Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine Kultur mit hoher Ausbeute von induzierten Neuronen aus humanen adulten Hautfibroblasten zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der neurologischen Erkrankungen zu beantworten, da sie die Degeneration eines patientenbasierten neuronalen Systems ermöglicht, das das Alter der Zelle aufrechterhält. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die Erzeugung von induzierten Neuronen von Menschen jeden Alters auf sehr standardisierte und effiziente Weise in nur 25 Tagen ermöglicht.

Es ermöglicht eine breite Palette von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich Krankheitsmodellierung, Toxikologie, Diagnostik sowie Wirkstoff-Screening-Assays in sehr großem Maßstab. Das Verfahren wird von Shelby, einer Doktorandin in der Abteilung, in der das Gehirn trainiert wird, sowie Karlonia, die in unserem Labor arbeitet, demonstriert. Zu Beginn tauen Sie die adulten menschlichen dermalen Fibroblasten mit einem automatisierten Zellauftausystem auf.

Nach Zählung der Zellzahl mit einem automatisierten Zellzähler säen Sie zweihunderttausend Zellen pro T-75-Kolben aus, der 10 Milliliter Fibroblastenmedium enthält. Bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid halten. Ersetzen Sie am nächsten Tag das alte Medium durch frisches Fibroblastenmedium.

Wechseln Sie das Fibroblastenmedium alle drei bis vier Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 95 % erreichen. Eine Stunde vor dem Plattieren der adulten humanen dermalen Fibroblasten vor der Reprogrammierung, beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 250 Mikrolitern 0,1 % Gelatine. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius.

Das Fibroblastenmedium wird aus dem Kolben aspiriert und einmal mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco gewaschen. Nach dem Waschen lysieren Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern 0,05%igem Trypsin pro T-75-Kolben bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Fügen Sie dann drei Milliliter Fibroblastenmedium hinzu, um die Trypsinlösung zu neutralisieren.

Die abgelösten Zellen werden in einem 15-Milliliter-Röhrchen abgekühlt, indem die Zellen im Kolben zweimal ausgespült werden. Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei 400 g. Stoßen Sie das Überkorn aus und suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Fibroblastenmedium.

Bereiten Sie dann eine zelluläre Suspension von 1.320.000 Zellen in 13,2 Millilitern Fibroblastenmedium vor, um 100.000 Zellen pro Milliliter Medium zu erreichen. Nachdem Sie die Gelatine aus der Platte abgesaugt haben, waschen Sie die Platte zweimal mit Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline. Geben Sie dann 500 Mikroliter Zellsuspension in jede der Vertiefungen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Erwärmen Sie 13,2 Milliliter Fibroblastenmedium auf 37 Grad Celsius. Tauen Sie dann den lentiviralen Vektor in der laminaren Haube bei Raumtemperatur auf. Das erforderliche Volumen an Lentivirus, das zur Infektion der adulten humanen dermalen Fibroblasten bei einer Infektionsmehrheit von 20 erforderlich ist, wird dem Medium ohne Transduktionsverstärker zugegeben.

Ersetzen Sie dann das Medium durch 500 Mikroliter Fibroblastenmedium unter Zugabe des lentiviralen Vektors. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Lentivirus-haltige Medium durch frisches Fibroblastenmedium ohne den lentiviralen Vektor.

Am dritten Tag nach der viralen Transduktion entfernen Sie das Fibroblastenmedium und fügen Sie 500 Mikroliter frühes neuronales Konversionsmedium hinzu. Ersetzen Sie zwei- bis dreimal pro Woche 225 Mikroliter altes Medium aus jeder Vertiefung durch 250 Mikroliter frisches frühes neuronales Umwandlungsmedium. Am 18. Tag nach der viralen Transduktion wird das frühe neuronale Umwandlungsmedium entfernt und durch 500 Mikroliter spätes neuronales Umwandlungsmedium ersetzt.

Wechseln Sie das Medium wie bisher alle zwei bis drei Tage bis zum 25. Tag oder bis zum experimentellen Endpunkt. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um das Medium zu entfernen. Geben Sie dann zwei 250 Mikroliter Zelldissoziationsmittel in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte 10 bis 20 Minuten im Inkubator, bis sich die Zellen ablösen und als einzelne Zellen schwimmen.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit den FACS-Puffer vor. Zerreiben Sie mit einer 1000-Mikroliter-Pipette. Inkubieren Sie etwas länger, wenn noch Zellklumpen übrig sind.

Die erhaltene einzellige Suspension wird in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit spätem neuronalem Umwandlungsmedium und geben Sie sie in das gleiche 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann wird bei 400 g fünf Minuten lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.

Als nächstes suspendieren Sie das Zellpellet wieder in 200 Mikrolitern FACS-Puffer. Schleudern Sie die Zellen erneut fünf Minuten lang bei 400 G herunter und verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zellen wieder in FACS-Puffer und Zentrifuge.

Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei Mal. Suspendieren Sie dann das Zellpellet in 50 Mikrolitern FACS-Puffer mit humanem CD56-Antikörper in einer Konzentration von eins bis 50 für 15 Minuten auf Eis, ohne Licht. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 g und lösen Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern FACS-Puffer auf, um die Zellen zu waschen.

Zentrifugieren Sie die Zellen erneut fünf Minuten lang bei 400 g. Zweimal mit FACS-Puffer waschen, gefolgt von einer Zentrifugation. Zum Schluss werden 200 Mikroliter FACS-Puffer, der 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid enthält, wieder suspendiert.

Die NCAM-positiven und Propidiumiodid-negativen Zellen werden durch Gating auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität von Kontrollproben sortiert, die nicht mit dem NCAM-Antikörper oder Propidiumiodid gefärbt wurden. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Zellzahl zu zählen und 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf einer mit Poly-L-Ornithin-Fibronektin und Laminin beschichteten Platte mit spätem neuronalem Umwandlungsmedium auszusäen. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums zwei- bis dreimal pro Woche mit spätem neuronalem Konversionsmedium bis zum experimentellen Endpunkt.

Repräsentative Phasenkontrastbilder zeigen die morphologischen Veränderungen in den Zellen während der Konversionsperiode. Eine signifikante Veränderung der zellulären Morphologie ist ab dem fünften Tag sichtbar. Bis zum 22. Tag hat sich etwa die Hälfte der Zellen in Neuronen umgewandelt.

Repräsentative Aminofluoreszenzbilder zeigen das Vorhandensein von neuronalen Standardmarkern in den Zellen. Bis zum 25. Tag erhalten die Zellen eine neuronale Morphologie und exprimieren neuronale Marker wie MAP2 und TAU. Die Zellkerne werden mit DAPI gefärbt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie induzierte Neuronen aus adulten menschlichen Fibroblasten erzeugt werden können. Und dazu gehören die Beschichtung der Zellen für die Reprogrammierung, die virale Transduktion, die Zellerhaltung sowie die FACS-Sortierung für die Reinigung. Die Entwicklung dieser Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der neurologischen Erkrankungen den Weg, um verschiedene mit der Krankheit verbundene Merkmale sowie mögliche Therapien zu untersuchen.

Und das in einem System, das nicht nur ein menschliches neuronales System ist, sondern sowohl patienten- als auch krankheitsspezifisch sein kann.