden.</li></ol></li></ol>Das Punktesystem für die Konvertierung Phänotyp erfolgt in der folgenden Generation (Filiation F1). Um die zu einem Abbau führen Lin-53 bereits in der P0 zu erreichen, unterliegen L4 Tiere RNAi.
	
	
	<li>Manuell übertragen Sie 50 L4 Stadium Würmer pro Replikation mit einem Platin Draht an einem NGM-Platte, die nicht enthalten alle Bakterien und Würmer, die Abkehr von der übertragenen OP50 Bakterien lassen. Lassen Sie Würmer auf dem Teller für ca. 5 Minuten ziehen. Verwendung Bakterien von den RNAi NGM-Agar-Platten ausgesät zuvor mit Lin-53 RNAi Bakterien (oder leere Vektor-Kontrolle) an den jeweiligen RNAi-Platten übertragen.
	<ol>
		<li>Vermeiden Sie OP50 Bakterien auf die tatsächliche RNAi-Platten übertragen. Arbeiten Sie schnell zur Minimierung von Belichtungszeit des Stammes zu höheren Temperaturen als 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ca. 7 Tage bis F1-Nachkommen der Würmer L3-L4-Stadium erreicht inkubieren Sie Würmer auf RNAi NGM-Agar-Platten bei 15 ° C. Sie können deutlich von den P0 Tieren getrennt werden, da sie größer und dicker als der F1-Nachkommen sind.
	<ol>
		<li>Eine Sichtkontrolle unter einem standard Stereomikroskop ob F1 Nachkommen Würmer die hervorstehenden Phänotyp der Vulva (Pvul) zeigen, wie in Abbildung 1dargestellt. RNAi gegen Lin-53 hat pleiotrope Effekte und bewirkt, dass den Pvul -Phänotyp die verwendet werden können, zu beurteilen, ob RNAi gegen Lin-53 erfolgreich war. Hinweis: RNAi gegen Lin-53 kann auch Tödlichkeit der F1 Embryonen führen. Dieser Effekt erhöht sich, wenn Platten für höhere Grad als 15 ° C ausgesetzt sind, bevor Tiere L3-L4-Stadium erreicht. Toten Embryonen können durch Developmental und mangelnder Schlupf erkannt werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie Platten im Dunkeln, da IPTG lichtempfindlich ist.</li>
	</ol>
	</li>

(4) Induktion einer Keimzelle Neuprogrammierung
<ol>
	<li>Inkubieren Sie untersuchte RNAi-Platten mit Lin-53 und leeren Sie Vektor RNAi behandelt F1 Nachkommen für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln, CHE-1 zu aktivieren. Verwenden Sie einen belüfteten Inkubator, da es eine effizientere Hitzeschock ermöglicht.</li>
	<li>Ermöglichen Sie Hitze-schockiert Tiere zu erholen für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln und inkubieren Sie Platten bei 25 ° C über Nacht im Dunkeln.</li>
	<li>Mit einem standard Stereomikroskop, gekoppelt an eine Lichtquelle Fluoreszenz untersuchen Tiere unter den GFP-Filter für Gcy-5prom::gfp-Signale im mittleren Körperbereich der Würmer abgeleitet, wie in Abbildung 2dargestellt. Set Mikroskop für GLP-Signale: Erregung max. 488 nm bei Emission maximal bei 509 nm.</li>
	<li>Bewerten Sie den Grad der Keimzelle Neuron Umwandlung durch Montage Tiere mit GFP Signale im mittleren Körperbereich auf Agar-Pad-haltigen Mikroskopie Folien19.
	<ol>
		<li>Die Anzahl von Tieren, die die Keimzelle zur Neuron Umkehr vs. dunkle Tiere zur Bewertung der Phänotyp-Penetranz. In der Regel zeigen rund 30 % der Tiere diskrete GFP Signale in die Keimbahn auf Lin-53 Erschöpfung, wobei nicht mehr als 5 % der Tiere in die Keimbahn bei leerer Vektor RNAi diffuse GFP Signale zeigen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li>
<li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+barriers+and+enhancers%3A+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regen%22%5BJournal%5D)">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li>
<li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-Dependent+Heterochromatin%3A+Barrier+to+Cell+Fate+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Gent%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li>
<li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li>
<li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li>
<li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).</li>
<li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li>
<li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100(2017).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_introreversegenetics/introreversegenetics.html">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).</li>
<li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li>
<li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li>
<li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li>
<li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_intromethodscellbiology/intromethodscellbiology.html">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben erklärt, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Während die beschriebene Protokoll mit den transgenen C. Elegans strain BAT28 und RNAi gegen Lin-53 ist einfach, eine Reihe von Schritten sind entscheidend in der Reihenfolge um das erwartete Ergebnis der Keimzelle zu Neuron Umprogrammierung zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass der Stamm BAT28 zu allen Zeiten vor den Experimenten bei 15 ° C gehalten wird. Bei der Handhabung und Wartung der Belastung muss die Zeit bei Temperaturen über 15 ° C minimiert werden so weit wie möglich. Richtige Hitze-Schock-Bedingungen sind wichtig, da ungenügende Induktion von Che-1 Überexpression nicht Keimzelle zur ASE Neuron Bekehrung führt. Dies kann durch Messung der Phänotyp-Penetranz, wie im Protokoll beschrieben detektiert werden. Umfangreiche Hitzeschock kann zu Letalität der Tiere führen. Zum Beispiel Erfahrung Platten, die oft in der Nähe von den Innenwänden oder auf dem unteren Boden eine statische Luft Inkubator platziert wurden umfangreiche Wärmebehandlung. Daher empfiehlt es sich, einen belüftete Hitze Inkubator zu verwenden. Darüber hinaus ist das Timing der Hitzeschock Induktion kritisch, da Überexpression des Che-1 während der Larvenstadien früher dann L3 auf ektopische Gcy-5prom::gfp Induktion in unterschiedlichen Körperregionen wie der Vulva (Abbildung 3) führen können 9. Darüber hinaus umfangreiche Hitzeschock kann durch den Phänotyp-Penetranz in leerer Vektor RNAi-Tiere, die nicht 5 % und erhöhte Auto-Fluoreszenz anderer Gewebe, nämlich den Darm auszudehnen nachgewiesen werden.
RNAi Bakterien können sporadisch, ihre Tätigkeit um effizient produzieren DsRNA des Zielgens verlieren. Leider kann dies nicht erkannten vor der RNAi-Experiment werden. In solchen Fällen sollten ein frischen Streifen aus dem Glycerin angebaut werden, wie in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben. Wenn gibt es noch keine RNAi verursacht pleiotrope Phänotyp sichtbar, wie der Pvul -Phänotyp durch erfolgreiche RNAi gegen Lin-53, dann ein Plasmid DNA-Isolierung aus den jeweiligen Bakterien verursacht durchgeführt werden sollte und frische HT115 Bakterien müssen sein mit dem L4400 Plasmid mit dem Lin-53 -Sequenz transformiert.
Wichtig ist, der BAT28 Stamm hat eine Walze Phänotypus verursacht durch die Injektion Marker pRF4, die verwendet wurde, während der Transgenese der Tiere mit der Hsp-16.2prom::che-1 DNA-Konstrukt. Gelegentlich Tiere verlieren den rollenden Phänotyp, die darauf hinweisen kann, Schweigen der der Hsp-16.2prom::che-1 Transgen. Um die BAT28 Belastung richtig zu halten, wählen Sie 10 Roller Tiere zu einem frischen Teller und propagieren Sie Auswahl für das rollende Tiere zu.
Die Anwendung des Protokolls beschränkt sich auf das F1 RNAi-Verfahren, was bedeutet, dass Tiere, deren Eltern (P0 Generation) Lin-53 RNAi nicht ausgesetzt wurde, Keimzelle zu Neuron-Umstellung aufgrund mütterlicher Rescue4nicht angezeigt werden. Ein alternatives Verfahren Keimzellen in Neuronen zu konvertieren ist durch Ciosk und Kollegen15 mit RNAi Knock-down Gld-1 und Mex-3 ohne Überexpression des einen Transkriptionsfaktor beschrieben worden. Jedoch die erhaltenen Neuronen gehören nicht zu einer bestimmten Art von Neuronen und Keimzellen umwandeln auch Muskel-wie Zellen auf RNAi-vermittelten Erschöpfung der Gld-1 und Mex-315. Zuvor hat es bewiesen die RNAi gegen Lin-53 erlaubt Keimzelle Umwandlung in GABAergen Neuronen-wie Zellen bei der Überexpression des Transkriptionsfaktors Pitx-Typ Homoedomain UNC-3016 anstelle von CHE-14 . Für zukünftige Richtungen kann verschiedene Schicksal-induzierende Transkription Faktoren geprüft werden können, ob Lin-53 Keimzellen erschöpft in andere Zelltypen als spezifische Neuronen umgewandelt werden. In diesem Zusammenhang induziert Überexpression des myogen bHLH Transkriptionsfaktors HLH-1, Homolog der Säugetier-MyoD17, Umstellung der Keimzelle auf Muskeln auf Lin-53 RNAi5. Die etablierten Umprogrammierung der Keimzellen zu einer bestimmten Körperzelle Typ auf Lin-53 RNAi und Überexpression von einer entsprechenden Schicksal-induzierende Transkriptionsfaktor kann für eine Reihe von verschiedenen genetischen Bildschirmen verwendet werden. Solche Bildschirme Suppressor oder Enhancer können helfen, sezieren regulatorische Signalwege, die in Zelle Schicksal Konvertierung eine Rolle spielen.

Handy-Schicksal Umprogrammierung durch ektopische TF-Expression wie die myogen TF MyoD, die beim überexprimiert, Konvertiten Fibroblasten direkt in den Muskel-wie Zellen1, wurde ein Forschungsschwerpunkt seit Jahrzehnten. Differenzierte Zellen sind jedoch oft refraktär gegenüber diesen Prozess durch Mechanismen, die ihre zelluläre Identität zu wahren. Keimzellen zeigen ein ähnliches Maß an Schutz und gibt es zugrunde liegenden Mechanismen, die oft als ein Hindernis für die Keimzelle Konvertierung in andere Zelltypen bei Überexpression von einem Schicksal-induzierende TF verhindern fungieren. In der Regel auferlegt epigenetischen Regulation wie Histon Änderungen und Chromatinstruktur ein Hindernis für die Bekehrung der Zelle Schicksale2,3. Wir haben zuvor angewendet reverse Genetik mit RNAi Knock-Downs in C. Elegans und identifizierte Faktoren, die zelluläre Identitäten zu schützen und dadurch entgegenwirken Reprogrammierung von Keimzellen in Neuronen4. Insbesondere die Polycomb repressiven Komplex 2 (PRC2) und die hoch konservierte Histon Chaperone LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 in den Menschen) zu verhindern, dass die direkte Umwandlung von Keimzellen in bestimmten somatischer Zelltypen wie glutamatergen Geschmack Neuronen in C. Elegans 4 , 5. um diese Keimzelle Umprogrammierung Barriere Faktoren zu identifizieren, wir transgene Tiere tragen die Hitzeschock induzierbaren Zn-Finger TF CHE-1 verwendet. CHE-1 drückt sich normalerweise in zwei Kopf Neuronen von C. Elegans, wo gibt es das Schicksal der glutamatergen Geschmack Neuronen ASE6bezeichnet. Die ASE Neuron Schicksal kann durch Expression von ASE-spezifischen fluoreszierenden Reporter Gcy-5prom::gfpvisualisiert werden. GCY-5 ist ein Chemorezeptor nur in ASE richtige Neuron7zum Ausdruck gebracht. Lin-53 Erschöpfung durch RNAi und Induktion von breiten ektopische Expression von CHE-1 durch einen Hitzeschock können Neuronen in Vivo4,5Keimzellen umgewandelt werden. Wichtig ist, ist das Timing der RNAi-Behandlung besonders wichtig, da nur Erwachsene Würmer (P0 Generation) ausgesetzt, Lin-53 RNAi F1 Nachzucht Tiere mit einem Keimbahn, die freizügig hervorrufen für Reprogrammierung in Neuronen4ist.
Die oben beschriebenen Keimzelle zu Neuron Konvertierungsvorgang in C. Elegans kann verwendet werden, um eine Vielzahl von biologischen Fragen wie die Implikation der Signalwege in der Zelle Schicksal Umprogrammierung zu studieren. Zum Beispiel haben wir die CHE-1-induzierte Keimzelle Reprogrammierung in ASE Neuronen auf RNAi gegen Lin-53 um die Implikation der Signalweg in den Prozess der Keimzelle Umprogrammierung8Kerbe zu studieren. Durch Ausführen der doppelten RNAi um Lin-53 und der Histon-Demethylase-Codierung Co zum Abbau gen Utx-1 wir, dass die Kerbe Weg entgegenwirkt PRC2-vermittelte Gen-silencing zeigten durch Aktivierung Ausdruck UTX-1 in die Keimbahn8-Signalisierung . Dieses Ergebnis zeigt, dass die Keimzelle Umstellung auf Neuronen, die in diesem Protokoll beschrieben verwendet werden, um einen komplexen biologischen Prozess z. B. zellulären Reprogrammierung im Organismus intakt und im Rahmen der verschiedenen Entwicklungs- und umweltpolitischen studieren Bedingungen. Darüber hinaus bietet es die Perspektive um Keimzellen zu fordern, indem Sie zum Ausdruck über verschiedene Schicksal-induzierende TFs zu ihrer Rolle in der Beschränkung der zellulären Plastizität9studieren oder ihr Potenzial zur Induktion Umprogrammierung der Keimzellen zu bewerten andere Zelltypen in Vivo.
Während Säugetier-Gewebekulturen auch verschiedene Aspekte erlauben der Zelle Schicksal Umprogrammierung zu studieren, haben Zellen in Kultur angebaut eine begrenzte Kapazität, Signalisierung Weg Bedingungen im Vergleich zu einem intakten Organismus zu imitieren. C. Elegans ist demzufolge ein vielseitiges Modell zur Untersuchung der Rollen der verschiedenen biologischen Prozessen wie Notch Signalisierung während Umprogrammierung in Vivo. Darüber hinaus ist es ein leistungsfähiges Modell für genetische Bildschirme, das ist relativ leicht zu pflegen und genetisch zu verändern, für niedrige Kosten.

<table><tbody><tr><td><stark>Chemikalien&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopepton&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&nbsp;</td></tr><tr><td>Hefe-Extrakt&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Roth</td><td>8866,2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Roth</td><td>4275,3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25.163.364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td><td>für Hitzeschock-Inkubator</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>zur Erhaltung von Wurmstämmen bei 15 &°; C oder 25 &Grad; C</td></tr><tr><td>Mikroskope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>M205 FA</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Bildgebung) + Kamera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Bildgebung) + Kamera</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriell Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 Promotor -T7-Polymerase) (IPTG-induzierbare T7-Polymerase) (RNAse III minus).</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Uracil auxotrophe E. coli Stamm</td></tr><tr><td>Wurmstämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td><td>abgeleitet von OH9846 durch 4-mal mehr Rückkreuzung mit N2</td></tr><tr><td>RNAi Klonen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>empty vetor: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td><stark>Sonstiges</starkes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wurmpickel&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Selbstgemacht mit einer Pasteurpipette und einem Platindraht</td></tr></tbody></table>

anwendung von rnai und hitze-schock-induzierte transkription faktor ausdruck zu programmieren keimzellen neuronen in c. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studium der biologischen Prozesse der Zelle während der Umwandlung der Identitäten der spezifischen Zelltypen liefert wichtige Einblicke in den Mechanismus, die pflegen und zelluläre Identität zu schützen. Die Umwandlung von Keimzellen in spezifischen Neuronen in den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Durchführung von genetischen Bildschirme um regulatorische Signalwege zu sezieren, die etablierten Zelle Identitäten zu schützen. Umprogrammierung der Keimzellen auf einen bestimmten Typ von Neuronen genannt ASE erfordert, dass transgene Tiere, mit denen breite Überexpression der Zn-Finger Transkription Faktor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 äußert sich ausschließlich in zwei Kopf Neuronen und ist erforderlich, um die ASE glutamatergen Neuronen Schicksal angeben, die leicht durch die Gcy-5prom::gfp -Reporter visualisiert werden können. Ein Trans-gen, enthält das Hitzeschock Projektträger-gesteuerte Che-1 Ausdruck Genkonstrukt ermöglicht breiten MIS Ausdruck des CHE-1 in das gesamte Tier bei Hitze-Schock-Behandlung. Die Kombination von RNAi gegen die Regulierung von Chromatin Faktor LIN-53 und Hitze-Schock-induzierte Che-1 Überexpression führt zur Reprogrammierung von Keimzelle in ASE Neuron-ähnliche Zellen. Wir beschreiben hier die RNAi Sonderverfahren und angemessene Bedingungen für Hitze-Schock-Behandlung von transgenen Tieren um erfolgreich Keimzelle zur Neuron Umkehr induzieren.

Wie in Abbildung 1dargestellt, veranschaulichen F1-Tiere, die den Pvul Phänotyp aufweisen erfolgreiche Anwendung von Lin-53 RNAi. Diese Tiere sind anfällig für die Umrechnung von ihre Keimzellen ASE Neuron-ähnliche Zellen nach Hitzeschock Induktion von Che-1 Überexpression zu ermöglichen, wie in Abbildung 2dargestellt. Im Gegensatz zu Würmern, die auf das Steuerelement leer wuchs Vektor RNAi Lin-53 RNAi Behandlung Tiere, die Anzeige ektopische GFP-Signale im mittleren Körperbereich erbringt nach Hitzeschock und 25 ° C Inkubation über wie beschrieben früheren4, Nacht 8. genauere Untersuchung unter einem Mikroskop Epifluoreszenz dieser Würmer zeigt, dass die Zellen zeigen GFP Signale auch Neuron des Rumpfes (Abbildung 2 b, weiße Pfeile) angezeigt, die typisch für neuronale Zellen sind. Wenn RNAi gegen Lin-53 nicht erfolgreich war oder Hitzeschock Bedingungen unangemessen waren werden GFP Signale mit denen Kontrolle RNAi behandelte Tieren (Abbildung 2) ähneln. Wichtig ist, zu vermeiden, Überexpression des Che-1 durch Hitze Induktion Induktion, bevor Tiere Mitte L3-Stadium zu erreichen. Tiere, die zu jung zum Zeitpunkt der Che-1 Überexpression Induktion waren können ektopische Gcy-5prom::gfp Ausdruck in anderen Regionen des Körpers wie der Entwicklung Vulva anzeigen, wie in Abbildung 3-13gezeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Pvul Phänotyp verursacht durch RNAi gegen Lin-53. (Oben) DIC-Bild von L4/junge Erwachsenstadium F1 Nachkommen Würmer von Kontrolle oder Lin-53 RNAi behandelt Mütter abgeleitet. Skalieren von Balken = 20 µm. (unten) Tiere mit Lin-53 RNAi Anzeige der hervorstehenden Vulva (Pvul)-Phänotyp (schwarze Pfeilspitzen) behandelt. Der Phänotyp der Pvul bestätigt, dass RNAi gegen Lin-53 erfolgreich war. Skalieren von Balken = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Würmer mit erfolgreich reprogrammierten Keimzelle in Neuronen. (A) BAT28 Belastung Tiere gewachsen auf dem leeren Vektor zeigen keine GFP Signale in die Keimbahn nach Hitzeschock Induktion von Che-1 Überexpression. Weiße gestrichelte Konturen Wurm. Skalieren von Balken = 20 µm. (B) im Gegensatz zu BAT28 Sorte Tiere angebaut auf der leeren Vektorregelung RNAi Tiere gewachsen auf Lin-53 RNAi Displayanzeigen Gcy-5prom::gfp im mittleren Körperbereich. Bilder von Mid Textabschnitt mit GFP Signale genommen bei 63 X Vergrößerung offenbaren GFP-positiven Zellen zeigen Vorsprünge (weiße Pfeilspitzen). Diese morphologische Funktion zeigt, dass Keimzellen Umwandlung in ASE Neuron-ähnliche Zellen unterzogen. Weiße Sternchen kennzeichnen Darm abgeleitet Auto-Fluoreszenz. Alle Bilder wurden mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit 20 X Vergrößerung und 63 X Vergrößerung erworben. Gestrichelte weiße Linie umreißt Würmer. Skalieren von Balken = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Frühen Stadium Wurm mit ektopische GFP. BAT28 Sorte Tiere auf die leere Vektor RNAi-Bakterien, die Hitze-Schock für Che-1 Überexpression an frühen Larvenstadien wie L2 induziert wurden angebaut zeigen GFP Signale im mittleren Körperbereich (weiße Sternchen). Diese Signale sind nicht durch Umprogrammierung Keimzelle. Weiße gestrichelte Konturen Wurm. Skalieren von Balken = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die zelluläre Prozesse während der Zelle Schicksal Konvertierung in Caenorhabditis Elegans in-vivoStudie. Mit transgenen Tieren, so dass Hitzeschock Projektträger-gesteuerte Überexpression des Neuron Schicksal-induzierende Transkriptionsfaktors CHE-1 und RNAi-vermittelten Erschöpfung der Chromatin-regulierende Faktor LIN-53 Keimzelle zu Neuron Umprogrammierung kann beobachtet werden in Vivo.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen in C.elegans zu induzieren. Diese Methode kann dabei helfen, die Bedeutung biologischer Prozesse, wie z.B. Signalwege oder Epigenetik, bei der Regulation der zellulären Schicksalsumprogrammierung zu untersuchen. Der Hauptvorteil der in diesem Video beschriebenen Methode besteht darin, dass in lebenden Tieren Keimzellen durch die Überexpression eines schicksalsauslösenden Transkriptionsfaktors herausgefordert werden können.Parallel dazu kann ein genetisches Screening, wie z. B. ein RNAi-Screening, durchgeführt werden, um neue Faktoren zu identifizieren, die an der Regulierung der zellulären Reprogrammierung beteiligt sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die regenerative Therapie. Denn mit dieser in vivo-Methode könnte die zelluläre Reprogrammierung unter verschiedenen Entwicklungs- und Umweltbedingungen untersucht werden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Neuprogrammierung schwer zu erlernen sind. Denn der Phänotyp der Umwandlung von Keimzellen in Neuronen nach Erschöpfung von lin-53 findet nur unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen statt. Für die RNAi-Platten laden Sie sechs Zentimeter große Platten mit NGM-Agar, der IPTG und Carbenicillin enthält.Lassen Sie sie 24 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Übertragen Sie sie dann für bis zu 14 Tage auf vier Grad Celsius. Als nächstes werden selektive Platten, die Carbenicillin und Tetracyclin enthalten, mit RNAi-Bakterienklone mit L4440-Plasmid versehen, das das lin-53-Gen trägt.Verwenden Sie ein dreiphasiges Streifenmuster, und stellen Sie sicher, dass Sie ein leeres Vektorsteuerelement plattieren. Lass die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen. Am nächsten Tag wählen Sie mindestens drei einzelne Völker aus und impfen Sie jede von ihnen in ein separates Kulturröhrchen mit zwei Millilitern LB, ergänzt mit Carbenicillin, aber nicht mit Tetracyclin.Planen Sie drei gesunde Kulturen pro Zustand ein. Als nächstes züchten Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius, bis sie eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,6 bis 0,8 erreichen. Geben Sie dann 500 Mikroliter jeder Bakterienkultur auf eine sechs Zentimeter große NGM-Agar-RNAi-Platte.Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dieses Protokoll ist optimiert für BAT28-Stammwürmer, die bei 15 Grad Celsius gehalten werden, bei denen die Transgene am stabilsten sind. Details zur Genetik der Stämme finden Sie im Text.Die Alterssynchronisierung der Würmer ist entscheidend. Verwende die Bleichtechnik. Waschen Sie sechs Zentimeter große NGM-Agarplatten mit adulten Tieren und Eiern mit 800 Mikrolitern M9. Dann werden die Würmer durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand entfernt.Geben Sie anschließend 1/2 bis einen Milliliter Bleichlösung zu den Würmern. Und während Sie die Würmer unter einem Stereoskop beobachten, schütteln Sie die Röhre, bis die erwachsenen Würmer aufplatzen, und sammeln Sie dann die Eier ein. Trennen Sie nun den Abfall von den Eiern.Zuerst zentrifugieren Sie das Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie dann das Pellet aus dem Taschentuch dreimal mit 800 Mikrolitern M9. Achten Sie darauf, eine Zentrifugation zu verwenden, um das Gewebe zwischen den Waschgängen zu sammeln.Übertragen Sie nun die gereinigten Eier auf frische NGM-Platten, die mit OP50-Bakterien besiedelt sind. Überprüfen Sie kurz, ob die Embryonen erfolgreich isoliert und auf die NGM-Platten übertragen wurden. Züchten Sie die Tiere bei 15 Grad Celsius.Um eine Umwandlung von Keimzellen in Neuronen nach der Erschöpfung von lin-53 zu erreichen, muss die Erschöpfung in der elterlichen Generation beginnen. Um lin-53 zu depletieren, werden L4-Tiere RNAi unterzogen. Übertragen Sie 50 L4-Würmer pro Replikat manuell auf eine NGM-RNAi-Platte ohne Bakterien.Verwende einen Platindraht. L4-Würmer sind an einem weißen Fleck etwa auf halber Höhe ihrer Bauchseiten zu erkennen. Inkubieren Sie die Würmer nun bei 15 Grad Celsius im Dunkeln für etwa sieben Tage.Das IPTG ist lichtempfindlich. Wenn die F1-Nachkommen die Stadien L3 und L4 erreichen, trennen Sie sie von den größeren, dickeren Elterntieren. Zu diesem Zeitpunkt wird das F1 auf den hervorstehenden Vulva-Phänotyp untersucht, was darauf hindeutet, dass die RNAi gegen lin-53 erfolgreich war.Die RNAi-Aktivität kann auch zur Letalität führen, die auf über 15 Grad Celsius ansteigt. Um che-1 zu aktivieren und die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen in den F1-Nachkommen zu induzieren, schocken Sie die Würmer 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Verwenden Sie einen belüfteten Inkubator, da er einen effizienteren Hitzeschock ermöglicht.Nach dem Hitzeschock die Platten über Nacht bei 25 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Es ist wichtig, eine Überexpression von che-1 durch Hitzeschock zu vermeiden, bevor die Tiere das mittlere L3-Stadium erreichen. Dies kann zur Expression des che-1-Proteins in nicht zielgerichteten Geweben führen.Am nächsten Tag stellten Sie eine Fluoreszenzlichtquelle und einen GFP-Filter auf, um die Tiere auf transgene Fluoreszenz im Mittelkörperbereich zu untersuchen. Um die Penetranz des Phänotyps zu beurteilen, ermitteln Sie das Verhältnis der Tiere, die ein Fluoreszenzsignal aussenden. In der Regel zeigen etwa 30 % ein diskretes GFP-Signal.Zum Vergleich: Bei Tieren, die den leeren Vektor RNAi tragen, ist bei mehr als 5 % der Population nicht einmal ein diffuses Signal in der Keimbahn zu sehen. F1-Tiere, die den hervorstehenden Vulva-Phänotyp aufweisen, verdeutlichen die erfolgreiche Anwendung von lin-53 RNAi. Bei diesen Tieren ist die Umwandlung von Keimzellen in ASE-Neuronen-ähnliche Zellen nach Hitzeschock-Induktion von che-1 üblich.Bei näherer Betrachtung werden neuronenähnliche Fortsätze sichtbar, die typisch für Neuronen aus Keimbahnzellen sind. Im Gegensatz dazu zeigten leere Vektorkontrollen eine minimale Expression von GFP, die höchstens diffus war. Den Keimzellen dieser Tiere fehlten neuronenähnliche Merkmale.Wenn die Tiere zum Zeitpunkt der Induktion der che-1-Überexpression noch zu jung waren, zeigten sie oft eine ektopische Transgenexpression in anderen Regionen des Körpers, wie z. B. in der sich entwickelnden Vulva. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Experimente mit lebenden Würmern sorgfältig planen und durchführen, um Keimzellen in Neuronen umzuprogrammieren. Die hier in diesem Video beschriebene Methode ermöglicht es Ihnen nun, die Auswirkungen einer Reihe verschiedener Faktoren auf die Regulation der zellulären Reprogrammierung zu untersuchen.Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in 10 Tagen durchgeführt werden. Während des Versuchs des Experiments ist es wichtig, die Tiere vor der Einleitung der Reprogrammierung sorgfältig zu inszenieren und den BAT28-Stamm bei 15 Grad zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie doppelte RNAi durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Was sind die zugrundeliegenden Mechanismen, die bei der Umwandlung des Zellschicksals eine Rolle spielen?

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Neurexine und Neuroligine sind Membran-Neuron Haftung Proteine, die wichtige Rollen in synaptic Differenzierung und die Übertragung durchzuführen. Neuroligin defizienten Mutanten...

Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus

Wir beschreiben eine Methode, um sensibilisiert postembryonalen Regulatoren der Protein-Expression und Lokalisation in...

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

Dieses Video beschreibt die Prinzipien hinter der RNAi-Behandlung in C. elegans und demonstriert ein Protokoll zum Knockdown von lin-35 in einem transgenen Wurmstamm.

RNAi-Plating für die Fütterung von C. elegans: Eine Technik zur Induktion der Ziel-dsRNA-Expression in E. coli

RNAi ist ein mächtiges genetisches Werkzeug, das C. elegans-Forschern zur Verfügung steht. In diesem Video wird eine Methode vorgestellt, mit der mehr Würmer mit RNAi behandelt werden können als mit der Plattenfütterung unter Verwendung von Flüssigkulturbedingungen.

RNAi-Fütterung in Flüssigkultur: Eine Hochdurchsatzmethode zur Unterdrückung der Genexpression in C. elegans

Dieses Video zeigt die Umprogrammierung von Nematoden-Keimzellen in Neuronen durch das Zellschicksal. Transgene Larven des Fadenwurms Caenorhabditis elegans werden einer RNA-Interferenz (RNAi) ausgesetzt, um einen spezifischen Chromatin-regulierenden Faktor auszuschalten, wodurch die Keimzellen ihrer Nachkommen anfälliger für eine Umprogrammierung des Zellschicksals werden. Bei den Nachkommen wird ein Hitzeschock angewendet, der die Keimzellen dazu veranlasst, einen neuronenspezifischen...

Zellschicksal: Reprogrammierung von Nematoden-Keimzellen in Neuronen

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild teilenden Zellen innerhalb eines Gewebes in Caenorhabditis elegans Embryonen. Während mehrere Protokolle beschreiben, wie Bild der Zellteilung im frühen Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Entwicklungs Gewebe während der Embryogenese Mitte spät.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Hier stellen wir ein Protokoll zur einfachen Isolierung bestimmter Gruppen lebender neuronaler Zellen vor, die grünes fluoreszierendes Protein aus transgenen Caenorhabditis elegans-Linien exdrücken. Diese Methode ermöglicht eine Vielzahl von Ex-vivo-Studien, die sich auf bestimmte Neuronen konzentrieren und hat die Fähigkeit, Zellen für eine weitere kurzfristige Kultivierung zu isolieren.

Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

Hier werden standardisierte Protokolle zur Beurteilung der Induktion der Wärmeschockreaktion (HSR) bei Caenorhabditis elegans mit RT-qPCR auf molekularer Ebene, fluoreszierenden Reportern auf zellulärer Ebene und Thermorecovery auf Organismusebene vorgestellt.

Standardisierte Methoden zur Messung der Induktion der Hitzeschockreaktion bei Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt einen RNA-Interferenz- und ChIP-Assay zur Untersuchung der epigenetischen Vererbung von RNAi-induziertem Silencing und damit verbundenen Chromatinmodifikationen in C. elegans.

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Lernen Sie die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen in C. elegans durch RNAi und Hitze-Schock-induzierte CHE-1-Expression. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Reprogrammierung in vivo für regenerative Therapieforschung.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Weitere Videos entdecken