Quantifizierung der endogenen Auxin und Cytokinin während Internodium Kultur von Ipecac

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu beschreiben, wie sich der endogene Phytohormonspiegel während der zufälligen Sprossbildung in Ipecac verändert. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Zusammenhang mit der Geweberegeneration im pflanzlichen Gewebekulturrad zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der endogene Gehalt an Indol-3-essigsäure und Cytokininen können einfach und mit hoher Sensitivität analysiert werden.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die gesamte Etablierung der Degeneration des Pflanzengewebes, da Veränderungen des endogenen Phytohormonspiegels die zufällige Sprossbildung auslösen. Bereiten Sie zunächst ein phytohormonfreies B5-Medium vor und fügen Sie 0,2 Prozent Gellangummi hinzu. Autoklavieren Sie dann das Medium, um es zu sterilisieren.

Schneiden Sie mit einem chirurgischen Skalpell auf einer sterilen Acrylplatte acht Millimeter große Internodiensegmente von Ipecac-Pflänzchen in Scheiben und legen Sie sie auf das Medium. Kultivieren Sie dann die Ipecac-Segmente bei 24 Grad Celsius unter 15 Mikromol pro Quadratmeter Sekunden Licht in einem 14-stündigen Licht- und 10-Stunden-Dunkelzyklus für fünf Wochen. Identifizieren Sie nach der Kultivierung der Ipecac-Segmente die Regionen eins bis vier in jedem Segment.

Zählen Sie einmal pro Woche mit einem Mikroskop die Anzahl der Adventivtriebe in jeder Region. Legen Sie zunächst eine fünf Millimeter große Zirkonoxidperle in vier Zwei-Milliliter-Probenröhrchen. Schneiden Sie dann mit einem chirurgischen Skalpell auf einer sterilen Acrylplatte die Ipecac-Segmente in die Regionen I bis IV. Sammeln Sie dann acht Segmente aus jeder Region in einem Probenröhrchen.

Wiegen Sie jede der Proben und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. Verwenden Sie anschließend einen Homogenisator auf Bead-Basis, um die gefrorenen Proben zu zerkleinern. Die Proben werden mit einem Wirbelmischer in einem Milliliter Acetonitril mit 500 Pikogramm jedes internen Standards von Ochsen und CKs suspendiert.

Lagern Sie die Proben eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Und dann zentrifugieren Sie die Proben bei 3500 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Pellet in 80 Prozent Acetalnitril mit einem Prozent Essigsäure.

Wiederholen Sie dann die Zentrifugation und verwenden Sie ein Einwegröhrchen, um die Überstände zu kombinieren. Geben Sie 600 Mikroliter Wasser mit einem Prozent Essigsäure in den kombinierten Überstand. Verwenden Sie dann einen Vakuumkonzentrator, um das Acetalnitril zu verdampfen.

Laden Sie die Probenlösungen in einzelne äquilibrierte HLB-Kartuschen. Und waschen Sie die Kartuschen mit einem Milliliter Wasser mit einem Prozent Essigsäure. Dann spielen Sie alle Hormone mit zwei Millilitern 80 Prozent Acetylnitril mit einem Prozent Essigsäure in einer Glasröhre an.

Verdampfen Sie das Acetalnitril mit einem Vakuumkonzentrator, um Extrakt in Wasser mit einem Prozent Essigsäure zu erhalten. Laden Sie die Probenlösungen in einzelne äquilibrierte MCX-Kartuschen und waschen Sie die Kartuschen mit einem Milliliter Wasser mit einem Prozent Essigsäure. Dann spielen Sie IAA in einer Glasröhre an, mit zwei Millilitern 30 Prozent Acetalnitril und einem Prozent Essigsäure.

Anschließend waschen Sie die Kartuschen mit zwei Millilitern 80 Prozent Acetalnitril mit einem Prozent Essigsäure. Anschließend waschen Sie die Kartuschen mit zwei Millilitern Wasser und einem Milliliter Wasser mit fünf Prozent wässrigem Ammoniak in einer Zugkammer. Deuten Sie die CKs in einem Glasröhrchen mit zwei Millilitern 60 Prozent Acetalnitril und fünf Prozent wässrigem Ammoniak in einer Zugkammer an.

Verwenden Sie dann einen Vakuumkonzentrator, um das Lösungsmittel jeder Hormonfraktion zu verdampfen. Rühren Sie die Proben bei minus dreißig Grad Celsius bis zur LCMSMS-Analyse. Zuerst lösen Sie jeden Hormonextrakt in einem Röhrchen mit 600 Mikrolitern Methanol auf.

Füllen Sie dann die Lösung in ein Fläschchen mit Schraubhals und verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Die IAA-Fraktion in 20 Mikrolitern 30 Prozent Acetalnitril und die CK-Fraktionen in 20 Mikrolitern Wasser mit einem Prozent Essigsäure auflösen. Verwenden Sie als Nächstes ein Triple-Quadrupol-MS-System, das mit einem HPLC-System ausgestattet ist, um die Proben im positiven Ionenmodus zu analysieren.

Quantifizieren Sie schließlich die endogene IAA in CK-Spiegeln anhand einer Standardkurve des Verhältnisses von unmarkierten zu Deuterium-Markierungsstandards. In diesem Protokoll wurde das endogene Oxidationsmittel Cytokinin in Adventivrutschen fünf Wochen lang mittels LCMSMS gemessen. In der ersten Woche hatten sich keine zufälligen Rutschen gebildet und die ersten kleinen Rutschen erschienen in der zweiten Woche.

In der dritten und vierten Woche nahm die Anzahl der Rutschen vor allem in den Regenten eins und zwei zu. In der fünften Woche betrug die Anzahl der Rutschen etwa sieben in Region eins und fünf in Region zwei. Vor Kultur war das IAA-Niveau in Region eins etwas höher als in den Regionen zwei, drei und vier.

In der ersten Woche stieg das IAA-Niveau in der Region vier stark an, während es in den Regionen eins, zwei und drei leicht zurückging. Nach fünfwöchiger Kultivierung ergab sich ein IAA-Konzentrationsgradient. Die Stufen steigen von Region eins bis Region vier.

Vor der Kultur gab es von den meisten CKs nur Spurenwerte. In der ersten Woche stieg der tZR-Spiegel in Region zwei auf 13,8 Pikogramm pro Milligramm. Und 18,1 Pikogramm pro Milligramm in Region drei.

Im Gegensatz dazu veränderten sich die Spiegel von tZ, iP und iPR während der Kultur nur geringfügig. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass endogene Teilhormone stabil sind. Nachdem sie vom Menschen entwickelt wurde, ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Pflanzengewebekultur.

Erforschung der zufälligen Bildung in anderen Organismen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie endogene Indol-3-essigsäure und Cytokinine analysiert werden.