Name: Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie die zelluläre Ausbreitung prionartiger Proteinaggregate in Drosophila melanogaster in vivo visualisiert wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit.

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Wir danken Mitgliedern von Kopito, Luo und Pearce Labs für viele hilfreiche Diskussionen während der Entwicklung dieser Methoden. Wir danken auch Brian Temsamrit für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Mittel von Universität der Wissenschaften und der w. Smith Stiftungen unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Da die Zahl der Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen weiter zu erhöhen, gibt es eine dringende Notwendigkeit, das Verständnis der molekularen Pathogenese dieser Erkrankungen erhöhen, so dass bessere Therapien entwickelt werden können. Hier beschreiben wir Methoden, die für die Überwachung der Prion-artigen Übertragung von pathogenen Proteinaggregaten zwischen verschiedenen Zelltypen in der Modellorganismus Drosophila Melanogaster. Wir haben vor kurzem diese Methode verwendet, um Prion-wie Getriebe des m...

Die Prion-Hypothese besagt, dass der Erreger verantwortlich für die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (z.B.Creutzfeldt - Jakob-Krankheit beim Menschen, Scrapie bei Schafen, verschwenden chronisch im Hirschen und Elchen und "Rinderwahnsinn" bei Rindern ) besteht ausschließlich aus Protein und frei von Nukleinsäuren1. Prion-Krankheiten übernimmt die zellulären Prion-Protein (PrPC) eine nicht-Native, stabile Falte (PrP-Sc), die ist sehr Beta Blatt-reich und kann selbst durch die Umwandlung und Rekrutierung von Monomeren PrPC Moleküle in stabilen Amyloid ausbreiten Aggregate. PrP-Sc -Aggregate nutzen diesen selbstreplizierende Mechanismus zwischen verschiedenen Zellen in einem Organismus und sogar zwischen einzelnen Organismen2zu verbreiten.
Protein misfolding und Aggregation ist auch ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS))3. Bildung von Intra oder extra zellulare aggregierten Protein Baugruppen bei diesen Erkrankungen ist eng verknüpft mit Zytotoxizität4 und schreitet hoch reproduzierbare und krankheitsspezifische Pfaden durch das Gehirn über Zeit5, 6. diese Muster der Ausbreitung legen nahe, dass Pathogene Aggregate mit diesen Erkrankungen assoziiert sind Prion-ähnliche Eigenschaften haben. Starke Unterstützung existiert nun für Prion-wie Übertragung der Aggregate zugeordnete AD, PD, HD und ALS - sie breitete sich von Zelle zu Zelle und Vorlage der Konformationsänderung der Monomere Formen des gleichen Proteins in zuvor nicht betroffen Zellen7, 8.
Die Mehrheit der Studien, die untersuchen Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten bisher wurden durchgeführt mit Säugerzelle Kultur Modelle, bei denen ein Übergang Aggregate in das Zytoplasma der naive Zellen aus dem extrazellulären Raum oder von einer anderen Zelle Zytoplasma9,10,11,12,13,14,15, oder durch Einspritzen von Aggregat-haltigen Material in Mäusegehirnen und Überwachung aggregieren Auftritt außerhalb der Injektion Seite16,17,18,19,20,21,22, 23. in jüngerer Zeit, transgene Tiere verwendet wurden, um nachzuweisen, dass die intrazelluläre Aggregate auf andere Zellen im intakten Gehirn24,25,26,27, verbreiten 28,29,30. Hier beschreiben wir eine Methode für die direkte Visualisierung der aggregierten Transfer zwischen den einzelnen Zellen im intakten Gehirn von Drosophila Melanogaster. Drosophila -Modelle HD/Polyglutamin-(PolyQ) Krankheiten wurden vor fast zwei Jahrzehnten entwickelt31,32 und haben viele wertvolle Einblicke in die pathogenen Mechanismen, die diese Störungen zugrunde liegen 33. HD ist eine vererbte Neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch eine autosomal dominante Mutation in dem gen, das für das Protein Huntingtin (Htt)34kodiert. Diese Mutation führt zu Ausdehnung von einer PolyQ Strecke in der Nähe von Htts N-Terminus jenseits einer pathogenen Schwelle des ~ 37 Glutaminen, verursacht das Protein Misfold und insgesamt35,36. Wildtyp Htt Proteine mit < 37 Glutaminen in diesem Küstenabschnitt erreichen ihre heimischen Herde, sondern induziert werden können, um aggregierte bei direktem Körperkontakt mit einer Htt Aggregat "seed"12,27,37. Wir nutzen diese homotypische kernhaltigen Aggregation von Wildtyp Htt als einer Anzeige für Prion-wie Transfer und zytoplasmatischen Eintrag von mutierten Htt-Aggregate mit Ursprung in anderen Zellen.
Bestimmung der Mechanismen durch die Prion-ähnliche Aggregate kann Reisen zwischen Zellen zur Identifizierung der neue therapeutische Targets für unheilbare Neurodegenerative Erkrankungen führen. Wir nutzen Sie den schnellen Lebenszyklus, Benutzerfreundlichkeit und genetische Lenkbarkeit von Drosophila Melanogaster , molekulare Mechanismen für die Zell-Zell-Ausbreitung von mutierten Htt Aggregate zu definieren. Unsere experimentelle Strategie beschäftigt zwei binäre Expressionssysteme in Drosophila, etablierten Gal4-spezifische vorgelagerten aktivierende Sequenz (Gal4-UAS) System38 und vor kurzem entwickelt QF-QUAS System39zur Verfügung. Diese zwei unabhängige Kupplungssysteme ermöglicht Ausdruck von Mutanten und Wildtyp Htt transgenen auf unterschiedliche Zellpopulationen innerhalb der gleichen fliegen40zu beschränken. Mit diesem Ansatz untersuchen wir Prion-ähnliche Verbreitung der mutierte Htt durch Überwachung der Umverteilung der zytoplasmatischen Wildtyp Htt von seinem normalerweise diffuse, löslichen Zustand zu einem aggregierten Zustand, eine direkte Folge der Körperkontakt mit einer vorgeformten mutierte Htt aggregierte "Samen". Umwandlung von Wildtyp Htt durch mutierte Htt kann bestätigt werden, mit biochemischen und biophysikalische Techniken, die berichten von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Fluoreszenz Resonanz Energie transfer (FRET)9,27,41 .
Wichtig ist, greifen wir auch eine große Anzahl von genetischen Werkzeuge in Drosophila , Gene und/oder Wege, die Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten vermitteln zu identifizieren. Wir haben vor kurzem dieser Ansatz verwendet, um eine Schlüsselrolle für die Zelle Oberfläche Scavenger Rezeptor, Draper42,43, bei der Übertragung von mutierten Htt Aggregate von neuronalen Axone zum nahe gelegenen phagocytic Glia in Drosophila zentrale enthüllen Nervensystem (ZNS)27. So kann die genetischen und Imaging-basierte Ansatz, den wir hier beschreiben wichtige biologische Basisinformationen über ein krankheitsrelevante Phänomen in der einfach zu bedienenden aber mächtige Modellorganismus Drosophilaoffenbaren.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10X, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Verdünnung auf 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS), gefiltert</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquotieren und bei Erhalt einfrieren</td></tr><tr><td>Hühner-Anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Verwendung bei einer Verdünnung von 1:500</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Verwendung bei einer Verdünnung von 1:2000; kann fluoreszierende Proteine auf DsRed-Basis erkennen (z. B. mCherry, mStrawberry, tdTomate usw.)</td></tr><tr><td>Maus anti-Bruchpilot</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Anwendung bei 1:100 Verdünnung; markiert aktive präsynaptische Strukturen im gesamten Fliegengehirn</td></tr><tr><td>FITC Anti-Huhn</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Anwendung bei 1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Kaninchen</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Verwendung bei 1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Maus-Antikörper</td><td>Leben Technologies</td><td>A21235</td><td>Verwendung bei einer Verdünnung von 1:250</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (25 x 75 x 1,0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette in Biologiequalität, Typ 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>Verwendung in nicht dominanter Hand</td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Pinzette, Style 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>Verwendung in dominanter Hand</td></tr><tr><td>LAS X Bildanalysesoftware</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris Bildanalysesoftware</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung von zelle zu zelle Übertragung von prion-wie protein-aggregate in drosophila melanogaster

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Proteinaggregation ist ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Krankheiten, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Protein-Aggregate sind eng verbunden mit Neuropathologie bei diesen Erkrankungen, obwohl der genaue Mechanismus, mit dem aberranten Proteinaggregation normale zelluläre Homöostase stört, nicht bekannt ist. Daten liefern starke Unterstützung für die Hypothese, dass Pathogene Aggregate in AD, PD, HD und ALS haben viele Ähnlichkeiten mit Prionen, die nur-Protein Krankheitserreger für den transmissiblen spongiformen Enzephalopathien verantwortlich sind. Prionen replizieren selbst von Template die Konvertierung nativ gefaltet Versionen des gleichen Proteins, Ausbreitung des Phänotyps Aggregation verursacht. Wie Prionen und Prion-ähnliche Proteine in AD, PD, HD und ALS Übergang von einer Zelle zur anderen ist derzeit eine Fläche von intensiver Untersuchung. Hier wird ein Drosophila Melanogaster -Modell, das erlaubt, Überwachung der Prion-Like, Zell-Zell-Übertragung von mutiertem Huntingtin (Htt) Aggregaten verbunden mit HD beschrieben. Dieses Modell nutzt die leistungsstarke Werkzeuge zur Manipulation der Transgene Ausdruck in vielen verschiedenen Geweben in Drosophila und nutzt ein Eindringmittel getaggt zytoplasmatischen Protein direkt Bericht Prion-artigen Übertragung von mutierten Htt-Aggregate. Wichtig ist, kann der Ansatz, den wir hier beschreiben, verwendet werden, identifizieren neue Gene und Wege, die Verbreitung von Proteinaggregaten zwischen unterschiedlichen Zelle Arten in Vivozu vermitteln. Erkenntnisse aus diesen Studien werden die begrenzte Verständnis der pathogenen Mechanismen erweitern, die neurodegenerativen Erkrankungen zu Grunde liegen und zeigen neue Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention.

Die hier beschriebenen Methoden produzieren robuste Daten, die zeigen Prion-artigen Übertragung von Proteinaggregaten Htt aus einer Zellpopulation zum anderen in der intakten Fliege CNS. Konvertierung von Wildtyp Htt von diffusen auf punktförmige wird durch direkte Fluoreszenz dieser YFP Schmelzverfahren Protein im Empfänger Glia infolge HttQ91 mCherry Ausdruck im Spender ORNs (Abbildung 2A-C und Abbildung 4<stro...

Beweise sammeln, unterstützt die Idee, dass Pathogene Protein-Aggregate im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen verteilt zwischen den Zellen mit Prion-ähnliche Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine Methode, die ermöglicht die Visualisierung von Zelle zu Zelle ausbreiten von Prion-ähnlichen Aggregaten im Modellorganismus Drosophila Melanogaster.

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die prionenartige Ausbreitung von Proteinaggregaten in vivo zu überwachen. Verwendung transgener Fliegen, die ein aggregationsanfälliges Protein in einer löslichen Version desselben Proteins in isolierten Zellpopulationen exprimieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie auf dem Gebiet der Neurodegeneration zu beantworten, wie z.B. wie Protein-Aggregat-Mythologie oder andere Materialien von Zelle zu Zelle im Gehirn übertragen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Abbildung von Proteinaggregaten ermöglicht, die sich in einem intakten Zentralnervensystem von einem Zellort Opossum auf ein anderes ausbreiten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie der Huntington-Krankheit und anderer prionenähnlicher neurodegenerativer Erkrankungen. Denn die Ausbreitung von Aggregaten scheint ein gemeinsamer Mechanismus zu sein, der dem Fortschreiten dieser tödlichen Erkrankungen zugrunde liegt.Unter Verwendung von Standard-Kultivierungsbedingungen werden transgene Drosophila melanogaster-Linien erzeugt, die gewebespezifische Gal4- oder QF-Treiber enthalten. Sowie Lini

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir eine neuartige Assays für die Überwachung der Prion-Aufnahme und-handel durch Immunzellen sofort nach intraperitonealer Inokulation durch Reinigung und Fluoreszenzmarkierung aggregierte Prion Stangen aus infizierten Gehirn Material dann die Überwachung ihrer Aufnahme und Bewegung an der Injektionsstelle und Charakterisierung der Zellen Vermittlung dieser Ereignisse.

Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur in vivo-Bildgebung von C. elegans, die prionenähnliche Proteine exprimieren, die mit rot fluoreszierendem Protein markiert sind. Das Protokoll beinhaltet die Immobilisierung von Nematoden auf einem Agarose-Pad für die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die Proteinaggregation und den Transport innerhalb und zwischen den Zellen aufzudecken. Diese Technik ist entscheidend für die Untersuchung der Proteinaggregation im Zusammenhang mit neurodegenerativen...

Zeitraffer-Bildgebung zur Überwachung der transzellulären Ausbreitung prionenähnlicher Proteine in transgenen Nematoden

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Das Gehirn wird fixiert, gewaschen und mit einem Antifading-Mittel behandelt, bevor es montiert wird. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und quantifiziert, um die Übertragung mutierter Proteinaggregate zu beobachten.

Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

Die Prionen-ähnliche Vermehrung von Proteinaggregaten hat sich in letzter Zeit als an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie der Fadenwurm C. elegans als Modellsystem zur Überwachung der Proteinausbreitung und zur Untersuchung prionenähnlicher Phänomene verwendet werden kann.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die ex vivo Kalziumbildgebung in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung und ermöglicht die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Erfahren Sie, wie die zelluläre Ausbreitung prionartiger Proteinaggregate in Drosophila melanogaster in vivo visualisiert wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit.

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

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