Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Dichte aller Transfer-RNAs in biologischen Proben gleichzeitig zu messen, indem die metabolische Markierung in vivo mit der Makroarray-Analyse kombiniert wird. Transfer-RNAs galten lange Zeit als Haushaltsmoleküle, denen es an regulatorischen Funktionen mangelte. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass die zellulären tRNA-Spiegel als Reaktion auf unterschiedliche Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress schwanken.

Die Fluktuation der tRNA-Expression beeinflusst direkt die Gentranslation, wodurch die Expression bestimmter Proteine begünstigt oder unterdrückt wird. Um die Dynamik der Proteinsynthese zu verstehen, sind Methoden erforderlich, die in der Lage sind, qualitativ hochwertige tRNA-Profile zu liefern. Wir präsentieren hier eine zuverlässige und unkomplizierte Technik, die eine schnelle und präzise Quantifizierung des Transfer-RNA-Gehalts in im Labor gezüchteten Organismen ermöglicht.

Platzieren Sie zunächst mit einer 18-Gauge-Nadel ein einzelnes Loch in der Mitte des Deckels eines sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen. Beimpfen Sie dann mit fünf Mikrolitern Mycobacterium smegmatis aus einer Starterkultur über Nacht 500 Mikroliter ergänzte sterile 7H9-Brühe. Gemäß den üblichen Strahlenschutzverfahren ist das Nährmedium mit 20 Mikrocurie pro Milliliter Phosphor-32-markiertem Orthophosphat aufzuspießen.

Züchten Sie Bakterien bei 37 Grad Celsius und 1.200 U/min in einem Shaker-Inkubator, der hinter einem neun Millimeter dicken Acrylschild platziert ist. In der Midlog-Phase wird die gesamte Kultur in ein Zwei-Milliliter-Schraubröhrchen überführt und die radioaktiven Bakterien bei Raumtemperatur pelletiert, indem man sie zwei Minuten lang bei der 10.000-fachen Schwerkraft zentrifugiert. Der Überstand, der nicht eingebautes radioaktives Orthophosphat enthält, ist in einem geeigneten Abfallbehälter aufzufangen.

Um die Gesamt-RNA herzustellen, fügen Sie dem Pellet einen Milliliter kommerzielles RNA-Extraktionsreagenz und etwa 200 Mikroliter Glasperlen hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen fest und zerkleinern Sie die Bakterien in einem Homogenisator unter maximaler Bewegung für zwei Minuten. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei der 12.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius.

Füllen Sie dann den Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen um und entsorgen Sie die Kügelchen entsprechend. Fügen Sie 0,2 Milliliter Chloroform hinzu und schütteln Sie das Röhrchen 15 Sekunden lang kräftig von Hand. Zentrifugieren Sie die Probe dann 15 Minuten lang bei der 12.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius.

Sammeln Sie die wässrige Phase der Probe in ein neues Röhrchen, indem Sie das Röhrchen um 45 Grad anwinkeln. Vermeiden Sie das Zeichnen von Interphase- oder organischen Schichten. Geben Sie zwei Mikroliter farbigen Fällungsmittel und 0,5 Milliliter 100%iges Isopropanol in die wässrige Phase.

Schütteln Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang kräftig mit der Hand und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und entsorgen Sie ihn ordnungsgemäß, da die flüssige Fraktion Spuren von Radioaktivität enthalten kann. Nachdem Sie das Pellet fünf Minuten lang an der Luft getrocknet haben, resuspendieren Sie es in 200 Mikrolitern 2X SSC mit 0,1 % Gewicht pro Volumen SDS.

Mit der genomischen tRNA-Datenbank können Sie DNA-Sonden entwerfen, indem Sie zunächst tRNA-Sequenzen oder tRNA-kodierende Gene abrufen. Nach dem Trimmen konservierter CCAs am Ende mit drei Primzahlen, wenn sie kodiert sind, und der Erzeugung des umgekehrten Komplements ordnen Sie die Sonden basierend auf den ersten 70 Nukleotiden an. Um den Array-Druck durchzuführen, tauen Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur auf.

Beschriften Sie mit einem Diamantstift aminbeschichtete Objektträger. Legen Sie dann die Dias in eine Indexierungseinheit ein. Tauchen Sie nach den Gitterplatzierungen die Replikatorstifte vorsichtig in die Vertiefungen.

Drucken Sie das Array mit minimalem Druck vorsichtig auf die Objektträger. Fahren Sie mit dem Drucken fort, ohne den Arrayer zu reinigen, bis Sie mit dem Block fertig sind, A.It erfordert etwas Übung, um konsistent drucken zu können. Es wird empfohlen, nicht mehr als acht bis 10 Arrays pro Sitzung zu drucken.

Zählen Sie 10 bis 15 Minuten pro Array. Es ist leicht, den Überblick über die Reihenfolge des Druckmusters zu verlieren, also widmen Sie Ihre ganze Aufmerksamkeit der Aufgabe und schalten Sie alle Ablenkungen aus. Wenn Sie bereit sind, zum nächsten Block überzugehen, tauchen Sie den Replikator in 5%iges Bleichmittel und schütteln Sie ihn vorsichtig.

Drücken Sie den Replikator in saugfähiges Papier. Tauchen Sie dann den Replikator in destilliertes Wasser, schütteln Sie ihn vorsichtig und drücken Sie ihn in Papier. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.

Tauchen Sie dann den Replikator in Isopropanol, schütteln Sie ihn vorsichtig und drücken Sie ihn in das Papier. Trocknen Sie den Replikator etwa 20 Sekunden lang am Lüfter, bevor Sie zum nächsten Block der 96-Well-Platte übergehen. Fahren Sie mit der gewünschten Anzahl von Drucken fort.

Lassen Sie die Objektträger dann trocknen. Legen Sie die getrockneten Objektträger mit der Vorderseite nach oben auf eine saubere Oberfläche in einen 254-Nanometer-UV-Vernetzer. Stellen Sie das Energieniveau auf 999, 990 Mikrojoule pro Quadratzentimeter ein und drücken Sie dann Start.

Die Arrays werden in 450 Milliliter Blockierungslösung überführt und bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer unter langsamem Rühren über Nacht inkubiert. Waschen Sie die Objektträger in 500 Millilitern destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, zweimal für jeweils fünf Minuten. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie in einer Microarray-Zentrifuge bei Raumtemperatur 10 Sekunden lang zentrifugieren.

Lagern Sie die Arrays bis zu sechs Monate an einem trockenen und dunklen Ort. Spülen Sie die Objektträger vor der Hybridisierung in kochendem Wasser ab und trocknen Sie sie durch Zentrifugation. Legen Sie das Array in eine Hybridisierungskassette und laden Sie die radioaktiv markierte RNA-Probe.

Führen Sie die Proben auf einer automatisierten Hybridisierungs-Waschstation aus, um eine maximale Reproduzierbarkeit gemäß dem Textprotokoll zu gewährleisten. Am Ende des Laufs trocknen Sie die Objektträger durch Zentrifugieren. Wickeln Sie die Dias mit dünnem Kunststoff ein.

Verwenden Sie dann einen Geigerzähler auf der empfindlichsten Einstellung, um die Objektträger auf radioaktive Signale zu überprüfen. Belichten Sie die Objektträger auf einem Speicherphosphorsieb in einer Belichtungskassette je nach Signalstärke 10 bis 90 Stunden lang bei Raumtemperatur. Die Belichtungszeit, die einige Stunden bis einige Tage dauern kann, hängt direkt vom Array-Signal ab.

Es braucht etwas Übung, um die Zählungen auf dem Geigerzähler in die Belichtungszeit übersetzen zu können. Scannen Sie Objektträger mit einer Auflösung von 50 Mikrometern mit einem Phosphorimager. Quantifizieren und subtrahieren Sie die Radioaktivitätsintensität an jedem Sondenpunkt mit der kostenlosen ImageJ-Software, die mit einem Microarray-Profiler aktualisiert wurde.

Generieren Sie Heatmaps gemäß dem Textprotokoll. Hier sind gescannte bakterielle, Maus- und humane Makroarrays zu sehen. M.smegmatis-Arrays verwenden nur 43 Sonden anstelle von 48 für Maus und Mensch.

Als Ergebnis zeigt das Bakterienarray 40 leere Flecken, die mit dem Hintergrund verschmelzen. Drei unabhängige biologische Replikate zeigen, dass unter den getesteten Wachstumsbedingungen alle M.smegmatis tRNAs über dem Hintergrundniveau exprimiert werden. In diesem speziellen Experiment liegt die beobachtete Standardabweichung für jede Sonde zwischen 2 % Arginin TCT und 22 % Cystein GCA, wobei der Median bei 5 % liegt. Darüber hinaus zeigt dieses Experiment, dass die Expression von tRNA-Isoakzeptoren nicht einheitlich ist.

Zum Beispiel werden alle Alanin-Isoakzeptoren auf ähnlichen Ebenen exprimiert, während sich die höchsten und niedrigsten Arginin-akzeptierenden tRNAs um das Dreifache unterscheiden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird und das Spot-Signal ausreichend ist. Unsere Methode ist auf alle Organismen anwendbar, deren Genom für das Sondendesign zur Verfügung steht.

Modellorganismen, die in vitro gezüchtet werden, sind ideale Kandidaten für die metabolische Markierung. Das hier vorgestellte Protokoll ist für Mycobacterium smegmatis optimiert, wurde aber auch erfolgreich zur Profilierung von tRNA in E. coli, Hefe, Mäusen und menschlichen kultivierten Zellen eingesetzt. Unsere Technik ist reproduzierbar und spezifisch.

Der große Dynamikbereich und der leicht einstellbare Schwellenwert ermöglichen die Profilierung von Spezies mit geringer Häufigkeit, wie z. B. tRNAs, die mit Polysomen assoziiert sind, einfach durch Verlängerung der Array-Expositionszeiten.