Name: Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Lernen Sie die SPOt-Methode zur schnellen Quantifizierung aller tRNA-Spiegel in biologischen Proben durch metabolische Markierung und Macroarray-Analyse. Diese zuverlässige Technik liefert präzise Ergebnisse in unter 24 Stunden.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen SC INBRE Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499, r.g.) und gewährt von der National Cancer Institute P.H.H. CA555536 & CA154664 Dieses Programm wurde zum Teil durch einen Zuschuss an das College of Charleston aus dem Howard Hughes Medical Institute über das Pre-College & Undergraduate Science Education Program und durch Zuschüsse aus dem National Center für Forschungsmittel (5 P20 RR016461) unterstützt und das National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) von den National Institutes of Health.

1. Kultur und metabolische Kennzeichnung
<ol><li>Poke einmal das Zentrum der GAP eine sterile 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren mit einer 18-Gauge-Nadel um ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen. Impfen 500 µL ergänzt steril 7H 9 Brühe mit 5 µL M. Smegmatis aus Vorspeise Kultur angebaut über Nacht12. Hinweis: Das Rezept für einen Liter 7H 9 Brühe ist: 4,7 g kommerziellen 7H 9 Pulver, 2 mL Glycerin, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g Eiweiß, 2 g Dextrose, H2O (bringen Gesamtvolumen bis 1 L).<ol>
<li>
(Vorsicht) Im Anschluss an standard Strahlenschutz Praktiken spike Nährmedien mit 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Wachsen Sie Bakterien bei 37 ° C und 1.200 u/min Unruhe in einem Shaker Inkubator platziert hinter einer 9 mm dickem Acryl Schild.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In midlog Phase (O.D.600 nm ~ 0,5), übertragen die gesamte Kultur in ein 2-mL-Schraubverschluss-Röhrchen und pellet radioaktiven Bakterien bei Raumtemperatur durch Zentrifugieren für 2 min bei 10.000 x g. sammeln überstand enthält nicht inkorporierten radioaktiven Orthophosphat in entsprechende Abfallbehälter.</li>
</ol>2. Vorbereitung des gesamten RNAs
Hinweis: Insgesamt RNAs werden extrahiert aus bakteriellen Pellets mit einem kommerziellen RNA Extraktion Reagens (mit Guanidinium-Thiocyanat, Phenol und Chloroform) nach der Hersteller-Protokolls.
<ol><li>Fügen Sie 1 mL der kommerziellen RNA-Extraktion-Reagenz und ca. 200 µL von Glasperlen auf das Pellet. Das Röhrchen fest und stören die Bakterien in einem Homogenisator für 2 min unter maximale Erregung, (Nummer fünf auf ausgewählte Instrument einstellen (siehe Tabelle der Materialien)).</li>
	<li>Zentrifuge Probe bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand auf eine neue 2-mL-Tube übertragen und die Perlen entsprechend entsorgen. Geben Sie 0,2 mL Chloroform hinzu und kräftig schütteln Sie Rohr von Hand für 15 S. Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Sammeln der wässrigen Phase der Probe in einen neuen Schlauch durch das Rohr auf 45° Angeln. Zeichnung der Interphase oder organischen Schicht zu vermeiden. Fügen Sie 2 µL der farbigen Fällungsmittel und 0,5 mL 100 % Isopropanol. Schütteln Sie kräftig das Rohr von Hand für 5 S. Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4° C.</li>
	<li>Den Überstand aus dem Rohr zu entfernen und entsorgen Sie entsprechend wie die flüssige Fraktion Spuren von Radioaktivität enthalten kann. Luft trocken Pellet für 5 min dann in 200 µL 2 X Kochsalzlösung-Natriumcitrat (SSC), 0,1 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) endgültige aufzuwirbeln. Hinweis: Die Zusammensetzung der Lager 20 X SSC ist 3,0 M NaCl, Natriumcitrat 0,3 M, pH 7.0.</li>
</ol>3. Vorbereitung der 96 gut Drucker Platten
Hinweis: tRNA Microarrays werden manuell mit zweiundvierzig 70-Mer DNA Oligonucleotides Ergänzung zum 3' Ende jedes M. Smegmatis tRNA (terminal CCA ausgeschlossen) mit einem 8-poligen Arrayer gedruckt. Die Sequenzen der DNA-Oligonukleotid Sonden sowie die Sonde Layout in der Well-Platte und das Array werden zur Verfügung gestellt (ergänzende Datei 1 - Blatt 1 bis 3 bzw.).
<ol><li>Design-DNA-Sonden von ersten Abrufen von tRNA-Sequenzen oder tRNA Kodierung Gene von tRNA-Datenbanken wie z. B. die genomische tRNA Datenbank13. Trim konservierten 3' Ende CCA kodiert. Umgekehrte Ergänzung die resultierende Sequenz. Bestellung-Sonde basierend auf den ersten 70 Nukleotiden.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie trockenere DNA-Sonden im Wasser. Passen Sie die Sonden Konzentration bis 100 µM. Bereiten Sie in einem 96 Well-Platte 120 µL 50 µM Oligos in 3 X SSC, 0,01 % (w/V) SDS Finale (verdünnte 60 µL Lager Sonden in einzelnen gut mit 60 µL 6 X SSC, 0,01 % (w/V) SDS.</li>
	<li>Abdeckplatte mit Zinnfolie Verdampfung oder Kontamination zu verhindern, sofort einfrieren und halten bei-20 ° C bis benötigt.</li>
</ol>(4) Array drucken
<ol><li>Tauen Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur (dauert ca. 20 min.).</li>
	<li>Beschriften Sie Amin-beschichtete Objektträger mit einem Diamant-Stift. Platzieren Sie Folien in Indizierung Gerät. Folgen Sie die Raster-Platzierungen und gehen Sie wie folgt.<ol>
<li>Tauchen Sie sorgfältig den Replikator Pins in den Brunnen.</li>
		<li>Drucken Sie sanft das Array auf die Glas-Objektträger mit minimalem Druck (Sie werden einen kleinen Widerstand spüren). Weiterdrucken Sie ohne Reinigung Arrayer bis fertig mit Block A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn Sie bereit sind, auf den nächsten Block zu bewegen, Folgen des Waschvorgangs beschrieben.<ol>
<li>Replikator in 5 % Bleichmittel Tauchen und vorsichtig schütteln.</li>
		<li>Presse-Replikator in saugfähigem Papier.</li>
		<li>DIP Replikator im destillierten Wasser, schütteln, und drücken Sie in Papier. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
		<li>DIP Replikator in Isopropanol, schütteln, und drücken Sie auf dem Papier.</li>
		<li>Trocknen Sie den Replikator auf den Lüfter für ca. 20 s bevor ich auf den nächsten Block von 96-Well-Platte. Gewünschte Anzahl der Abzüge weiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Folien dann Crosslink Oligos auf die Folie mit einem 254 nm UV-Vernetzer trocknen.<ol>
<li>Legen Sie das Energieniveau auf 999.990 µJ/cm2.</li>
		<li>Das Folien-Gesicht auf einer sauberen Fläche in der Vernetzer aufgestellt. Drücken Sie die Taste "start".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blockieren Sie die Arrays über Nacht in 450 mL Lösung auf einen Magnetrührer, bei Raumtemperatur und unter langsamen Rühren zu blockieren. Erfassen Sie und Wiederverwenden Sie blockierende Lösung bis zu viermal. Hinweis: Das Rezept für die blockierende Lösung ist: 125 mM Phosphatpuffer (NaH2PO4NUM2HPO4-) pH 7,2, 2,25 % SDS (w/V), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, 1 % BSA (w/V).</li>
	<li>Waschen Sie die Folien 2 Mal für 5 min bei Raumtemperatur in 500 mL destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Folien durch Zentrifugieren für 10 s bei Raumtemperatur in einer Microarray-Zentrifuge. Speicher-Arrays in einem trockenen und dunklen Platz für bis zu 6 Monaten.</li>
</ol>(5) Array Hybridisierung
<ol><li>Vor der Hybridisierung Folien in kochendem Wasser spülen und trocknen durch Zentrifugieren (wie in 4.6).</li>
	<li>Array in einer Hybridisierung Kassette platzieren und radioaktiven RNS-Probe zu laden.</li>
	<li>Führen Sie die automatische Hybridisierung-Waschstation für maximale Reproduzierbarkeit.<ol>
<li>Programmschritte wie folgt. Zustand-Dichtungen für 2 min bei 75 ° C. Einführen der Sonde bei 60 ° C. Denaturieren Sie Sonden und Proben 5 min bei 90 ° C. Hybridisieren Sie Proben für 3 h bei 60 ° C.<ol>
<li>Objektträger bei 50 ° C mit 2 X SSC, 0,1 % (w/V) SDS, Fluss 10 s zweimal waschen und halten 20 s. Wash Folien bei 42 ° C zweimal mit 0,1 X SSC, 0,1 % SDS, Fluss 10 s und halten 20 S. Wash Folien bei 42 ° C zweimal mit 0,1 X SSC , Fluss 10 s und halten 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trockenen Folien durch Zentrifugieren (wie in 4.6).</li>
</ol>(6) Array Quantifizierung
<ol><li>Wickeln Sie Folien mit einer dünnen Kunststoff-Folie. Folien für radioaktive Signal mit einem Geigerzähler auf seine empfindlichsten Einstellung zu überprüfen. Folien auf eine Lagerung Phosphor Leinwand in einer Exposition Kassette bei Raumtemperatur für 10 bis 90 h je nach Signalstärke aussetzen. Hinweis: Da die Empfindlichkeit der Geigerzähler variieren von einem Gerät zum anderen, Belichtungszeiten müssen empirisch optimiert werden.</li>
	<li>Scan-Dia mit 50 µm Auflösung mit einem Phosphorimager. Quantifizieren Sie und subtrahieren Sie Hintergrund-Radioaktivität Intensitäten an jede Sonde Stelle mit der kostenlosen Bild J-Software mit einem Microarray-Profiler aufgerüstet.</li>
	<li>Organisieren Sie und verarbeiten Sie Daten, die mit einem elektronischen Tabellenkalkulation. Mit der bedingten Formatierung Tool Heatmaps erzeugen. Vertreten Sie zum Beispiel jede Sonde Signal als Bruchzahl (ausgedrückt in ‰) des gesamten Sonde Signals.</li>
</ol>

<ol><li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li>
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</ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt.

Beta Partikelemissionen sind bakteriostatisch und antibakterielle Agenten14, bekannt, aber Strahlungen im Bereich getestet keine nennenswerten Auswirkungen auf Zelle Fitness haben. Funkeln Zählung ergab, dass 25 % der Gesamt-Zelle Extrakten und anschließend 1 % des gereinigten total RNAs die Radioaktivität eingegliedert ist.
Der Sonden identische Größen, vergleichbarer Schmelztemperatur und GC-Gehalt, sowie ein einheitliches Protokoll für Macroarray Schmierblutungen, Hybridisierung und Quantifizierung erlauben eine objektive Messung der tRNA Ebenen direkt vom spot Signale.
Ort ist reproduzierbar und spezifisch. Seine großen Dynamikbereich und leicht einstellbaren Schwellwert ermöglicht Profilierung geringere reichliche Arten wie tRNAs Polysomes, einfach durch eine Verlängerung Array Belichtung Zeiten9zugeordnet. Nach der anfänglichen Investition für die notwendige Ausrüstung die laufenden Kosten pro Probe, einschließlich Verbrauchsmaterialien, im Durchschnitt $15 pro Proben.
Vor Ort gilt für jeden Organismus, dessen Genom für Sonde Design zur Verfügung steht. Modell-Organismen, die in-vitro- angebaut werden sind ideale Kandidaten für die metabolische Beschriftung. Wie Säugetier-Genome codieren oft viele Isodecoders (tRNAs, die Teilen identisch Anticodons, aber kleine Unterschiede in ihren Körper Sequenzen anzeigen) müssen Sonden teilweise degenerierten, homogene Hybridisierung enge tRNA-Arten zu erhalten sein. Schließlich liefern anhaftende Säugetier-Zellen in der Regel geringere Mengen an Gesamt-RNS im Vergleich zu Organismen in Federung wie M. Smegmatis, angebaut, so Kulturen erheblich skaliert werden müssen.

Zelluläre tRNA Ebenen schwanken je nach Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress1,2,3. SPOt, optimierte Plattform für die Beobachtung der tRNA, ist ein Original, zuverlässig, und einfache Technik, die schnelle und präzise Quantifizierung der Transfer-RNA-Spiegel im Labor gewachsen Organismen ermöglicht.
tRNAs haben bemerkenswert stabil sekundäre und tertiäre Strukturen4. Sie zeigen auch zahlreiche posttranskriptionelle Modifikationen5. Diese Funktionen stellen wesentliche Struktur- und Sequenz Straßensperren Vorspannen oder manchmal verhindert direkte und reproduzierbare tRNA Profilierung mit standard-Benchmark RNA Quantifizierung Techniken6. Forschergruppen auf der ganzen Welt waren gezwungen, kreativ, aber oft komplizierten Techniken um zelluläre tRNA-Ebenen zu bewerten. Einige dieser Methoden sind: (1) zweidimensionale Elektrophorese Trennung von metabolisch beschrifteten tRNAs kombiniert mit methodischen Ort Zuordnung von Northern Blot1; (2) individuelle Quantifizierung von Northern blot mit sorgfältig standardisierte radioaktiver DNA-Sonden7; (3) nach Extraktion Etikettierung mit Cyanin Fluorochromes gefolgt von Microarray-Analyse3und (4) in-vitro- Abisolieren der tRNA Änderungen mit Hilfe von rekombinanten Demodification Enzymen kombiniert mit reverse Transkription und die anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung8.
Vor Ort ist eine einfache und originelle Kombination aus zwei unkomplizierten Ansätze: (1) RNA Körper bezeichnen, besteht in der Synthese in den wachsenden Organismen, von radioaktiven total RNAs und (2) tRNA Macroarrays, eine systematische und miniaturisierte genomische Werkzeug optimiert für tRNA Segregation.
Proben sind von lebenden Organismen auf die Quantifizierung Plattform optimiert. Sie werden direkt nach der Extraktion analysiert und nicht verarbeitet nicht weiter die Verzerrungen im Vergleich zu Techniken, die Post-Extraktion Verstärkung oder enzymatischen Behandlungen erfordern wesentlich einschränkt. SPOt ist vielseitig und leicht zu Polysome Fraktionierung zu identifizieren und quantifizieren tRNA Subpopulationen, die physisch verbunden mit der Übersetzung von Ribosomen sind kombinierbar.
Die hier vorgestellten Protokoll ist optimiert für Mycobacterium Smegmatis, und es wurde auch erfolgreich eingesetzt, um Profil tRNAs in Escherichia coli9, Saccharomyces Cerevisiae10, Maus und menschlichen Zellkulturen11 .

<table><tbody><tr><td>Indexiersystem für Glasschlitten</td><td>V& P Scientific, Inc.</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Dia-Arrayer-Replikator</td><td>V& P Scientific, Inc.</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatten-Indexiersystem</td><td>V& P Scientific, Inc.</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>Wasch- und Tupfstation</td><td>V& P Scientific, Inc.</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>Replicator Stifttrockner</td><td>V& P Scientific, Inc.</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>Aminbeschichtete Objektträger</td><td>Molecular Devices</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierer / Automatisierte Hybridisierungs- und Waschstation</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschluss 2 ml Röhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr><tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEX011001MC</tr><tr><td>Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Glasperlen</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Kugelmühle</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>Lagerung Phosphorsieb</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimager</td><td>GE Healthcare</td><td>Typhoon FLA7000 DNA-Oligonukleotide</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vernetzer</td><td>Spectroline</td><td>Select Serie 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>Microarray-Zentrifuge</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>Einwegnadeln</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>Fällungsmittel (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 Brühe</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemicals</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungskassette</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Albuminspektrum</td><td>Chemikalien</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Phosphatpuffer pH 7,2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolische etikettier- und profilierung des transfer-rnas mit macroarrays

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer-RNA (tRNA) sind reichlich kurzen nicht-kodierende RNA-Spezies, die in der Regel 76 bis 90 Nukleotide in der Länge sind. tRNAs sind direkt verantwortlich für die Proteinsynthese Codons in mRNA in Aminosäuresequenzen übersetzt. tRNAs galten lange als Zimmermädchen Moleküle, die regulatorische Funktionen fehlten. Allerdings zeigt eine wachsende Zahl von beweisen, dass zelluläre tRNA Ebenen, in Übereinstimmung mit unterschiedlichen Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress schwanken. Die Fluktuation der tRNA Ausdruck hat direkten Einfluss auf gen Übersetzung, Begünstigung oder unterdrücken die Expression von bestimmten Proteinen. Schließlich begreifen, die Dynamik der Proteinsynthese, erfordert die Entwicklung von Methoden in der Lage, qualitativ hochwertige tRNA Profile liefern. Die Methode, die wir hier vorstellen heißt Ort, steht für optimierte Plattform für Beobachtung tRNA. Vor Ort besteht aus drei Schritten, beginnend mit metabolischen Kennzeichnung von Zellkulturen mit radioaktiven Orthophosphat, gefolgt von Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion von radioaktiven total RNAs und schließlich Hybridisierung auf hauseigenen gedruckt Macroarrays. tRNA Ebenen sind geschätzt, indem die Radioaktivität Intensitäten an jedem Ort der Sonde zu quantifizieren. Im hier vorgestellten Protokoll Profil wir tRNAs in Mycobacterium Smegmatis Mc2155, ein apathogen Bakterium häufig als Modellorganismus verwendet, um Tuberkulose zu studieren.

Drei unabhängige biologische repliziert Show, die unter den getesteten Wachstumsbedingungen, alle M. Smegmatis tRNAs ü Hintergrund (Abbildung 1) ausgedrückt werden. In diesem besonderen Experiment besteht die beobachteten Standardabweichung für jede Sonde zwischen 2 % (Arg (TCT)) und 22 % (Cys (GCA)) mit einem Median von 5 % (Abbildung 1). Falsche Änderungen auf Wiederholungen werden maßgeblich beeinflusst durch Faktoren wie Array Vorbereitung und Hybridisierung. Hoher Reproduzierbarkeit wird erreicht durch sorgfältige und konsequente Array drucken sowie automatisierte Probe Hybridisierung. Es gibt einen 5-fold Unterschied zwischen tRNA Ile (GAT) und tRNA (Val (TAC), die höchsten und niedrigsten reichlich Arten bzw.. Vor Ort zeigt, dass der Ausdruck der tRNA Isoacceptors nicht einheitlich ist. Isoacceptors sind Arten, die die gleiche Aminosäure zu halten aber anzeigen verschiedene Anticodon Sequenzen und daher verschiedene Codons auf mRNAs zu entschlüsseln. Zum Beispiel werden alle Alanin Isoacceptors auf ähnlichem Niveau ausgedrückt, während die höchsten und niedrigsten Arginin akzeptieren tRNAs unterscheiden sich durch 3-Fach.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> Abbildung 1: repräsentative tRNA Macroarray Ergebnisse. (A) gescannte bakterielle, Maus und menschlichen Macroarrays. M. Smegmatis Arrays verwenden nur 43 Sonden statt 48 für Maus und Mensch. Folglich zeigt das bakterielle Array 40 leere Spots (Sonden werden acht Mal repliziert, auf jedes Array), die in den Hintergrund übergehen. Die meisten von ihnen sind in der oberen linken Ecke zusammengefasst. (B) Histogramm und Heatmap Darstellungen der tRNA-Profile in M. Smegmatis unter optimalen Wachstumsbedingungen. Sonde Signale sind im Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten (einschließlich bakterielles Wachstum, metabolische Etikettierung, Extraktion und Array Hybridisierung) und nach tausend Werte der gesamten tRNAs ausgedrückt werden. Standardabweichungen für die drei Wiederholungen sind bzw. als Fehlerbalken und Schattierungen von Orange auf dem Histogramm und Heatmap angegeben. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir beschreiben eine original Transfer-RNA-Analyse-Plattform namens SPOt (optimierte Plattform für die Beobachtung der tRNA). Ort und Stelle misst simultan zelluläre Ebenen alle tRNAs in biologischen Proben, in nur drei Schritten und in weniger als 24 Stunden.

Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Dichte aller Transfer-RNAs in biologischen Proben gleichzeitig zu messen, indem die metabolische Markierung in vivo mit der Makroarray-Analyse kombiniert wird. Transfer-RNAs galten lange Zeit als Haushaltsmoleküle, denen es an regulatorischen Funktionen mangelte. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass die zellulären tRNA-Spiegel als Reaktion auf unterschiedliche Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress schwanken.Die Fluktuation der tRNA-Expression beeinflusst direkt die Gentranslation, wodurch die Expression bestimmter Proteine begünstigt oder unterdrückt wird. Um die Dynamik der Proteinsynthese zu verstehen, sind Methoden erforderlich, die in der Lage sind, qualitativ hochwertige tRNA-Profile zu liefern. Wir präsentieren hier eine zuverlässige und unkomplizierte Technik, die eine schnelle und präzise Quantifizierung des Transfer-RNA-Gehalts in im Labor gezüchteten Organismen ermöglicht.Platzieren Sie zunächst mit einer 18-Gauge-Nadel ein einzelnes Loch in der Mitte des Deckels eines sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen. Beimpfen Sie dann mit fünf Mikrolitern Mycobacterium smegmatis aus einer Starterkultur über Nacht 500 Mikroliter ergänzte sterile 7H9-Brühe. Gemäß den üblichen Strahlenschutzverfahren ist das Nährmedium mit 20 Mikrocurie pro Milliliter Phosphor-32-markiertem Orthophosphat aufzuspießen.Züchten Sie Bakterien bei 37 Grad Celsius und 1.200 U/min in einem Shaker-Inkubator, der hinter einem neun Millimeter dicken Acrylschild platziert ist. In der Midlog-Phase wird die gesamte Kultur in ein Zwei-Milliliter-Schraubröhrchen überführt und die radioaktiven Bakterien bei Raumtemperatur pelletiert, indem man sie zwei Minuten lang bei der 10.000-fachen Schwerkraft zentrifugiert. Der Überstand, der nicht eingebautes radioaktives Orthophosphat enthält, ist in einem geeigneten Abfallbehälter aufzufangen.Um die Gesamt-RNA herzustellen, fügen Sie dem Pellet einen Milliliter kommerzielles RNA-Extraktionsreagenz und etwa 200 Mikroliter Glasperlen hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen fest und zerkleinern Sie die Bakterien in einem Homogenisator unter maximaler Bewegung für zwei Minuten. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei der 12.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius.Füllen Sie dann den Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen um und entsorgen Sie die Kügelchen entsprechend. Fügen Sie 0,2 Milliliter Chloroform hinzu und schütteln Sie das Röhrchen 15 Sekunden lang kräftig von Hand. Zentrifugieren Sie die Probe dann 15 Minuten lang bei der 12.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius.Sammeln Sie die wässrige Phase der Probe in ein neues Röhrchen, indem Sie das Röhrchen um 45 Grad anwinkeln. Vermeiden Sie das Zeichnen von Interphase- oder organischen Schichten. Geben Sie zwei Mikroliter farbigen Fällungsmittel und 0,5 Milliliter 100%iges Isopropanol in die wässrige Phase.Schütteln Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang kräftig mit der Hand und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und entsorgen Sie ihn ordnungsgemäß, da die flüssige Fraktion Spuren von Radioaktivität enthalten kann. Nachdem Sie das Pellet fünf Minuten lang an der Luft getrocknet haben, resuspendieren Sie es in 200 Mikrolitern 2X SSC mit 0,1 % Gewicht pro Volumen SDS.Mit der genomischen tRNA-Datenbank können Sie DNA-Sonden entwerfen, indem Sie zunächst tRNA-Sequenzen oder tRNA-kodierende Gene abrufen. Nach dem Trimmen konservierter CCAs am Ende mit drei Primzahlen, wenn sie kodiert sind, und der Erzeugung des umgekehrten Komplements ordnen Sie die Sonden basierend auf den ersten 70 Nukleotiden an. Um den Array-Druck durchzuführen, tauen Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur auf.Beschriften Sie mit einem Diamantstift aminbeschichtete Objektträger. Legen Sie dann die Dias in eine Indexierungseinheit ein. Tauchen Sie nach den Gitterplatzierungen die Replikatorstifte vorsichtig in die Vertiefungen.Drucken Sie das Array mit minimalem Druck vorsichtig auf die Objektträger. Fahren Sie mit dem Drucken fort, ohne den Arrayer zu reinigen, bis Sie mit dem Block fertig sind, A.It erfordert etwas Übung, um konsistent drucken zu können. Es wird empfohlen, nicht mehr als acht bis 10 Arrays pro Sitzung zu drucken.Zählen Sie 10 bis 15 Minuten pro Array. Es ist leicht, den Überblick über die Reihenfolge des Druckmusters zu verlieren, also widmen Sie Ihre ganze Aufmerksamkeit der Aufgabe und schalten Sie alle Ablenkungen aus. Wenn Sie bereit sind, zum nächsten Block überzugehen, tauchen Sie den Replikator in 5%iges Bleichmittel und schütteln Sie ihn vorsichtig.Drücken Sie den Replikator in saugfähiges Papier. Tauchen Sie dann den Replikator in destilliertes Wasser, schütteln Sie ihn vorsichtig und drücken Sie ihn in Papier. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.Tauchen Sie dann den Replikator in Isopropanol, schütteln Sie ihn vorsichtig und drücken Sie ihn in das Papier. Trocknen Sie den Replikator etwa 20 Sekunden lang am Lüfter, bevor Sie zum nächsten Block der 96-Well-Platte übergehen. Fahren Sie mit der gewünschten Anzahl von Drucken fort.Lassen Sie die Objektträger dann trocknen. Legen Sie die getrockneten Objektträger mit der Vorderseite nach oben auf eine saubere Oberfläche in einen 254-Nanometer-UV-Vernetzer. Stellen Sie das Energieniveau auf 999, 990 Mikrojoule pro Quadratzentimeter ein und drücken Sie dann Start.Die Arrays werden in 450 Milliliter Blockierungslösung überführt und bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer unter langsamem Rühren über Nacht inkubiert. Waschen Sie die Objektträger in 500 Millilitern destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, zweimal für jeweils fünf Minuten. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie in einer Microarray-Zentrifuge bei Raumtemperatur 10 Sekunden lang zentrifugieren.Lagern Sie die Arrays bis zu sechs Monate an einem trockenen und dunklen Ort. Spülen Sie die Objektträger vor der Hybridisierung in kochendem Wasser ab und trocknen Sie sie durch Zentrifugation. Legen Sie das Array in eine Hybridisierungskassette und laden Sie die radioaktiv markierte RNA-Probe.Führen Sie die Proben auf einer automatisierten Hybridisierungs-Waschstation aus, um eine maximale Reproduzierbarkeit gemäß dem Textprotokoll zu gewährleisten. Am Ende des Laufs trocknen Sie die Objektträger durch Zentrifugieren. Wickeln Sie die Dias mit dünnem Kunststoff ein.Verwenden Sie dann einen Geigerzähler auf der empfindlichsten Einstellung, um die Objektträger auf radioaktive Signale zu überprüfen. Belichten Sie die Objektträger auf einem Speicherphosphorsieb in einer Belichtungskassette je nach Signalstärke 10 bis 90 Stunden lang bei Raumtemperatur. Die Belichtungszeit, die einige Stunden bis einige Tage dauern kann, hängt direkt vom Array-Signal ab.Es braucht etwas Übung, um die Zählungen auf dem Geigerzähler in die Belichtungszeit übersetzen zu können. Scannen Sie Objektträger mit einer Auflösung von 50 Mikrometern mit einem Phosphorimager. Quantifizieren und subtrahieren Sie die Radioaktivitätsintensität an jedem Sondenpunkt mit der kostenlosen ImageJ-Software, die mit einem Microarray-Profiler aktualisiert wurde.Generieren Sie Heatmaps gemäß dem Textprotokoll. Hier sind gescannte bakterielle, Maus- und humane Makroarrays zu sehen. M.smegmatis-Arrays verwenden nur 43 Sonden anstelle von 48 für Maus und Mensch.Als Ergebnis zeigt das Bakterienarray 40 leere Flecken, die mit dem Hintergrund verschmelzen. Drei unabhängige biologische Replikate zeigen, dass unter den getesteten Wachstumsbedingungen alle M.smegmatis tRNAs über dem Hintergrundniveau exprimiert werden. In diesem speziellen Experiment liegt die beobachtete Standardabweichung für jede Sonde zwischen 2 % Arginin TCT und 22 % Cystein GCA, wobei der Median bei 5 % liegt. Darüber hinaus zeigt dieses Experiment, dass die Expression von tRNA-Isoakzeptoren nicht einheitlich ist.Zum Beispiel werden alle Alanin-Isoakzeptoren auf ähnlichen Ebenen exprimiert, während sich die höchsten und niedrigsten Arginin-akzeptierenden tRNAs um das Dreifache unterscheiden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird und das Spot-Signal ausreichend ist. Unsere Methode ist auf alle Organismen anwendbar, deren Genom für das Sondendesign zur Verfügung steht.Modellorganismen, die in vitro gezüchtet werden, sind ideale Kandidaten für die metabolische Markierung. Das hier vorgestellte Protokoll ist für Mycobacterium smegmatis optimiert, wurde aber auch erfolgreich zur Profilierung von tRNA in E. coli, Hefe, Mäusen und menschlichen kultivierten Zellen eingesetzt. Unsere Technik ist reproduzierbar und spezifisch.Der große Dynamikbereich und der leicht einstellbare Schwellenwert ermöglichen die Profilierung von Spezies mit geringer Häufigkeit, wie z. B. tRNAs, die mit Polysomen assoziiert sind, einfach durch Verlängerung der Array-Expositionszeiten.

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

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Forschung

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Genetics

Genetik

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