Name: Routine-Screening Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Erfahren Sie eine Routine-Screening-Methode zur Analyse von Mikropartikeln in Thrombozytentransfusionen mittels Dynamic Light Scattering. Diese Technik ermöglicht die schnelle Unterscheidung aktivierter und nicht-aktivierter Thrombozyten zur Optimierung der Transfusionsmedizin.

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Wir danken Blutspender und das Personal im kanadischen Blut Netzwerk Dienstleistungszentrum für angewandte Entwicklung für Sammlung und Produktion der Thrombozyten-Einheiten, die in dieser Studie verwendet. Wir anerkennen die Kanada-Stiftung für Innovation und Michael Smith Stiftung für Gesundheitsforschung für Infrastrukturfinanzierung im UBC Zentrum für Blut-Forschung. Die Publikation wurde von LightIntegra Technology Inc., Hersteller von ThromboLUX finanziert.

Das folgende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit allen kanadische Blut-Dienstleistungen (CBS) Richtlinien durchgeführt. Freiwillige Stadtbezirksverwaltung, die ihre Spenden verwendet, diese Untersuchungen durchzuführen. Thrombozyten-Konzentrate wurden laut CBS Standardarbeitsanweisungen vorbereitet. Alle Leistungstests hier beschrieben wurde im Zentrum für Blut-Forschung an der University of British Columbia, Vancouver, Kanada mit institutionellen Research Ethics Board Genehmigung durchgeführt.
1. Qualitätskontrolle
<ol><li>Durchführen einer Qualitätskontrolle mindestens einmal pro Prüfung Tag um den ordnungsgemäßen Betrieb des DLS-Systems zu überprüfen. Messen Sie die mitgelieferte Steuerung Perlen (50 nm Radius) nach den Anweisungen des Herstellers für den Einsatz.</li>
	<li>Kontrollfläschchen aus Kühlhaus abrufen und 15 min auf Zimmertemperatur erwärmen lassen. Die Perlen müssen auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch equilibrate.</li>
	<li>Schalten Sie das DLS-System vor der Vorbereitung der Probe, so dass die 15 min Laser warm up-Periode bis zu dem Zeitpunkt, ist die erste Probe zum Testen bereit abgeschlossen ist.</li>
	<li>Sobald die Konsole gestartet ist, folgen Sie den Anweisungen auf dem Touchscreen einloggen und wählen die Option System-Test zur Messung der Kontrollprobe.</li>
	<li>Vortex mischen das Fläschchen für 10 s zu eine repräsentative Stichprobe zu gewährleisten.</li>
	<li>Füllen Sie eine Kapillare mit der Steuerelement-Perlen mit 100 µL festen Volumen Pipette, Pipettenspitze und Kapillare aus dem Testkit.</li>
	<li>Wenn der Test abgeschlossen ist, folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm das DLS-System. Hinweis: Die Kontrolle Bead Testergebnisse werden automatisch im Vergleich zu in Kontrolle Wulst Barcode-Etikett und einem PASS gespeicherten Informationen oder FAIL Benachrichtigung sowie Beispielinformationen sind auf dem DLS System Bildschirm am Ende des Tests angezeigt.</li>
</ol>2. erhalten eine Probe aus einem Thrombozyten-Konzentrat
Hinweis: Diese Schritte beschreiben den Prozess für die nicht-invasive Probenahme aus der Thrombozyten-Transfusion in der DLS testen Kapillare für die routinemäßige Thrombozyten Bestandsführung. Eine Übersicht ist in Abbildung 1dargestellt. Zubehör: tube Sealer, manuelle Rohr Stripperin, Schere und Splash-Schild.
<ol><li>Entfernen Sie die Thrombozyten-Konzentrat aus dem ungeprüften Inventar.</li>
	<li>Erhalten der Stichprobe der Thrombozyten-Produkt entweder von einem ungenutzten Probenahme-Beutel (fahren Sie mit Schritt 2.3) oder ein Schlauch-Segment (fahren Sie mit Schritt 2.4 Wenn leer oder Schritt 2.5 Wenn nicht leer). Um den Beutel zu trennen verwenden Rohre oder Schläuche Segment eine Rohr-Versiegelung. Um das Rohr Schweißgerät bedienen, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Kurz, Klemmen Sie den Schlauch in eine genaue Position zwischen zwei beheizten Backen versiegelt werden. In einem handheld-Gerät, drücken Sie die geschmolzene Rohr zusammen und kühlen unter hohem Druck beim Betätigen des Hebels (die Dauer ist gekennzeichnet durch das grüne Licht) führt eine permanente, auslaufsichere Dichtung.</li>
	<li>
Probenahme aus einem Beutel
	<ol>
<li>Mischen Sie den Inhalt des Beutels Thrombozyten gut durch sanfte Horizontalbewegung für 5 s (Kippen von Anfang bis Ende fünfmal).</li>
		<li>Öffnen Sie die Halterung auf dem Beutel. Der Beutel wird evakuiert und füllt sich von selbst. Es ist nicht notwendig, den Beutel vollständig auszufüllen, da nur 100 µL Probe für DLS Tests benötigt werden.</li>
		<li>Trennen Sie den Beutel aus dem Beutel durch Heißsiegeln der Verbindung Schlauch mit einem Rohr-Versiegelung. Fahren Sie mit Schritt 3 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Probenahme aus leeren Schlauch
	<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Thrombozyten Tasche Schläuche leer gelagert wurde und der Schlauch-Block ist immer noch vorhanden. Überprüfen Sie die Schläuche um sicherzustellen, dass gibt es keine erhebliche Menge an Thrombozyten-Konzentrat in den Schlauch. Wenn der Schlauch nicht leer ist, fahren Sie mit Schritt 2.5.</li>
		<li>Schließen Sie die Röhre Stripperin auf die Schläuche als in der Nähe des Schlauch-Blocks wie möglich durch Komprimieren die Griffe, um den Schlauch zwischen die Walzen quetschen.</li>
		<li>Hängen Sie die Tasche vertikal und halten Sie die Stripperin Griffe komprimieren.</li>
		<li>Während die Stripperin zu halten geschlossen, lassen Sie den Schlauch-Block.</li>
		<li>Ziehen Sie langsam die Stripperin hinunter den leeren Schlauch ermöglicht den Schlauch langsam hinter die Stripperin füllen. Weiter bis Abschnitt unterhalb der Abstreifer vollständig aufgeblasen hat oder die Stripperin in 1 Zoll vom Ende des Schlauches ist.</li>
		<li>Sobald der Haltepunkt mit der Stripperin erreicht ist, Gebrauch das Rohr Schweißgerät Hitze versiegeln die Schläuche 1 Zoll über die Stripperin.</li>
		<li>Lassen Sie die Griffe der manuellen Rohr Stripperin.</li>
		<li>Hitze Dichtung wieder 1 bis 2 Zoll oberhalb der früheren Dichtung Segment Tests erstellen.</li>
		<li>Das Test-Segment von Thrombozyten-Einheit abgeschnitten. Dieses Segment wird für DLS Tests verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Probenahme aus Rohren, die nicht leer ist
	<ol>
<li>Hängen Sie die Tasche vertikal und lassen Sie den Schlauch-Block im Ort.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Schläuche um festzustellen, ob es bedeutenderen festen Klumpen gibt. Wenn feste Klumpen vorhanden sind, über ihnen zu versiegeln, so dass sie in der Tasche entfernt werden können nicht.</li>
		<li>Schließen Sie die Röhre Stripperin auf die Schläuche als kurz vor dem verschlossenen Ende des Schlauches wie möglich.</li>
		<li>Bewegen Sie den Inhalt des Schlauches in die Tasche Streifen, durch Komprimieren die Griffe, um den Schlauch zwischen den Rollen und unter Beibehaltung der Klemmkraft quetschen die Rohr-Stripperin entlang den Schlauch auf die Tasche.</li>
		<li>Die Thrombozyten-Tasche aus der Aufhängehaken entfernen und vorsichtig mischen den Beutel für 5 s durch Kippen es von Anfang bis Ende fünfmal unter Beibehaltung der Stripperin geschlossen.</li>
		<li>Hängen Sie die Tasche vertikal unter Beibehaltung der Stripperin geschlossen.</li>
		<li>Ziehen Sie langsam die Stripperin hinunter den leeren Schlauch, so dass für den Schlauch langsam hinter die Stripperin füllen. Weiter bis Abschnitt unterhalb der Abstreifer vollständig aufgeblasen hat oder die Stripperin in 1 Zoll vom Ende des Schlauches ist.</li>
		<li>Sobald der Haltepunkt mit der Stripperin erreicht ist, Gebrauch das Rohr Schweißgerät Hitze versiegeln die Schläuche 1 Zoll über die Stripperin.</li>
		<li>Lassen Sie die Stripperin.</li>
		<li>Hitze Dichtung wieder 1 bis 2 Zoll oberhalb der früheren Dichtung Segment Tests erstellen.</li>
		<li>Abgeschnitten und den letzten Teil des Schlauches zu verwerfen.</li>
		<li>Das Test-Segment von Thrombozyten-Einheit abgeschnitten. Dieses Segment wird für DLS Tests verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. füllen die Probe in der DLS testen Kapillare
<ol><li>Mit einem Spritzer Schild und sauberen, trockenen Schere, schneiden Sie ein Ende des Beutels Schläuche oder Segment-Tests. Hinweis: Die Kapillare verwendet für DLS testen sollte sofort gefüllt werden.</li>
	<li>Füllen Sie die Kapillare mit dem Sampling-Tool (montierte 100 µL festen Volumen Pipette, Pipettenspitze und Kapillare) die Probe direkt aus dem geöffneten Beutel oder Schlauch-Segment in der Kapillare zu ziehen.</li>
	<li>Dichtung unten der gefüllten Kapillare drücken Sie sanft die gefüllte Kapillare in das Kapillarrohr Dichtungsmittel während der Anwendung eine sanfte Drehung und etwas Druck gegen das Fach.</li>
	<li>Trennen Sie die 100 µL festen Volumen Pipette und Tipp von der Kapillare, sicherzustellen, dass die Kapillare bleibt fest eingebettet in das Kapillarrohr Dichtungsmittel.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kapillare aus dem Kapillarrohr Dichtstoff Fach, wischen Sie mit einem Isopropyl-Alkohol-Pad und sicherzustellen Sie, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, durch sanft streichen der Unterseite der Kapillare.</li>
	<li>Legen Sie die Kapillare in das DLS-System.</li>
</ol>4. durchführen die DLS-test
<ol><li>Wählen Sie die MP-Test-Option, einen neuen DLS-Test zur Messung des Mikropartikel-Inhalts einer Thrombozytenzahl Probe zu initiieren.</li>
	<li>Geben Sie die Beispielinformationen (Spende Identifikation Zahl (ISBT), Ablaufdatum Sammlung/Produktion und Produkt-Code) mit dem Barcodescanner oder manuell.</li>
	<li>Wenn keine Produkt-Code verfügbar ist aus dem DLS-System können die flüssigere Mitte Informationen zu extrahieren, wählen Sie manuell die entsprechenden flüssige Medium (für die meisten Plättchen Konzentrate wählen Sie Plasma aber für Proben, die Thrombozyten Additive Lösung (PAS), geben Sie die Prozentsatz der verbleibenden Plasma). Hinweis: Eine kleine Abweichung in der PAS-Prozentsatz von nominal 65 % einen kleinen Fehler in der Viskosität (automatisch berechnet, indem das DLS-System) bewirkt die minimal berechneten MP Radius aber nicht % MP betrifft.</li>
	<li>Legen Sie die Kapillare in das DLS-System, wenn Sie dazu aufgefordert, und starten Sie den Test.</li>
	<li>Wenn der Test abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe aus der Kapillare Halter und entsorgen der Verbrauchsmaterialien entsprechend nach Anlage Richtlinien. Entfernen Sie die Probe aus der Kapillare Halter und entsorgen der Verbrauchsmaterialien entsprechend nach den Richtlinien der Anlage.</li>
	<li>Tag die Thrombozyten-Tasche mit der Farbe für das Ergebnis, zum Beispiel orange für nicht aktivierte (homogene) mit % MP gleich oder unter 15 % und rosa für mit % MP über 15 % (heterogene) aktiviert.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig1.jpg"> Abbildung 1 : Methode Übersicht. Übersicht über die Schritte für die routinemäßige Thrombozyten Bestandsführung in einer Blutbank Krankenhaus durchgeführt werden: Erlangung einer Probe aus einem Plättchen Konzentrat, laden die Probe in der Kapillare für DLS-Messung, Ermittlung Mikropartikel testen Durchführung der DLS und mit den gemeldeten Mikropartikel Content, aktivierte Thrombozyten zu identifizieren. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

EMS ist der Gründer der LightIntegra Technology Inc., ein Unternehmen für medizinische Geräte, das ThromboLUX-System für Mikropartikel und Thrombozyten Qualitätsprüfung zu entwickeln. Alle anderen Autoren sind Mitarbeiter der LightIntegra-Technologie. Produktion und freien Zugang zu diesem Artikel sind von LightIntegra Technology Inc. gesponsert.

Dieses Protokoll beschreibt eine dynamische Lichtstreuung Methode für Mikropartikel-Screening für die hohen Partikelkonzentrationen in biologischen Proben gefunden, wie z. B. Thrombozyten konzentriert sich optimiert. Die Methode der DLS ist von Natur aus standardisiert, um die Größe genau zu messen. Die relative Konzentration der Mikropartikel kann eine absolute Konzentration umgewandelt werden, wenn die Thrombozyten Konzentration bekannt ist und die Thrombozyten Peakfläche als Referenz Spitze19 dient. Als Thrombozyten Konzentrationen sind in der Regel mit Hämatologie Analysegeräte erhalten oder fließen Cytometers dieser Methoden können als Begleiter Technologien an Verteilerlisten.
Die Funktionalität des Systems der DLS ist versichert durch Kontrolle Perlen regelmäßig ausführen. Destilliertes Wasser kann gemessen werden, um sicherzustellen, dass Hintergrundgeräusche minimal ist. Handelsübliche Plättchen Normen können als MP-Negative Kontrollen und nach Zugabe von 125 nm Radius Perlen, als MP-positiv-Kontrolle analysiert werden. Innerhalb der biologischen Bereich der MP-Konzentrationen von Interesse sind die Verfahren praktisch und schnell als Teil der Blutbank-Routine durchführen.
Im Gegensatz zur Durchflusszytometrie basiert diese Methode nicht auf dem Vergleich der Streuung Intensitäten von Teilchen sondern die Geschwindigkeit ihrer Brownsche Bewegung. So Exosomen auch trotz ihrer geringen Größe erkannt werden und von MP gesondert ausgewiesen.
Die Grenzen dieser Methode entworfen als Screening-Instrument, und beziehen sich auf seine Unfähigkeit zur Unterscheidung verschiedener Arten von Mikropartikeln. Gibt es mögliche Verbesserungspotenzial, wenn zusätzliche Isolierung Schritte verwendet werden; Proben konnte getestet werden, bevor und nachdem die spezifischen Entfernung von Mikropartikeln durch Antikörper magnetischer Wulst Erfassung gekoppelt. Darüber hinaus kann nicht davon ausgegangen werden, dass alle gefundenen Mikropartikel sind Zelle abgeleitet, weil Chylomikronen gegründet Hyperlipidämie47,48 und kleine Bakterien oder Viren6 auch im Bereich von Mikropartikel gemeldet werden. Jedoch gibt es andere Sicherheitsmaßnahmen innerhalb der Blut-Versorgungsmaterial zu stark Lipämische oder kontaminierte Thrombozyten Blutbank Krankenhausinventar eingeben.
Die Auswahl der Antigerinnungsmittel in der Probe beeinflusst das Ausmaß der Thrombozyten Aktivierung und somit die MP Inhalt49. Dieser Faktor muss für Vergleiche verschiedener Produkte berücksichtigt werden. Darüber hinaus wirken sich Austausch von Plasma mit MP frei aufgehängt Medien wie PAS der MP-Inhalt und die Schwelle für die Bestimmung der Heterogenität-wenn nur noch etwa ein Drittel des ursprünglichen MP-Inhalts innerhalb des verbleibenden Plasmas im Konzentrat ist ein entsprechend zeigt die Untergrenze MP Inhalt das gleiche Maß an Thrombozyten Aktivierung wie 100 % Plasma. Prozentuale MP ist der MP-Gehalt bezogen auf Thrombozyten. Es wurde bereits berichtet, dass die durchschnittliche Thrombozytenzahl PAS Produktes niedriger war, so dass die durchschnittliche % MP noch 9,5 %19war. Die Schwelle von % MP für PAS Thrombozyten in den USA lizenziert ist derzeit auf 10 % festgelegt.
Während die primäre Quelle von MP in Thrombozyten-Konzentrate der Spender ist, Prozesse, die Stress, Blutplättchen verursachen werden den verstärken MP je nach Anfälligkeit der Plättchen zu betonen-Thrombozyten bereits stark aktiviert, kleinere Stressoren wie verlängerte Haltbarkeit, Erreger Inaktivierung, waschen, könnte Bestrahlung oder Fernverkehr zu deutlichen Anstieg MP Inhalte führen. Keiner von diesen Stressoren haben gezeigt, dass homogene, nicht aktivierte Thrombozyten19erheblich beeinträchtigen. Darüber hinaus sollte Aufmerksamkeit auf das Potential für Veränderungen in der Zusammensetzung der Probe innerhalb der Kapillare bezahlt wenn nicht sofort nach der Zubereitung (Abschluss von Schritt 3 dieses Protokolls) getestet.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Bestimmung der Zusammensetzung der Partikel in Thrombozytentransfusionen und Mikropartikel als Biomarker der Thrombozyten Aktivierung verwenden. Die Thrombozytentransfusionen sind als entweder nicht aktiviert (Orange) markiert oder aktiviert (rosa) basierend auf einem Mikropartikel prozentuale Schwellenwert von 15 %. Die Schwelle von 15 % MP für Thrombozyten in 100 % Plasma wurde empirisch bestimmt alsder Durchschnitt 66-Perzentil aus mehreren Standorten .
Thrombozyten-Inventar-Management basierend auf Routine Mikropartikel screening mit DLS soll Patienten Pflege und Laufwerk Kosteneffizienz zu verbessern, indem nicht-immunen Thrombozyten Feuerfestigkeit zu verhindern. Die Umsetzung der DLS-System für das Screening von Thrombozyten Taschen wird dem Benutzer nicht aktivierte Thrombozyten zu Patientengruppen mit einem Risiko für die Entwicklung von Thrombozyten Feuerfestigkeit direktesten ermöglichen.

Das Interesse an Mikropartikel hat sich vor allem um ihre Beteiligung an der Zelle zu Zelle Kommunikation und biologische Prozesse gedreht. 1 , 2 , 3 vor kurzem, haben Mikropartikel auch Interesse als potentielle frühe diagnostische Marker für Autoimmun- und Herz-Kreislauf-Krankheiten angezogen. 4 , 5 Mikropartikel, auch bekannt als extrazelluläre Vesikel oder Exosomen, wurden weitgehend durch Durchflusszytometrie untersucht. Leider, trotz Bemühungen, konventionelle Flow Cytometry Protokolle zu standardisieren gibt es keinen Konsens über die optimale Protokoll zu verwenden. 6 , 7 , 8 , 9 , 10
Obwohl konventionelle Durchflusszytometrie spezifische MP Subpopulationen charakterisieren kann, berichtet11 es hat einige Einschränkungen. 11 , 12 , 13 , 14 diese Einschränkungen behandelt wurden mit höheren-Power-Laser und Detektoren in einem so genannten "kleinen Partikeln Option",15,16 , sowie Erkennung bei 15-25 ° nach vorne streuen Winkel und Scheide Druck geändert . 17 , 18 jedoch ist eine schnelle und einfach zu bedienende Screening-Methode, die mit diesen raffinierten Methoden kombinierbar sind erforderlich, um Mikropartikel als frühe diagnostische Marker zu nutzen. Erhöhte Konzentrationen von Mikropartikeln in etwa ein Drittel der normalen Blut Spender19 nachweisbar sind und könnte darauf hindeuten, subklinische Bedingungen. Daher möglicherweise hohen Mikropartikel Ebenen in gespendetes Blutprodukte mit gefährdeten Empfängern kompatibel. 20
Bei der Bereitstellung von Thrombozytentransfusionen besteht nicht-immunen Feuerfestigkeit - ein Zustand, wobei den Körper des Patienten weist in Folge Transfusionen und nicht zulassen, dass einen erheblichen Teil der Thrombozyten zirkulieren. 21 , 22 kann nicht-immunen Feuerfestigkeit verschwendet Transfusionen, gesundheitlichen Komplikationen für Patienten und erweiterte Krankenhaus bleibt. 23 mit hohen Zahlen von Mikropartikeln Thrombozytentransfusionen können ein entscheidender Faktor für die Entwicklung der nicht-immunen Feuerfestigkeit in gefährdeten Hämatologie-Onkologie-Patienten sein. 20 es ist möglich, die Plättchen nach der Zusammensetzung des Thrombozytentransfusionen durch Screening für Mikropartikel, wodurch sich das Risiko für gefährdete Patienten Inventarverwaltung. Jedoch die meisten Mikropartikel-Tests erfordern Isolation der Mikropartikel von Thrombozyten5,12 oder sonst sehr arbeitsintensiv sind intensive24,25 und kann daher nicht routinemäßig im Krankenhaus umgesetzt werden Blutbanken.
Die beschriebene Technik nutzt hier dynamische Lichtstreuung (DLS) - auch bekannt als Photon Korrelation Spektroskopie oder quasi-elastischer Lichtstreuung. Seit Jahrzehnten wurde dynamische Lichtstreuung ausgiebig in der pharmazeutischen Industrie zur liposomalen Wirkstoff-Formulierungen oder Emulsionen zu charakterisieren sind wo Partikelgrößen im Sub-Mikrometer-Bereich. 26 , 27 jedoch sind für diese Anwendungen entwickelten Tools nicht Bildschirm Blutprodukte optimiert. Ein neues DLS-System wurde entwickelt, um technische Grenzen zu überwinden und dynamische Lichtstreuung für das Screening von Thrombozytentransfusionen nützlich zu machen. 28
Dynamische Lichtstreuung Messung erfolgt durch die suspendierten Teilchen mit Laserlicht beleuchtet und Analyse der zeitlichen Abweichungen der gestreuten Lichtintensität als Folge von Partikeln bewegen in der Schwebe. Darüber hinaus verwendet diese Methode die inverse Beziehung zwischen Partikelgeschwindigkeit und Größe - kleine Partikel bewegen sich schnell und große Partikel bewegen sich langsam - Informationen über die Größenverteilung und relativen Konzentrationen der Probe Komponenten. Mit DLS, die mittlere Mikropartikel kann Inhalte und mittleren Radius der Mikropartikel Komponente quantifiziert werden. Der Inhalt der Mikropartikel im Blutprodukt wird % MP auf Grundlage des Bereichs im gemessenen Histogramm für Partikel Radien von 50 bis 550 nm angegeben. Während Partikel mit Radien unter 50 nm von DLS erkannt und gemeldet durch das DLS-System, sie sind nicht in % MP enthalten sind. Anstatt Mikropartikel von Blutplättchen zu isolieren, wird die Heterogenität der Thrombozytentransfusionen anhand der relative Inhalt von Mikropartikeln und Plättchen in einer Probe bestimmt. In der Tat kann das Verhältnis der Thrombozyten und Mikropartikel Gipfel verwendet werden, um die absolute Konzentration der MP zu berechnen, wenn die Thrombozytenzahl bekannt ist. 19
Das DLS-System bietet medizinischem Fachpersonal mit qualitativen und quantitativen Informationen über Mikropartikel gefunden in Proben aus menschlichem Blut oder Blutprodukte abgeleitet. Der größte Vorteil der beschriebenen DLS-Technik über alternative Techniken wie Durchflusszytometrie, Elektronenmikroskopie,29 Nanopartikel tracking Analyse30 oder abstimmbaren resistiven Puls spüren31 ist die Probenvorbereitung: Aliquote von Thrombozyten-Konzentraten können direkt gemessen werden, ohne die Notwendigkeit, MP von Thrombozyten, Probenverdünnung oder andere Änderungen zu isolieren. 9 , 17 außerdem DLS ist eine absolute Dimensionierung Methode und leidet nicht die mangelnde Kalibrierung Perlen mit entsprechenden Brechungsindex. 14 , 32
Eine Korrelation zwischen Thrombozyten Aktivierung und MP Inhalt wurde zuvor durch Mikroskopie33,20 gezeigt und kann von der Erhöhung des Anteils der MP in pathologischen Zuständen15,34, abgeleitet werden 35 , 36 und unter in-vitro- Bedingungen bekannt, Thrombozyten zu aktivieren. 19 , 37 , 38 jedoch sind weitere Studien erforderlich, um die Beziehung der DLS gemessen Mikropartikel Inhalt und Thrombozyten Aktivierung vollständig zu verstehen. Basierend auf unserem derzeitigen Kenntnisstand, dass aktivierte Thrombozyten hohe Zahl von Mikropartikeln, enthalten sie sind am besten für therapeutische Behandlung aktiv Patienten39, Blutungen, während Hämatologie-Onkologie-Patienten von nicht aktivierten profitieren verwendet Thrombozyten mit Nein oder niedrige Konzentrationen von Mikropartikeln20. Es wurde kürzlich berichtet, dass in Vitro Reaktionsfähigkeit des Spenders Thrombozyten nicht deutlich die Erholung und das Überleben der diese Plättchen in einzelnen Transfusionen, stabile und vor allem nicht blutend Hämatologie-Onkologie Patienten40 Auswirkungen . Aus dieser Befund könnte geschlossen werden, dass Thrombozyten Aktivierung durch hohen Gehalt an MP identifiziert auch keine bedeutende Rolle in der prophylaktischen Behandlung von Patienten spielt. Jedoch wegen der engen Auswahl der Patienten dieser Studie nicht eingegangen die Auswirkungen der Spender Faktoren für komplexe Patienten, die Fieber (aus der Studie ausgeschlossen), nicht stabil und viele mehr als nur ein Thrombozyten-Transfusion zu erhalten. Die Frage, wie die Komplexität dieser Patientenfälle reduziert werden kann - die hält das Versprechen, Feuerfestigkeit zu reduzieren - bleibt unbeantwortet.
Mikropartikel sind frühe Marker der Entzündung41,42,43,44 und Thrombozyten Aktivierung45 und sind daher in vielen normalen Spendern erkannt. 19 folglich sind aktivierten Thrombozyten und Mikropartikel in Thrombozyten spenden. Es ist vernünftig zu vermuten, dass Patienten mit Fieber, d. h. eine vollständig aktivierten angeborenen Immunsystems, die zusätzliche Herausforderung, eine Transfusion von aktivierten Thrombozyten nicht tolerieren können. Allerdings sind Untersuchungen erforderlich, um diese Hypothese zu beweisen. Mikropartikel Screening kann lindern die derzeitige Unsicherheit über den Inhalt der Thrombozytentransfusionen und reduzieren die Komplexität der Behandlung von Patienten.
Das Verhältnis von aktivierten, nicht aktivierte Thrombozyten in einer Blutbank Krankenhaus richtet sich in erster Linie auf die Spender-Bevölkerung und in viel geringerem Maße auf Verkehr, Bestrahlung, Erreger Inaktivierung und andere Prozesse, die Thrombozyten Aktivierung im zunehmen Konzentrate. 19 Daten aus großen Krankenhausblutdepots in den Vereinigten Staaten hat gezeigt, dass die durchschnittliche Zusammensetzung des Inventars Thrombozyten 49 % aktiviert und 51 % nicht aktiviert (Bereich für aktivierten Thrombozyten: 38-62 %, persönliche Kommunikation). Wenn Blut Produktanbieter oder Krankenhausblutdepots wissen wollen, wieviele aktivierten und nicht aktivierten Thrombozyten-Konzentrate, sie produzieren oder erhalten, und ihr Inventar verwalten möchten, basiert auf Thrombozyten Aktivierung angedeutet durch Mikropartikel Inhalt, dies Protokoll kann für sie sinnvoll sein.
Basierend auf Thrombozyten Zusammensetzung eine Blutbank Krankenhaus in der Lage werden, direkte nicht aktivierte, homogene Plättchen für prophylaktische verwenden und aktiviert, heterogene Thrombozyten für den therapeutischen Einsatz. Thrombozyten-Screening kann Krankenhäuser, Nutzung des verfügbaren Lagerbestands zu maximieren die Patientenversorgung verbessert und verringert Kosten. Dieses Protokoll ist für Laborpersonal gedacht, die grundlegende Bedienung und Manipulation von Blutprodukten kennen.
Präsentiert hier ist eine Screening-Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen, die routinemäßig angewendet werden können, um Krankenhausinventar Blutbank verwalten wenn Produktauswahl basierend auf Mikropartikel Inhalt gewünscht wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Durchführung und Auswertung von DLS für das Screening von gespendeten Thrombozyten zu skizzieren. Das beschriebene Protokoll befasst sich mit der häufig gestellte Fragen von nicht-invasiven Zugang zu Proben, Integration von Tests in der Blutbank Arbeitsablauf und Leistungsmerkmale.

<table><tbody><tr><td>ThromboLUX-M</td><td>LightIntegra Technology Inc.&nbsp;</td><td>LPN120</td><td>DLS System</td></tr><tr><td>ThromboSight Software</td><td>LightIntegra Technology Inc.&nbsp;</td><td>LPN124</td><td>DLS-Analysesoftware</td></tr><tr><td>Kapillaren</td><td>LightIntegra Technology Inc. (im Testkit enthalten, Anbieter Optinova MLE)</td><td>LPN065</td><td>Kundenspezifisches extrudiertes, nicht aktivierendes, nicht doppelbrechendes Kunststoffrohr, inspiziert und bestrahlt</td></tr><tr><td>MiniPet&nbsp;</td><td>LightIntegra Technology Inc. (im Testkit enthalten, Anbieter TriContinent Scientific)</td><td>LPN082</td><td>100 & micro; L Pipette mit festem Volumen für die Probenahme&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex 1-200 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>LightIntegra Technology Inc. (im Testkit enthalten, Anbieter ESBE Scientific)</td><td>LPN080</td><td>Pipettenspitzen für die Probenahme</td></tr><tr><td>Critoseal&nbsp;</td><td>LightIntegra Technology Inc. (im Testkit enthalten, Anbieter Fisher Scientific)</td><td>LPN075</td><td>Capillary Tube Sealant</td></tr><tr><td>Dukal Alcohol Pad oder gleichwertig</td><td>LightIntegra Technology Inc. (im Testkit enthalten, Anbieter Dukal Corp.)</td><td>LPN085</td><td>Isopropyl-Pad (getränkt mit 70 % Isopropylalkohol)</td></tr><tr><td>Kontrollperlen, 50 nm Radius</td><td>LightIntegra Technology Inc. (im Testkit enthalten, Anbieter PolySciences Inc.)</td><td>LPN128</td><td>Kontrollperlen</td></tr><tr><td>Mikrobeads NIST Rückführbare Partikelgröße Standard, 3 & Mikro; m</td><td>PolySciences Inc.</td><td>64060</td><td>Standard-Mikroperlen: 1,5 & Mikro m Radius Polystyrolperlen; Bereich 1,43-1,58 &Mikro; m; 1 % Feststoffsuspensionen in entionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm</td><td>PolySciences Inc.</td><td>64014-15</td><td>Standard-Nanokügelchen: Polystyrolkügelchen mit einem Radius von 125 nm; Bereich 120 - 130 nm; 1 % Feststoffsuspensionen in entionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>Genesis BPS RapidSeal II oder gleichwertig Genesis</td><td>BPS</td><td>428-SE640</td><td>Tubenversiegeler</td></tr><tr><td>Fresenius Kabi Tube oder gleichwertig</td><td>Fresenius Kabi</td><td>6R4452</td><td>Manueller Tubenstripper</td></tr><tr><td>Biohazard Shield - Cell Counter oder gleichwertig</td><td>CardinalHealth</td><td>S1389-75</td><td>Splash Shield</td></tr><tr><td>Corning LSE Vortex-Mischer oder gleichwertig</td><td>Corning Incorporated</td><td>6775</td><td>Vortex-Mischer</td></tr><tr><td>FACSCanto II Durchflusszytometer mit FACSDiva-Software Version 6.1.3 oder gleichwertig</td><td>BD Biosciences</td><td>338960</td><td>Durchflusszytometer</td></tr></tbody></table>

routine-screening methode für mikropartikel in thrombozytentransfusionen

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Thrombozyten-Inventar-Management basierend auf screening-Mikropartikel Inhalte in Thrombozyten-Konzentraten ist eine neue Qualität Verbesserungsinitiative für Krankenhausblutdepots. Zellen-Fragment aus Mikropartikel (MP), wenn sie gestresst sind. Blut und Blut können Zellfragmente aus einer Vielzahl von Zellen, vor allem von aktivierten Thrombozyten enthalten. Bei der Durchführung ihrer Rolle als angeborene immune Zellen und Hauptakteure in Blutgerinnung und Blutstillung Thrombozyten verformen und Mikropartikel zu generieren. Mit dynamischen Lichtstreuung (DLS)-basierte Mikropartikel-Erkennung, es ist möglich, aktivierte (hohe Mikropartikel) von nicht aktivierten (niedrige Mikropartikel) Plättchen im Transfusionen unterscheiden, und optimieren den Einsatz von diesem knappen Blutprodukt. Bisherige Untersuchungen zeigen, dass nicht aktivierte Thrombozyten für den prophylaktischen Einsatz in Hämatologie-Onkologie-Patienten könnte ihr Risiko reduzieren des Werdens feuerfesten und Verbesserung der Patientenversorgung. Das Ziel dieser Screening-Methode ist routinemäßig zu unterscheiden von nicht aktivierten Thrombozyten aktiviert. Die hier beschriebene Methode beschreibt die Schritte für die routinemäßige Thrombozyten Bestandsführung in einer Blutbank Krankenhaus durchgeführt werden: Erlangung einer Probe aus einer Thrombozyten-Transfusion, laden die Probe in der Kapillare für DLS-Messung, Durchführung der DLS zu testen identifizieren Sie Mikropartikel und mit den gemeldeten Mikropartikel-Inhalt zu aktivierte Thrombozyten identifizieren.

Durchschnittliche Zubereitungszeit Die Thrombozyten screening-Prozess mit einem DLS-System ist in Abbildung 1zusammengefasst. Thrombozyten sind zum Zeitpunkt des Eingangs des Blut-Lieferanten mit dem DLS-System getestet. Wie in Tabelle 1 beschrieben, ist die durchschnittliche Zubereitungszeit für geschulte Anwender 2 min 23 s während der Aufräumarbeiten und Posttest Arbeitszeiten sind 14 s und 46 s, beziehungsweise. Insgesamt dauert der durchschnittliche Benutzer 3 min und 23 s Handhabungszeit pro Test.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Aktivität</td>
			<td>Aktive Zeit</td>
			<td>Walk-away Testzeit</td>
			<td>INSGESAMT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DLS System vorbereiten</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Probenahme-Werkzeug zu montieren</td>
			<td>28 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Segment zu erhalten</td>
			<td>52 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Füllen Sie die Kapillare und starten test</td>
			<td>49 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Aufräumarbeiten</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tag und Inventar Thrombozyten-Tasche</td>
			<td>46 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtzeit pro Probe benötigt</td>
			<td>3 min 23 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>8 min 23 s</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: aktive Tests Zeit Aufschlüsselung. Der Test selbst ist ein Spaziergang entfernt Test mit einer durchschnittlichen Dauer von 5 Minuten. Der durchschnittliche Benutzer dauert 3 min 23 s das DLS-System auf einen Test vorbereiten, erhalten eine Probe nach diesem Protokoll zu testen und markieren die Thrombozyten-Tasche.
Präzision Die Präzision der DLS-System wurden auf drei Ebenen der Mikropartikel, 0-7 %, 12-25 % und 28-75 %. Es ist klinisch relevante an % MP 3-75 %. Zwei Operatoren niedriger, mittlerer und hoher Kontrollproben auf 16 Betriebstagen auf zwei DLS-Systemen parallel getestet. Proben wurden in zweifacher Ausfertigung, aber in zufälliger Reihenfolge auf jedem Testtag getestet.
Tabelle 2 fasst die im Gerät Präzision der DLS Messungen für Prozent Mikropartikel (% MP) bezogen auf Thrombozyten.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Mikropartikel Inhalt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Low</td>
			<td>Medium</td>
			<td>Hoch</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meine % MP (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>19.5</td>
			<td>53,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standardabweichung (%)</td>
			<td>1.8</td>
			<td>2.6</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>LEBENSLAUF (%)</td>
			<td>40,4</td>
			<td>13.2</td>
			<td>10.6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Prozent Mikropartikel (% MP) im Gerät Präzision. Bei sehr niedrigen Mikropartikel-Inhalte, die kleinen Plättchen % beitragen können erhöht MP was Variabilität für niedrige Mikropartikel zufriedene Beispiele.
Tabelle 3 zeigt die im Gerät Präzision der DLS Messungen für durchschnittliche Mikropartikel Radius zwischen 50-550 nm.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Mikropartikel Inhalt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Low</td>
			<td>Medium</td>
			<td>Hoch</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meine Radius (nm)</td>
			<td>331</td>
			<td>161</td>
			<td>188</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standardabweichung (mm)</td>
			<td>133</td>
			<td>41</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>LEBENSLAUF (%)</td>
			<td>40.1</td>
			<td>25.2</td>
			<td>13.5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: im Gerät Präzision Mikropartikel Radius. Bei sehr niedrigen Mikropartikel Inhalt kleine Plättchen können dazu beitragen, Prozent Mikropartikel (% MP) wiederum erhöhte Variabilität für niedrige Mikropartikel zufriedene Beispiele.
Tabelle 4 zeigt die Reproduzierbarkeit der Messungen der DLS für Prozent Mikropartikel (% MP).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Mikropartikel Inhalt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Low</td>
			<td>Medium</td>
			<td>Hoch</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meine % MP (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>29.2</td>
			<td>53,6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reproduzierbarkeit (%)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>LEBENSLAUF (%)</td>
			<td>35</td>
			<td>11.8</td>
			<td>9.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Reproduzierbarkeit der dynamischen Licht Streuung (DLS) Messungen für Prozent Mikropartikel (% MP).
Linearität Abbildung 2 zeigt, dass DLS Ergebnisse linear sind, d.h., passen eine gerade Linie in Bezug auf die zugewiesenen Werte der Proben. Sieben Proben wurden mit unterschiedlichen Mikropartikel Inhalt erstellt. Proben mit hohen (MP7), niedrig (MP1) Mikropartikel Inhalt und passende Plättchen Konzentration wurden vorbereitet und gemischt in unterschiedlichen Verhältnissen zwischen Proben (MPX) erstellen. Proben wurden mit Durchflusszytometrie bereits19 und DLS beschrieben getestet und % MP Ergebnisse bei jeder Konzentration aufgetragen wurden als Eingang und Ausgang. Der Bestimmungskoeffizient erwies sich 0.985. Beispiele von DLS Histogramme für die niedrigen und hohen Mikropartikel Inhalte sind in Abbildung 3dargestellt. Die DLS-Ergebnisse wurden durch Durchflusszytometrie (Abbildung 3B) bestätigt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig2.jpg"> Abbildung 2 : Vergleich der Durchflusszytometrie und DLS Ergebnisse. Lineare Beziehung zwischen % MP bestimmt durch Flow Cytometry (Eingang) und DLS (Ausgang), die DLS Originaldaten aus den zwei Proben durch die offene Symbol ○ markiert in Abbildung 3dargestellt sind. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig3.jpg"> Abbildung 3 : Mikropartikel Inhalt zwischen aktivierten und nicht aktivierten Thrombozyten zu unterscheiden. (A) DLS Ergebnisse von MP-Inhalten in aktivierten Thrombozyten (gestrichelte Linie) betrug 57 % gegenüber 4 % im nicht aktivierten Thrombozyten (durchgezogene Linie). Tests wurden durchgeführt, bei einer Messung Temperatur von 37 ° C, Plasma-Viskosität-Einstellung von 1,06 X10-3 Pa·s und Gesamtintensität Einstellungen zwischen 200-600 kHz. (B) Flow Cytometry Ergebnisse (wie zuvor beschrieben19) der gleichen Proben wie in (A); in der forward Scatter-Histogramme stellen P1 und P2 bzw. der MP und Thrombozyten Tore; für aktivierte Thrombozyten fiel (links) 76 % der Ereignisse in der MP-Tor im Vergleich zu 6 % für nicht aktivierte Thrombozyten (rechts). Der linearen Regressionsgeraden schlägt einen konstante relativen Beitrag von Hintergrundgeräuschen % MP Durchflusszytometrie zu immer höheren Ergebnissen führt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Spezifität/Störungen Die International Organization for Standardization (ISO) definiert analytische Spezifität als die Fähigkeit eines Messverfahrens zu erkennen oder nur die Messgröße zu messen, während andere Größen in der Probe vorhanden sind. Die analytische Spezifität der Mikropartikel Screening könnte von Erythrozyten (RBC) betroffen sein. DLS misst MP Inhalt bezogen auf Thrombozyten Inhalt. RBC könnte stören, da die Streuung Beitrag der RBC der Streuung von Thrombozyten, Beiträge enthalten ist Reduzierung des relative Beitrags der MP. Grenzwerte für den zulässigen Inhalt der RBC in Blutprodukten vorhanden sind; eine konservative Konvertierung der Schwelle empfohlen von AABB für zulässige RBC-Konzentration in Thrombozyten-Konzentrate-2 mL verpackt RBC in einer Einheit von Blutplättchen führte 8.0 X1010 Zellen/L (Annahmen: RBC-Volumen beträgt 8,5 X10-14L, Hämatokritwert des verpackten RBC ist 68 %, Thrombozyten-Einheit beträgt 200 mL). Die gemeldeten residualen RBC-Konzentrationen in verschiedenen Produkten liegen deutlich unter dieser Schwelle46.
Drei verschiedene Spendern stiftete Thrombozyten und Erythrozyten (RBC) an zwei verschiedenen Tagen, als Anspruch auf drei unabhängigen Experimenten. Der ursprüngliche Inhalt der RBC in den Thrombozyten-Konzentrate (Referenzprobe) war 0,05 - 0,15 X109 Zellen/L mit einem Hemocytometer bestimmt. Fünf zusätzliche Proben wurden von Spick-in bekannten Größen der RBC in Aliquote der Thrombozyten-Konzentrat erstellt; RBC Zielwerte in diesen Proben wurden 1.0 5.0, 10, 40 und 80 X109 Zellen/L.
Die Schwelle der Störungen der roten Blutkörperchen war ca. 1,0 X1010 Zellen/L (Abbildung 4), die auch mit dem Niveau korreliert bei der war das Vorhandensein von roten Blutkörperchen visuell erkennbar (Abbildung 5). Oberhalb dieser Ebene wurde % MP unterschätzt, was bedeutet, dass in visuell rot, die Proben enthalten RBC, anstatt Hämoglobin-die gemeldeten Mikropartikel Inhalte werden zu niedrig.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig4.jpg"> Abbildung 4 : Lineare Beziehung zwischen % MP (DLS) und RBC Konzentration (Zellen/L). Erhöhung der RBC-Konzentrationen von 0,1 X109, 1,0 X109, 5.0 X109, 1,0 X1010, 4.0 X1010und 8.0 X1010 Zellen/L (von links nach rechts) aus 3 unabhängigen Experimenten (○ Experiment 1, ● Experiment 2, □ Experiment 3, sind für jedes Experiment lineare Regression Linien dargestellt). Über 1,0 X1010 RBC/L führt zur Unterschätzung der % MP. Visuelle Darstellung von RBC enthaltenden Proben ist in Abbildung 5dargestellt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig5.jpg"> Abbildung 5 : Visuelle Erscheinungsbild der RBC mit Proben. Rötung der Thrombozyten Proben mit RBC-Konzentrationen von 0,1 X109, 1,0 X109, 5.0 X109, 1,0 X1010, 4.0 X1010und 8.0 X1010 Zellen/L von links nach rechts. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Genauigkeit Genauigkeit ist definiert als der Unterschied zwischen einer Einzelmessung Ergebnis und eine wahre Mengenwert der Probe zugeordnet. Dieser Messfehler enthält eine systematische Komponente geschätzt durch Messung Vorspannung und eine zufällige Komponente von einer Standardabweichung geschätzt. Somit ist die Genauigkeit der ein Messergebnis eine Kombination aus Richtigkeit und Präzision.
Eine Perle standard wurde verwendet, um die Genauigkeit des DLS Tests zu bestimmen. Genauigkeit wurde in zwei Konzentrationen innerhalb von klinisch relevanten Bereich des Assays der MP 3-75 % bewertet. Referenz-Korn-Mischungen wurden verwendet, um Proben der bekannten Konzentrationen vorbereiten, denn Referenz Perlen eine bekannte Größe und Konzentration haben. Infolgedessen können Referenz Perlen gemischt werden, um Proben mit gewünschten Partikelgrößen und Konzentration zu erhalten.
Standard-Polystyrol-Kügelchen mit einem 125 nm Radius wurden verwendet, um Mikropartikel darzustellen und Perlen mit 1,5 µm Radius dienten, Thrombozyten zu vertreten. Die Genauigkeit der Mikropartikel-Assay wurde mit Wulst Mischungen von ca. 20 % und 50 % MP Inhalt bewertet. Die Genauigkeit der gemessenen Partikel Radien war im Vergleich zu den Partikel-Radien dokumentiert auf Analysenzertifikate für die Referenz-Perlen wie in Tabelle 5dargestellt.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">125 nm Perlen</td>
			<td colspan="3">1,5 µm Perlen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td>Analysezertifikat</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>Analysezertifikat</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>20 % MP</td>
			<td>50 % MP</td>
			<td></td>
			<td>20 % MP</td>
			<td>50 % MP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meine Radius</td>
			<td>122.0</td>
			<td>113,8</td>
			<td>124,4</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>1.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>Std Dev</td>
			<td>4.5</td>
			<td>2,83</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0,035</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV</td>
			<td>3,60 %</td>
			<td>2,48 %</td>
			<td>2,89 %</td>
			<td>2,20 %</td>
			<td>3,74 %</td>
			<td>4.05 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genauigkeit</td>
			<td></td>
			<td>6,70 %</td>
			<td>2,00 %</td>
			<td></td>
			<td>6,50 %</td>
			<td>6,30 %</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 5: Genauigkeit der Messungen der dynamischen Licht Streuung (DLS). Größenvergleich für DLS führt gegen Analysezertifikat für Perlen mit 125 nm Radius und 1,5 µm Radius in Mischungen.

Thrombozyten-Inventar-Management basierend auf screening-Mikropartikel Inhalte in Thrombozyten-Konzentraten ist eine neue Qualität Verbesserungsinitiative in Krankenhaus-Blutbanken. Das Ziel ist, aktiviert von nicht aktivierten Thrombozyten zur Optimierung der Nutzung von Blutplättchen zu unterscheiden. Eine nicht aktivierte Thrombozyten für Hämatologie-Onkologie-Patienten könnte ihr hohe Risiko feuerfesten zu reduzieren.

Routine-Screening Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Thrombozytentranfusionen durch Routinetests zu charakterisieren, die in Spenderzentren oder Blutbanken von Krankenhäusern durchgeführt werden können, um den Einsatz dieser Blutprodukte bei Blutungs- oder Blutkrebspatienten zu optimieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Transfusionsmedizin zu beantworten, z. B. ob eine Blutplättchentransfusion aktivierte oder nicht aktivierte Blutplättchen enthält. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein schnelles und genaues Screening des Mikropartikelgehalts als nachgewiesenen Indikator für die Thrombozytenaktivierung bietet.Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, müssen lernen, wie man Proben aus Schlauchsegmenten von Beuteln entnimmt, da dies derzeit nicht routinemäßig durchgeführt wird. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir sahen, dass Blutplättchen von verschiedenen Spendern eine hohe Variabilität im Aktivierungsstatus aufwiesen, was sich auf den Patienten auszuwirken schien. Es gibt drei Methoden, um eine Probe aus einem Thrombozytenkonzentrat zu gewinnen.Um eine Probe aus einem Beutel zu nehmen, mischen Sie den Inhalt des Blutplättchenbeutels durch sanfte horizontale Bewegung fünf Sekunden lang gut und kippen Sie fünfmal von einem Ende zum anderen. Öffnen Sie die Klemme zum Beutel, der Beutel wird evakuiert und füllt sich von selbst. Es ist nicht notwendig, den Beutel vollständig zu füllen, da nur eine 100-Mikroliter-Probe für die dynamische Lichtstreuung oder DLS-Prüfung benötigt wird.Trennen Sie den Beutel vom Beutel, indem Sie den Verbindungsschlauch mit einem Schlauchversiegeler heißversiegeln. Vergewissern Sie sich bei der Probenahme aus leeren Schläuchen, dass der Blutplättchenbeutelschlauch leer gelagert wurde und dass der Schlauchblock noch an Ort und Stelle ist. Überprüfen Sie den Schlauch visuell, um sicherzustellen, dass sich kein Thrombozytenkonzentrat im Schlauch befindet.Schließen Sie den Schlauchabisolierer auf dem Schlauch, so nah wie möglich am Schlauchblock, indem Sie die Griffe zusammendrücken, um den Schlauch zwischen die Rollen zu drücken, während Sie den Abisolierer geschlossen halten, und lösen Sie den Schlauchblock. Ziehe den Abisolierer langsam den leeren Schlauch hinunter, so dass sich der Schlauch langsam hinter dem Abstreifer füllt. Fahren Sie fort, bis sich der Abschnitt unter dem Abstreifer vollständig aufgeblasen hat oder bis sich der Abstreifer innerhalb eines Zentimeters vom Ende des Schlauchs befindet.Es ist wichtig, die Griffe des Abisolierers fest zusammenzudrücken und den Abisolierer langsam den Schlauch hinunter zu ziehen. Sobald der Stopppunkt mit dem Abisolierer erreicht ist, verwenden Sie den Schlauchversiegeler, um den Schlauch einen Zentimeter über dem Abisolierer heiß zu versiegeln. Lassen Sie nun die Griffe des manuellen Abisolierers los.Versiegeln Sie erneut ein bis zwei Zoll über der vorherigen Versiegelung, um das Testsegment zu erstellen. Schneiden Sie dann das Testsegment von der Thrombozyteneinheit ab. Dieses Segment wird für DLS-Tests verwendet.Wenn Sie Proben aus einem Schlauch nehmen, der nicht leer ist, hängen Sie den Beutel senkrecht auf und lösen Sie den Schlauchblock, falls er an Ort und Stelle ist. Überprüfen Sie den Schlauch visuell, um festzustellen, ob signifikante feste Klumpen vorhanden sind. Wenn feste Klumpen vorhanden sind, verschließen Sie sie darüber, so dass sie nicht in den Beutel abgezogen werden können.Schließen Sie als Nächstes den Abisolierer auf dem Schlauch, so nah wie möglich am abgedichteten Ende des Schlauchs. Entfernen Sie den Inhalt des Schlauchs in den Beutel, indem Sie die Griffe zusammendrücken, um den Schlauch zwischen die Rollen zu drücken. Bewegen Sie den Schlauchabisolierer unter Beibehaltung der Klemmkraft entlang des Schlauchs in Richtung Beutel.Nehmen Sie den Plättchenbeutel vom Aufhängehaken und mischen Sie den Beutel vorsichtig fünf Sekunden lang, indem Sie ihn fünfmal von einem Ende zum anderen kippen, während Sie den geschlossen halten. Hängen Sie den Beutel senkrecht auf, während Sie den Abisolierer geschlossen halten. Ziehe den Abisolierer langsam den leeren Schlauch hinunter, so dass sich der Schlauch langsam hinter dem Abstreifer füllt.Fahren Sie fort, bis sich der Abschnitt unter dem Abstreifer vollständig aufgeblasen hat oder bis sich der Abstreifer innerhalb eines Zentimeters vom Ende des Schlauchs befindet. Sobald der Stopppunkt mit dem Abisolierer erreicht ist, verwenden Sie den Rohrversiegeler, um den Schlauch einen Zoll über dem Abisolierer heiß zu versiegeln. Versiegeln Sie nach dem Lösen des Abstreifers erneut ein bis zwei Zoll über der vorherigen Versiegelung, um das Testsegment zu erstellen.Schneiden Sie den letzten Teil des Schlauchs ab und entsorgen Sie ihn. Schneiden Sie dann das Testsegment von der Thrombozyteneinheit ab. Dieses Segment wird für DLS-Tests verwendet.Schneiden Sie mit einem Spritzschutz und einer sauberen, trockenen Schere ein Ende des Beutelschlauchs oder des Testsegments ab. Füllen Sie die Kapillare sofort, indem Sie das Probenahmewerkzeug verwenden, um die Probe direkt aus dem geöffneten Beutel oder Schlauchsegment in die Kapillare zu entnehmen. Versiegeln Sie den Boden der gefüllten Kapillare, indem Sie sie vorsichtig in die Kapillarrohrdichtung drücken, während Sie eine sanfte Drehung und etwas Druck auf die Schale ausüben.Trennen Sie dann die 100-Mikroliter-Pipette und die Spitze mit festem Volumen von der Kapillare und stellen Sie sicher, dass die Kapillare fest in der Dichtmasse des Kapillarrohrs eingebettet bleibt. Nehmen Sie die Kapillare aus der Kapillarrohr-Dichtstoffschale und wischen Sie sie mit einem Isopropylalkohol-Pad ab. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, indem Sie vorsichtig auf den Boden der Kapillare schnippen.Setzen Sie abschließend die Kapillare in das DLS-System ein. Starten Sie zunächst die Konsole, folgen Sie den Anweisungen auf dem Touchscreen, um sich anzumelden, und wählen Sie die Option Mikropartikel- oder MP-Test aus, um einen neuen DLS-Test zur Messung des Mikropartikelgehalts einer Thrombozytenprobe zu starten. Geben Sie die Probeninformationen mit einem Barcode-Scanner ein oder geben Sie sie manuell ein.Setzen Sie die Kapillare bei Anweisung in das DLS-System ein und starten Sie den Test. Wenn der Test abgeschlossen ist, nehmen Sie die Probe aus dem Kapillarhalter und entsorgen Sie die Verbrauchsmaterialien ordnungsgemäß gemäß den Richtlinien der Einrichtung. Markieren Sie den Blutplättchenbeutel mit der Farbe, die dem Ergebnis entspricht.Zum Beispiel Orange für nicht aktiviert und Pink für aktiviert. Die dynamische Lichtstreuung misst die Geschwindigkeit von Partikeln, die sich durch die Brownsche Bewegung in Suspension bewegen. Aufgrund der unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen sich kleine Partikel schnell und große Partikel langsam.Diese Technologie bestimmt die Größenverteilung einer Probe. DLS bestimmen, dass diese Transfusion nicht aktivierte Blutplättchen enthält, die auf einem Mikropartikelgehalt von weniger als 15 % basieren. Tatsächlich. Meist waren diskoide Blutplättchen mit sehr wenigen Mikropartikeln mikroskopisch sichtbar.Eine andere Blutplättchentransfusion, die mit bloßem Auge genauso aussieht wie der erste Beutel, enthielt jedoch aktivierte Blutplättchen, basierend auf einem Mikropartikelgehalt von mehr als 15 %. In dieser Probe waren verschiedene Thrombozytenmorphologien, kleine Aggregate und viele Mikropartikel mikroskopisch sichtbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Probe nichtinvasiv aus einem Thrombozytenbeutel entnehmen, die Kapillare füllen und die Probe auf Mikropartikelgehalt testen, um eine optimierte Verwendung eines Thrombozyteninventars zu ermöglichen.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, den Beutel gut zu mischen, um eine gute, repräsentative Probe zu erhalten. Und nach diesem Verfahren können Sie auch andere Methoden, wie z. B. die Durchflusszytometrie, anwenden, um Fragen nach dem zellulären Ursprung von Mikropartikeln zu beantworten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zweieinhalb Minuten ausgeführt werden.Zusammen mit dem Fünf-Minuten-Test können Thrombozytentransfusionen in weniger als acht Minuten charakterisiert werden. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik den Blutbanken in Krankenhäusern, ihren Blutplättchenbestand zu screenen, Hämatologie-/Onkologiepatienten nur mit nicht aktivierten Blutplättchen zu behandeln und eine Verringerung der verwendeten Thrombozytentransfusionen zu beobachten. Wie wir sagen, ist die sicherste Transfusion diejenige, die nicht verabreicht wird.Obwohl diese Methode einen Einblick in die Charakterisierung von Blutplättchen vor der Transfusion bietet, kann sie auch verwendet werden, um plättchenreiches Plasma direkt von den Spendern zu testen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Blutkrebspatienten, da sie von nicht aktivierten Thrombozytentransfusionen profitieren, die das Risiko verringern, refraktär zu werden.

routine-screening-method-for-microparticles-in-platelet-transfusions

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Diese Methode untersucht die Blutplättchen-vermittelten Verklumpung...

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

Dieses Video zeigt eine Technik zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Bildung von Blutplättchen. Hämatopoetische Stammvorläuferzellen – isoliert aus menschlichem Nabelschnurblut – differenzieren sich in Gegenwart von Thrombopoietin zu reifen Megakaryozyten. Die reifen Megakaryozyten produzieren zytoplasmatische Fortsätze, die als Proplättchen bezeichnet werden und aus denen einzelne Blutplättchen hervorgehen.

Eine in vitro Methode zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Thrombozytenbildung

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Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

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Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

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