Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die Auswirkungen verschiedener Verbindungen auf die Modellorganismen C.elegans in einem Hochdurchsatz-Assay zu testen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Chemie, Biologie und des Alterns zu beantworten, wie z.B. verlängern bestimmte chemische Strukturen die Lebensdauer von C.elegans? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das zeiteffiziente und schnelle Screening zahlreicher Verbindungen ermöglicht.

Um Massenkulturplatten für die Produktion einer großen Anzahl von Würmern vorzubereiten, geben Sie in einem Laminar-Flow-Schrank zunächst 30 Milliliter 60 Grad Celsius Nematoden-Wachstumsmedium-Agar auf 10 Zentimeter große Kulturplatten, um sie über Nacht zu verfestigen. Geben Sie am nächsten Morgen zwei Milliliter konzentrierte E.coli auf jeden Teller, indem Sie den Teller kippen und drehen, um die Bakterien vollständig auf der Telleroberfläche zu verteilen. Wenn die Massenkulturplatten getrocknet sind, lagern Sie sie bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius.

Um Hochdurchsatz-Assay-Kulturplatten für das Screening vorzubereiten, verwenden Sie einen automatisierten Achtkanal-Dispenser, um 0,15 Milliliter geschmolzenen Nematoden-Wachstumsmedium-Agar in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu geben. Lassen Sie den Agar über Nacht fest werden. Lagern Sie die Hochdurchsatz-Assay-Platten anschließend bis zu zwei Wochen lang bei vier Grad Celsius.

Um die C.elegans-Kulturen einzurichten, verwenden Sie einen Wurmstocher und ein Präpariermikroskop, um 20 Eier auf jede Massenkulturplatte zu übertragen und die Platten sechs Tage lang bei 20 Grad Celsius zu inkubieren. Verwenden Sie am siebten Tag ein Präpariermikroskop, um das Vorhandensein von Eizellen in der Gebärmutter visuell zu bestätigen. Um die trächtigen Erwachsenen zu sammeln, fügen Sie mit einer Glaspipette zwei bis drei Milliliter S Basallösung pro Platte hinzu und schwenken Sie die Lösungen von Hand um jede Platte.

Füllen Sie die Würmer mit der Glaspipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation. Suspendieren Sie die Würmer erneut in 10 Millilitern Hypochloritlösung und schütteln Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang schnell auf und ab. Inkubieren Sie die Würmer dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und schütteln Sie sie alle 2,5 Minuten.

Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Würmer erneut. Die Pellets sollten gelblich-braun sein. Ersetzen Sie die Überstände durch 10 Milliliter frische Hypochloritlösung und schütteln Sie das Röhrchen erneut kräftig.

Inkubieren Sie die Würmer für weitere ein bis drei Minuten unter gelegentlichem Schütteln. Wenn nur noch Eier übrig sind, zentrifugieren Sie die Röhrchen und saugen Sie die Überstände an. Die Pellets sollten weiß sein und keine braune Färbung aufweisen.

Öffnen Sie die Röhrchen in einem sterilen Laminar-Flow-Schrank und fügen Sie jedem Pellet 14 Milliliter S Basallösung hinzu. Waschen Sie das Pellet dreimal mit 14 Millilitern S Basal. Nach drei Waschgängen durch Zentrifugation die Eier in zwei bis drei Millilitern frischer S Basallösung wieder suspendieren.

Zur Zubereitung von C.elegans-Larven im L1-Stadium werden die Überstände in eine sterile Petrischale aus Glas pro Röhrchen überführt und zwei bis drei Milliliter S Basallösung verwendet, um die restlichen Eier aus den Röhrchen in jede Schale zu spülen. Geben Sie fünf Milliliter S Basallösung in jede Schale, um das Überfüllen zu erleichtern, und stellen Sie die Schale 16 bis 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius und 20 U/min auf einen Orbitalschüttler, um das Schlüpfen zu fördern. Alle geschlüpften Jungtiere bleiben im ersten Larvenstadium aufgrund von Nahrungsmangel stehen.

Mit einer serologischen Pipette werden die L1-Larven zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Nachdem alle geschlüpften L1 durch wiederholtes Zentrifugieren und Aspirieren konsolidiert wurden, wird das Larvenpellet mit 10 Millilitern steriler S Basallösung wieder suspendiert. Füllen Sie dann 10 Mikroliter auf eine unbesäte Platte und zählen Sie die Anzahl der Larven, die sich auf der Platte befinden.

Wiederholen Sie diesen Vorgang 10 Mal, um die durchschnittliche Dichte von L1s in Ihrer Lösung zu erhalten. Bestimmen Sie mit einer sterilen serologischen Pipette das Gesamtvolumen der Lösung, die die L1s enthält. Verwenden Sie als Nächstes das Volumen der L1-Lösung und die Dichte der L1s in der Lösung, um die Gesamtzahl der in der Lösung vorhandenen L1s zu berechnen.

Um die Würmer in einer 96-Well-Assay-Platte mit hohem Durchsatz zu plattieren, verdünnen Sie die L1-Suspension auf eine L1-Larve pro Mikroliter in einer sterilen, runden Medienflasche, die mit einem mäßig langsam drehenden Rührstab ausgestattet ist, und lassen Sie die Assay-Platten auf Raumtemperatur erwärmen. Geben Sie anschließend in einem Laminar-Flow-Schrank fünf Mikroliter konzentriertes E.coli in jede Vertiefung, gefolgt von 10 Mikrolitern L1-Suspension pro Vertiefung, um durchschnittlich 10 Würmer pro Vertiefung zu erhalten. Wenn alle Würmer plattiert sind, decken Sie die Platten ab und brüten Sie die Würmer zwei Tage lang bei 25 Grad Celsius aus, damit sich die Larven zu erwachsenen Tieren entwickeln können.

Am Ende der Inkubation bringen Sie die chemischen Bibliotheksplatten aus dem Gefrieren auf Raumtemperatur. Schütteln Sie die aufgetauten Platten unmittelbar vor der Verwendung eine Minute lang vorsichtig bei 60 U/min auf einem Mikroplattenschüttler. Übertragen Sie mit einem automatisierten 96-Well-Liquid-Handler 0,75 Mikroliter der Verbindung von der Bibliotheksplatte auf die Assay-Platte.

Wenn alle Vertiefungen behandelt wurden, trocknen Sie die Verbindung vier bis acht Stunden lang an der Luft von der Oberfläche der Platten in einem Laminar-Flow-Schrank und entfernen Sie die einzelnen Platten, sobald sie trocken sind. Verschließen Sie die getrockneten Platten mit Klarsichtfolie und verschließen Sie sie. Dann drehen Sie die Platten 45 Sekunden lang bei 1000 G und lagern Sie sie in umgekehrter Position bei 25 Grad Celsius.

Um die Reaktionen von C. Elegans auf die interessierenden Verbindungen zu testen, kann eine negative Kontrollplatte verwendet werden, um das Gesamtüberleben zu bewerten, bis 95 % der Kontrolltiere tot sind. In dieser Studie wurden beispielsweise 57 Treffer aus der Wiederholungsbibliothek von 179 Verbindungen beobachtet, was zeigt, dass 32 % der erneut getesteten Chemikalien insgesamt positiv getestet wurden. Das Binning des gemittelten prozentualen Lebendigkeitswerts für die negativen Kontroll- und Testbohrungen zeigte, dass die Testbohrungen die Kontrollbohrungen übertrafen.

Es können auch kleinskalige Screenings durchgeführt werden, wie in diesem repräsentativen Testassay gezeigt wurde, in dem 50 mikromolare und 100 mikromolare Konzentrationen der Testverbindung verwendet wurden. Die erneute Bewertung dieser Assay-Testplatten mit kleinen Screenings, bei denen mehr als 99 % der mit Negativkontrollen behandelten Tiere tot waren, zeigte, dass die Positivkontrollvertiefungen die Negativkontroll- und Testvertiefungen bei weitem übertrafen, da die Testvertiefungen etwas besser abschnitten als die Negativkontrollen. In diesem Experiment wurde das letztgenannte Ergebnis durch den Hinweis verzerrt, dass viele der Testbohrungen im Vergleich zur Kontrollbehandlung eine Toxizität aufwiesen, wodurch diese einfache Interpretation verfälscht wurde.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis vier Wochen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Integrität der Assay-Platten zu erhalten und sicherzustellen, dass sie makellos sind, bevor sie verwendet werden. Mit dieser Technik können zusätzliche Fragen beantwortet werden, wie zum Beispiel, welche dieser Verbindungen Mytophagie induziert?

Für einen Mytophagie-Assay würde ein Mytophagie-Reporterstrang verwendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie ein chemisches Hochdurchsatz-Screening mit C.elegans als Modellorganismus durchführen können.