Name: Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie die zelluläre Ausbreitung prionartiger Proteinaggregate in Drosophila melanogaster in vivo visualisiert wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit.

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Wir danken Mitgliedern von Kopito, Luo und Pearce Labs für viele hilfreiche Diskussionen während der Entwicklung dieser Methoden. Wir danken auch Brian Temsamrit für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Mittel von Universität der Wissenschaften und der w. Smith Stiftungen unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Da die Zahl der Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen weiter zu erhöhen, gibt es eine dringende Notwendigkeit, das Verständnis der molekularen Pathogenese dieser Erkrankungen erhöhen, so dass bessere Therapien entwickelt werden können. Hier beschreiben wir Methoden, die für die Überwachung der Prion-artigen Übertragung von pathogenen Proteinaggregaten zwischen verschiedenen Zelltypen in der Modellorganismus Drosophila Melanogaster. Wir haben vor kurzem diese Methode verwendet, um Prion-wie Getriebe des m...

Die Prion-Hypothese besagt, dass der Erreger verantwortlich für die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (z.B.Creutzfeldt - Jakob-Krankheit beim Menschen, Scrapie bei Schafen, verschwenden chronisch im Hirschen und Elchen und "Rinderwahnsinn" bei Rindern ) besteht ausschließlich aus Protein und frei von Nukleinsäuren1. Prion-Krankheiten übernimmt die zellulären Prion-Protein (PrPC) eine nicht-Native, stabile Falte (PrP-Sc), die ist sehr Beta Blatt-reich und kann selbst durch die Umwandlung und Rekrutierung von Monomeren PrPC Moleküle in stabilen Amyloid ausbreiten Aggregate. PrP-Sc -Aggregate nutzen diesen selbstreplizierende Mechanismus zwischen verschiedenen Zellen in einem Organismus und sogar zwischen einzelnen Organismen2zu verbreiten.
Protein misfolding und Aggregation ist auch ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS))3. Bildung von Intra oder extra zellulare aggregierten Protein Baugruppen bei diesen Erkrankungen ist eng verknüpft mit Zytotoxizität4 und schreitet hoch reproduzierbare und krankheitsspezifische Pfaden durch das Gehirn über Zeit5, 6. diese Muster der Ausbreitung legen nahe, dass Pathogene Aggregate mit diesen Erkrankungen assoziiert sind Prion-ähnliche Eigenschaften haben. Starke Unterstützung existiert nun für Prion-wie Übertragung der Aggregate zugeordnete AD, PD, HD und ALS - sie breitete sich von Zelle zu Zelle und Vorlage der Konformationsänderung der Monomere Formen des gleichen Proteins in zuvor nicht betroffen Zellen7, 8.
Die Mehrheit der Studien, die untersuchen Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten bisher wurden durchgeführt mit Säugerzelle Kultur Modelle, bei denen ein Übergang Aggregate in das Zytoplasma der naive Zellen aus dem extrazellulären Raum oder von einer anderen Zelle Zytoplasma9,10,11,12,13,14,15, oder durch Einspritzen von Aggregat-haltigen Material in Mäusegehirnen und Überwachung aggregieren Auftritt außerhalb der Injektion Seite16,17,18,19,20,21,22, 23. in jüngerer Zeit, transgene Tiere verwendet wurden, um nachzuweisen, dass die intrazelluläre Aggregate auf andere Zellen im intakten Gehirn24,25,26,27, verbreiten 28,29,30. Hier beschreiben wir eine Methode für die direkte Visualisierung der aggregierten Transfer zwischen den einzelnen Zellen im intakten Gehirn von Drosophila Melanogaster. Drosophila -Modelle HD/Polyglutamin-(PolyQ) Krankheiten wurden vor fast zwei Jahrzehnten entwickelt31,32 und haben viele wertvolle Einblicke in die pathogenen Mechanismen, die diese Störungen zugrunde liegen 33. HD ist eine vererbte Neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch eine autosomal dominante Mutation in dem gen, das für das Protein Huntingtin (Htt)34kodiert. Diese Mutation führt zu Ausdehnung von einer PolyQ Strecke in der Nähe von Htts N-Terminus jenseits einer pathogenen Schwelle des ~ 37 Glutaminen, verursacht das Protein Misfold und insgesamt35,36. Wildtyp Htt Proteine mit < 37 Glutaminen in diesem Küstenabschnitt erreichen ihre heimischen Herde, sondern induziert werden können, um aggregierte bei direktem Körperkontakt mit einer Htt Aggregat "seed"12,27,37. Wir nutzen diese homotypische kernhaltigen Aggregation von Wildtyp Htt als einer Anzeige für Prion-wie Transfer und zytoplasmatischen Eintrag von mutierten Htt-Aggregate mit Ursprung in anderen Zellen.
Bestimmung der Mechanismen durch die Prion-ähnliche Aggregate kann Reisen zwischen Zellen zur Identifizierung der neue therapeutische Targets für unheilbare Neurodegenerative Erkrankungen führen. Wir nutzen Sie den schnellen Lebenszyklus, Benutzerfreundlichkeit und genetische Lenkbarkeit von Drosophila Melanogaster , molekulare Mechanismen für die Zell-Zell-Ausbreitung von mutierten Htt Aggregate zu definieren. Unsere experimentelle Strategie beschäftigt zwei binäre Expressionssysteme in Drosophila, etablierten Gal4-spezifische vorgelagerten aktivierende Sequenz (Gal4-UAS) System38 und vor kurzem entwickelt QF-QUAS System39zur Verfügung. Diese zwei unabhängige Kupplungssysteme ermöglicht Ausdruck von Mutanten und Wildtyp Htt transgenen auf unterschiedliche Zellpopulationen innerhalb der gleichen fliegen40zu beschränken. Mit diesem Ansatz untersuchen wir Prion-ähnliche Verbreitung der mutierte Htt durch Überwachung der Umverteilung der zytoplasmatischen Wildtyp Htt von seinem normalerweise diffuse, löslichen Zustand zu einem aggregierten Zustand, eine direkte Folge der Körperkontakt mit einer vorgeformten mutierte Htt aggregierte "Samen". Umwandlung von Wildtyp Htt durch mutierte Htt kann bestätigt werden, mit biochemischen und biophysikalische Techniken, die berichten von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Fluoreszenz Resonanz Energie transfer (FRET)9,27,41 .
Wichtig ist, greifen wir auch eine große Anzahl von genetischen Werkzeuge in Drosophila , Gene und/oder Wege, die Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten vermitteln zu identifizieren. Wir haben vor kurzem dieser Ansatz verwendet, um eine Schlüsselrolle für die Zelle Oberfläche Scavenger Rezeptor, Draper42,43, bei der Übertragung von mutierten Htt Aggregate von neuronalen Axone zum nahe gelegenen phagocytic Glia in Drosophila zentrale enthüllen Nervensystem (ZNS)27. So kann die genetischen und Imaging-basierte Ansatz, den wir hier beschreiben wichtige biologische Basisinformationen über ein krankheitsrelevante Phänomen in der einfach zu bedienenden aber mächtige Modellorganismus Drosophilaoffenbaren.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10X, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Verdünnung auf 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS), gefiltert</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquotieren und bei Erhalt einfrieren</td></tr><tr><td>Hühner-Anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Verwendung bei einer Verdünnung von 1:500</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Verwendung bei einer Verdünnung von 1:2000; kann fluoreszierende Proteine auf DsRed-Basis erkennen (z. B. mCherry, mStrawberry, tdTomate usw.)</td></tr><tr><td>Maus anti-Bruchpilot</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Anwendung bei 1:100 Verdünnung; markiert aktive präsynaptische Strukturen im gesamten Fliegengehirn</td></tr><tr><td>FITC Anti-Huhn</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Anwendung bei 1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Kaninchen</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Verwendung bei 1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Maus-Antikörper</td><td>Leben Technologies</td><td>A21235</td><td>Verwendung bei einer Verdünnung von 1:250</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (25 x 75 x 1,0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette in Biologiequalität, Typ 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>Verwendung in nicht dominanter Hand</td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Pinzette, Style 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>Verwendung in dominanter Hand</td></tr><tr><td>LAS X Bildanalysesoftware</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris Bildanalysesoftware</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung von zelle zu zelle Übertragung von prion-wie protein-aggregate in drosophila melanogaster

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Proteinaggregation ist ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Krankheiten, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Protein-Aggregate sind eng verbunden mit Neuropathologie bei diesen Erkrankungen, obwohl der genaue Mechanismus, mit dem aberranten Proteinaggregation normale zelluläre Homöostase stört, nicht bekannt ist. Daten liefern starke Unterstützung für die Hypothese, dass Pathogene Aggregate in AD, PD, HD und ALS haben viele Ähnlichkeiten mit Prionen, die nur-Protein Krankheitserreger für den transmissiblen spongiformen Enzephalopathien verantwortlich sind. Prionen replizieren selbst von Template die Konvertierung nativ gefaltet Versionen des gleichen Proteins, Ausbreitung des Phänotyps Aggregation verursacht. Wie Prionen und Prion-ähnliche Proteine in AD, PD, HD und ALS Übergang von einer Zelle zur anderen ist derzeit eine Fläche von intensiver Untersuchung. Hier wird ein Drosophila Melanogaster -Modell, das erlaubt, Überwachung der Prion-Like, Zell-Zell-Übertragung von mutiertem Huntingtin (Htt) Aggregaten verbunden mit HD beschrieben. Dieses Modell nutzt die leistungsstarke Werkzeuge zur Manipulation der Transgene Ausdruck in vielen verschiedenen Geweben in Drosophila und nutzt ein Eindringmittel getaggt zytoplasmatischen Protein direkt Bericht Prion-artigen Übertragung von mutierten Htt-Aggregate. Wichtig ist, kann der Ansatz, den wir hier beschreiben, verwendet werden, identifizieren neue Gene und Wege, die Verbreitung von Proteinaggregaten zwischen unterschiedlichen Zelle Arten in Vivozu vermitteln. Erkenntnisse aus diesen Studien werden die begrenzte Verständnis der pathogenen Mechanismen erweitern, die neurodegenerativen Erkrankungen zu Grunde liegen und zeigen neue Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention.

Die hier beschriebenen Methoden produzieren robuste Daten, die zeigen Prion-artigen Übertragung von Proteinaggregaten Htt aus einer Zellpopulation zum anderen in der intakten Fliege CNS. Konvertierung von Wildtyp Htt von diffusen auf punktförmige wird durch direkte Fluoreszenz dieser YFP Schmelzverfahren Protein im Empfänger Glia infolge HttQ91 mCherry Ausdruck im Spender ORNs (Abbildung 2A-C und Abbildung 4<stro...

Beweise sammeln, unterstützt die Idee, dass Pathogene Protein-Aggregate im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen verteilt zwischen den Zellen mit Prion-ähnliche Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine Methode, die ermöglicht die Visualisierung von Zelle zu Zelle ausbreiten von Prion-ähnlichen Aggregaten im Modellorganismus Drosophila Melanogaster.

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die prionenartige Ausbreitung von Proteinaggregaten in vivo zu überwachen. Verwendung transgener Fliegen, die ein aggregationsanfälliges Protein in einer löslichen Version desselben Proteins in isolierten Zellpopulationen exprimieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie auf dem Gebiet der Neurodegeneration zu beantworten, wie z.B. wie Protein-Aggregat-Mythologie oder andere Materialien von Zelle zu Zelle im Gehirn übertragen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Abbildung von Proteinaggregaten ermöglicht, die sich in einem intakten Zentralnervensystem von einem Zellort Opossum auf ein anderes ausbreiten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie der Huntington-Krankheit und anderer prionenähnlicher neurodegenerativer Erkrankungen. Denn die Ausbreitung von Aggregaten scheint ein gemeinsamer Mechanismus zu sein, der dem Fortschreiten dieser tödlichen Erkrankungen zugrunde liegt.Unter Verwendung von Standard-Kultivierungsbedingungen werden transgene Drosophila melanogaster-Linien erzeugt, die gewebespezifische Gal4- oder QF-Treiber enthalten. Sowie Linien, die Wildtyp- oder mutierte Huntingtin-Transgene enthalten, die dem Gal4-UAS oder QF-QUAS nachgeschaltet sind. Sammle die Nachkommen des Begierde-Genotyps und lass sie altern, bis sie bereit sind, zu sezieren.Um sich auf die Dissektion des Gehirns vorzubereiten, sammeln Sie die benötigten Lösungen und kühlen Sie sie auf Eis, zusammen mit der Multi-Well-Glasschale, den Pipettenspitzen und einer Pinzette. Anschließend werden die erwachsenen Fliegen mit Kohlendioxid betäubt und in eine Vertiefung der Glasschale überführt. Geben Sie dann etwa einen halben Milliliter PBST in die Vertiefung mit den Fliegen und in eine angrenzende Vertiefung.Fokussieren Sie dann unter einem Präpariermikroskop auf eine einzelne Fliege und beleuchten Sie sie von beiden Seiten mit Schwanenhalslichtern. Positionieren Sie dann ein gefaltetes Taschentuch unter der Schale, um die Sezierwerkzeuge zu reinigen. Übertragen Sie nun mit der Pinzette Nummer drei in der nicht-dominanten Hand eine einzelne Fliege in die Vertiefung mit PBST.Fixieren Sie die Fliege, indem Sie ihren Bauch mit der Bauchseite nach oben fassen und die Fliege vollständig untertauchen. Führen Sie nun einen Zinken einer Pinzette mit der Nummer fünf unter der Nagelhaut in den kleinen Raum neben dem Rüssel ein. Befestigen Sie dann den Griff am Kopf, indem Sie die Öse von beiden Seiten einklemmen und die Pinzette auseinanderziehen, um den Kopf zu lösen.Entsorgen Sie den Fliegenkörper auf dem gefalteten Gewebe, während der Kopf im PBST eingetaucht bleibt. Führen Sie als Nächstes einen Zinken der Zange Nummer drei in den gleichen Raum auf der anderen Seite des Rüssels ein und ziehen Sie die Nagelhaut des Kopfes vorsichtig auseinander, um das Gehirn freizulegen. Bevor Sie fortfahren, entsorgen Sie die Nagelhautreste auf einem Laborgewebe.Vermeiden Sie bei der Entfernung der Nagelhaut den direkten Kontakt mit dem Gehirn, um es nicht mit einer Pinzette zu beschädigen. Entfernen Sie nun das präparierte Gehirn aus dem PBST, indem Sie entweder eine befestigte Luftröhre greifen oder es mit Kapillarwirkung in den Raum zwischen den Pinzettenspitzen aspirieren. Übertragen Sie dann das Fliegengehirn in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Fixierlösung auf Eis.Beobachte genau, ob sich das Gehirn von der Pinzette löst. Sobald alle Gehirne präpariert sind, geben Sie das Entnahmeröhrchen in einen Nutator bei Raumtemperatur und wickeln Sie es etwa fünf Minuten lang ein. Entfernen Sie nach der Fixierzeit den größten Teil der Fixierlösung mit einer p1000-Pipette und entsorgen Sie sie, wobei Sie sehr vorsichtig darauf achten sollten, das Gehirn in den Röhrchen zu belassen.Dies erfordert ein sanftes Absaugen und eine sorgfältige Beobachtung. Geben Sie als nächstes einen Milliliter frisches PBST in das Gehirn. Decken Sie die Tube ab und lassen Sie sie etwa eine Minute lang auf dem Nutator schaukeln, um das restliche Fixiermittel abzuwaschen.Entfernen Sie dann die Lösung und wiederholen Sie diesen kurzen Waschschritt. Nach den beiden kurzen Wäschen folgt eine fünfminütige Wäsche, dann drei 20-minütige Wäschen und schließlich eine einzige einstündige Wäsche. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche vorsichtig den größten Teil des PBST und tauchen Sie das Gehirn in 30 Mikroliter Antifade-Reagenz auf Glycerinbasis.Dann inkubieren Sie die Gehirne bei 4 Grad Celsius im Dunkeln ohne Bewegung für ein bis 24 Stunden. Später nehmen Sie die Gehirne mit einer abgestumpften Pipettenspitze aus dem Entnahmeröhrchen und übertragen sie auf einen Objektträger. Richten Sie dann das Gehirn vorsichtig aus, wie es für die Bildgebung mit einer Pinzette erforderlich ist.Mehrere Proben können in getrennten Reihen auf denselben Objektträger montiert werden. Entfernen Sie anschließend das überschüssige Antifading-Reagenz mit der Ecke eines gefalteten Laborgewebes vom Objektträger. Lassen Sie das Gewebe nicht mit dem Gehirn in Berührung kommen.Lassen Sie die Proben dann fünf bis 10 Minuten lang im Dunkeln, damit das Gehirn am Objektträger haften kann. Nehmen Sie als Nächstes kleine Stücke zerbrochenes Deckglas und positionieren Sie sie um das Gehirn, das eine Fläche von etwa 19 Quadratmillimetern bedeckt, und senken Sie dann vorsichtig ein 22 Quadratmillimeter großes Deckglas über das Mosaik aus Gehirn und Glas, um eine Brückenhalterung herzustellen. Geben Sie anschließend langsam frisches Antifading-Reagenz unter den Deckglas, damit es die leeren Stellen ausfüllt.Tun Sie dies sehr vorsichtig, damit das Gehirn und das Glas an Ort und Stelle bleiben. Anschließend versiegeln Sie den Deckglas mit Nagellack. Zuerst einfach an den Ecken auftragen.Lasse die Ecktupfer fünf bis 10 Minuten trocknen, bevor du die Versiegelung an den Rändern vervollständigst. Das Gehirn sollte so schnell wie möglich abgebildet werden. Bilden Sie die montierten Gehirne mit einem konfokalen Mikroskop ab, das mit einem 40-fachen oder 63-fachen Ölobjektiv ausgestattet ist, um Z-Scheiben in der Region des Gehirns zu sammeln, in der die trans-Gene exprimiert werden.Analysieren Sie dann die Daten, indem Sie die Punktzahl in den einzelnen Z-Schichten quantifizieren oder alternativ die Schichten in drei Dimensionen rendern. Um mutierte Huntingtin-Aggregate zu quantifizieren, die gut voneinander getrennt sind und wenig Hintergrundsignal aufweisen, öffnen Sie die konfokale Z-Serie im 3D-Betrachtungsmodus. Verwenden Sie dann den Analyse-Assistenten, um einzelne Stellen in einem selektiven Kanal zu identifizieren.Passen Sie in den Einstellungen die Schwellenwerte und Filter an, um alle heterogen großen Aggregate als einzelne Objekte im Bild genau darzustellen. Aktivieren Sie dann geteilte Objekte unter dem Vorfilter für die Binärverarbeitung, um eng verknüpfte Aggregate zu trennen. Quantitative Informationen über die von der Software identifizierten Objekte werden unter Messungen ausgewiesen.Nachdem Sie die Puncta gezählt haben, charakterisieren Sie sie in einer Bildanalysesoftware weiter. Nehmen Sie beispielsweise relevante Messungen der Flecken oder Oberflächen vor, um Informationen über den Gesamtdurchmesser, das Volumen oder die Intensität zu erhalten. Einige Wildtyp-Huntingtin-Aggregate können quantifiziert werden, indem man sich manuell durch den Z-Stapel bewegt und grüne Punkte zählt, die vom umgebenden diffusen Signal unterscheidbar sind.Achten Sie darauf, dass einzelne Aggregate nicht doppelt gezählt werden, wenn sie in mehr als einem Segment vorkommen. Eine weitere interessante Analyse ist die Bestimmung der Häufigkeit der Co-Lokalisation zwischen Huntingtin Q25-YFP und Huntingtin Q91-mCherry-Aggregaten. Tun Sie dies mit manueller Zählung, indem Sie Schicht für Schicht durch einen konfokalen Z-Stapel bewegen.Die sorgfältige Auswahl der genetischen Treiber und fluoreszierenden Protein-Transgenfusionen ermöglicht einen eindeutigen Nachweis von mutierten und Wildtyp-Huntingtin-Proteinen in nicht überlappenden Zellpopulationen. Die Umwandlung von Wildtyp-Huntingtin von diffus zu punktiert wird durch direkte Fluoreszenz des YFP-Fusionsproteins in Empfängerglia als Ergebnis der Huntingtin-Q91-mCherry-Expression in Donor-Geruchsrezeptorneuronen beobachtet. Die sorgfältige Auswahl der genetischen Treiber und fluoreszierenden Protein-Transgenfusionen ermöglicht einen eindeutigen Nachweis von mutierten und Wildtyp-Huntingtin-Proteinen in nicht überlappenden Zellpopulationen.Mutanten- und Wildtyp-Huntingtin-Aggregate können als punktuelle Objekte quantifiziert werden, entweder manuell oder mit Hilfe von Bildanalysesoftware. Die Aggregate können weiter als Populationen und für ihre Häufigkeit der Kolokalisation gemessen und charakterisiert werden. Co-lokalisierte Puncta können durch Fluoreszenz-Energie-Resonanz-Transfer (FRET) weiter analysiert werden, um die Nähe der fluoreszierenden Proteinfusionen nachzuweisen.Einmal gemeistert, kann die Dissektion und Bildgebung des Gehirns von Anfang bis Ende in weniger als acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, punktierte aggregierte Objekte sorgfältig von anderen fluoreszierenden Strukturen im selben Gewebe mit geeigneten Kontrollen zu unterscheiden. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um andere Methoden wie den Gen-Knockdown einzubeziehen, um die molekularen Mechanismen für den Aggregattransfer zwischen verschiedenen Zelltypen zu bestimmen.Vielen Dank und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Hier beschreiben wir eine neuartige Assays für die Überwachung der Prion-Aufnahme und-handel durch Immunzellen sofort nach intraperitonealer Inokulation durch Reinigung und Fluoreszenzmarkierung aggregierte Prion Stangen aus infizierten Gehirn Material dann die Überwachung ihrer Aufnahme und Bewegung an der Injektionsstelle und Charakterisierung der Zellen Vermittlung dieser Ereignisse.

Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur in vivo-Bildgebung von C. elegans, die prionenähnliche Proteine exprimieren, die mit rot fluoreszierendem Protein markiert sind. Das Protokoll beinhaltet die Immobilisierung von Nematoden auf einem Agarose-Pad für die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die Proteinaggregation und den Transport innerhalb und zwischen den Zellen aufzudecken. Diese Technik ist entscheidend für die Untersuchung der Proteinaggregation im Zusammenhang mit neurodegenerativen...

Zeitraffer-Bildgebung zur Überwachung der transzellulären Ausbreitung prionenähnlicher Proteine in transgenen Nematoden

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Das Gehirn wird fixiert, gewaschen und mit einem Antifading-Mittel behandelt, bevor es montiert wird. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und quantifiziert, um die Übertragung mutierter Proteinaggregate zu beobachten.

Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

Die Prionen-ähnliche Vermehrung von Proteinaggregaten hat sich in letzter Zeit als an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie der Fadenwurm C. elegans als Modellsystem zur Überwachung der Proteinausbreitung und zur Untersuchung prionenähnlicher Phänomene verwendet werden kann.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die ex vivo Kalziumbildgebung in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung und ermöglicht die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Erfahren Sie, wie die zelluläre Ausbreitung prionartiger Proteinaggregate in Drosophila melanogaster in vivo visualisiert wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit.

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

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