Name: Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Erfahren Sie die ultraschnelle, waschmittelfreie Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid-Doppelschichten mit fusogenen Proteoliposomen. Diese Methode ermöglicht den Aufbau komplexer Mehrkomponenten-Membransysteme für Biochemie und synthetische Biologie.

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Autoren sind dankbar für Robert Gennis von University of Illinois und Christoph von Ballmoos Universität Bern für die Bereitstellung ein Plasmid und eine Belastung, Bo3auszudrücken-Oxidase. Das Projekt wurde unterstützt durch BBSRC BB/L01985X/1 gewähren, R.I. und r.b.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Im folgenden einige Punkte für den Erfolg dieser experimentellen Ansatz berücksichtigt werden müssen:
Wahl für Proteoliposomes und Ziel Bilayer Lipid kostenlos: Kationische Lipide sind nicht in der Natur gefunden, während anionische Lipide reich an biologischen Membranen erreichen sind, z. B. ~ 25, 35 und 20 % in der inneren Membran von E. Coli, Plasmamembran der Hefe S. Cerevisiaeund inneren mitochondrialen Membranen viele Arten, bzw.27,28,29. Es wäre zu erwarten, dass die Funktionalität von Membranproteinen in PL+ von der Stärke eine positive Ladung der Bilayer betroffen sein könnten, die wiederum auf eine relative Inhalt von kationischen Lipid in der Bilayer und externen Ionischen abhängen würde Stärke. Daher ist es wichtig, experimentell zu adressieren, in welchem Umfang die Ladung der kationischen Lipid Umwelt Funktionalität von Membranproteinen interessant abhängen würde. Hier zeigen wir, dass beide F1Fo ATP-Synthase und Bo3-Oxidase reagieren empfindlich auf kationischen Lipid-Umgebung, aber wir haben zu modulieren und diesen Effekt umzukehren, indem erste Platzierung der Proteine in PL+ und liefern sie in anionischen Bilayer zu akzeptieren, und dann Erhöhung der Ionenstärke des reaktionsmediums nach der Verschmelzung ist fertig.
Auswahl an einem bestimmten kationischen Lipid: Die meisten im Handel erhältlichen kationischen Lipide sind nicht Triacylglyceride Natur; Daher muss ein potenzieller Kandidat Lipid für Kompatibilität mit interessierender Membranproteine getestet werden. Wir fanden bisher15 , die die ATP-Synthase verwendet in dieser Studie zeigte, dass seine beste Leistung in PL+ von Ethyl-PC, gebildet, die die höchste strukturelle Ähnlichkeit mit den natürlichen Triacylglyceride Lipide, während in DOTAP (nicht-Triacylglyceride hat Lipid) PL+ dieses Protein war weniger aktiv.
Vesicle Fusion Assays: Wahre Vesicle Fusion (wenn intravesicular flüssigen Inhalt mischen) muss von Hemi-Fusion Zwischenzustände, unterschieden werden, wenn Vesikel miteinander ohne mischen ihre wässrigen Inhalt halten, aber ohne weiteres Inhalt ihrer externen oder beide Lipid mischen 30Broschüren. Bei suboptimalen Lipid-Mischungen oder bestimmten Bedingungen zeigen Vesikel auch ausgeprägte flüssigen Inhalt Leckage während Fusion31. Minimale Konzentrationen von geladenen Lipide in Fusogenic Mischungen ermöglicht wahre Fusion für jede Art von Lipid experimentell gefunden werden müssen, aber es wird im allgemeinen festgestellt, dass Membranen mit weniger als 10 % in Rechnung gestellt, dass Fette nicht Fusogenic 32gerendert werden.
Während Fusogenic SUV in Anwesenheit von Multi-Valent Ionen bilden, ist es wichtig, entgegengesetzt geladene Komponenten zu mischen, da dies sofort verklumpen und Aggregation von Lipiden durch diese Ionen führen kann. Zum Beispiel während der Vorbereitung SUV für die Kobalt-Calcein-EDTA-Methode, ist es wichtig, zu vermeiden, mischen eine kationischen Lipid-Mischung mit EDTA gegen Verstopfung des Filters Polycarbonat durch aufgehäuften Komponenten.
Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass die Kobalt-Calcein-EDTA-Methode, wobei sehr empfindlich und bequem für die Überwachung der Echtzeit-Fusion noch das Ausmaß der Fusion wegen 1 unterschätzen kann) selbst abschrecken der Fluoreszenz des freien Calcein innen Postfusion Vesikel, die erwartet wird, um 1 mM zu erreichen, während die selbst abschrecken Schwelle berichtet wird, soll rund 20 µM33und 2) Oberfläche gebundene Kobalt-Calcein, die an SUV+ gebunden bleibt auch nach dem Durchgang durch das Gel-Filtration-Harz und Vesikel, eine helle orange Farbe, Farben, während SUV0 haben eine blasse orange Farbe. Auch beachten Sie, dass die Freisetzung der gebundenen Kobalt-Calcein bei Zugabe von Waschmittel Triton x-100 im Beisein von EDTA viel stärkere Signale für SUV+ (Abbildung 3, rote Spur) als SUV0 (graue Spur) erzeugt.
Perspektiven: Wir erwarten, dass die schnelle Ansätze, die hier beschriebenen können erheblich erleichtern und Montage von komplexen Membranen für die Bedürfnisse beschleunigen der synthetischen Biologie Anwendungen. Unsere Membrane Protein Rekonstitution Protokoll nimmt nur eine halbe Stunde für Wiederherstellung des fragilen große Membranproteine bekannt empfindlich zu längeren Dialyse-basierte Wiederherstellung Techniken sein, während dieser Fusogenic-Ansatz nur ca. 5-10 min nimmt zu liefern solche Proteine in großen Lipid Bilayer. Hier zeigen wir die Vorteile dieser Ansätze durch die Manipulation von E. Coli F1Fo ATP-Synthase, die ein Beispiel für eine zerbrechliche Protein ist. Es besteht aus 23 Untereinheiten und bekannt, um seine Integrität leicht verlieren, wenn suboptimalen Bedingungen (z. B. Wärme) während/nach der Solubilisierung ausgesetzt, aber in diesen Verfahren verwendet wird, zeigt das Protein reproduzierbar hohen Aktivität in Protonen Pumpen.

Funktionalisierung der künstlichen Lipid Bilayer mit Membranproteine ist ein wichtiger Schritt bei der Montage der Membran Modellsystemen. Das einfachste Modell, Proteoliposomes (PL), besteht aus kleinen (30-200 nm Durchmesser) Unilamellar Vesikeln (SUV, auch genannt Liposomen), mit Proteinen in ihren Membranen integriert. PL bilden sich traditionell in zwei Schritte1. Erste, vorgeformten SUV sind gemischt mit einem Membranprotein des Interesses und ein Waschmittel in einer Konzentration über seine kritischen Micelle Konzentration (CMC). Zweitens wird das Waschmittel mit verschiedenen Dialyse, "Bio-Perlen" oder Gel Filtration-Techniken, so dass das Protein in der Membran entfernt. Der zweite Ansatz ist viel schneller (~ 30 min1) und wird daher bevorzugt für Rekonstitution der Membranproteine, zerbrechlich und empfindlich, während der ersten beiden Ansätze durch Reinigungsmittel entfernen Geschwindigkeit begrenzt sind, dauert viele Stunden und kann dazu führen, dass ein erheblichen Verlust von Aktivität und Verlust der strukturellen Integrität der Proteine. Funktionalisierung der größeren Bläschen (große Unilamellar Vesikel, LUV, bis zu 1 µm Durchmesser) von dieser Vorgehensweise ist eine größere Herausforderung, als Vesikel wird verkleinert nach Reinigungsmittel entfernen und es ist nicht möglich für giant Unilamellar Vesikel (GUV, > 1 µm), so wie sie sind destabilisiert durch Reinigungsmittel (aber siehe Johnson Et al. 2 für langsame 2D-Kristallisation von Membranproteinen in großen Bilayer). Alternative Ansätze für GUV Membran Funktionalisierung3,4,5 existieren aber sind mühsam, zeitaufwendig und erfordern noch etwas Spülmittel bei Konzentrationen unter CMC. Mehr komplexe oder zerbrechliche Lipid-Modelle (z. B. Tröpfchen Hydrogel Bilayer6 und 3D druckbare Tröpfchen Schnittstelle Bilayer-basierte künstliche Gewebe7) verträgt keine Reinigungsmittel. Schnell neue synthetische Biologie Anwendungen8,hängen9,10 kritisch Funktionalisierung von solch komplexe membranstrukturen. Daher ist eine einfache und robuste Methode ermöglicht schnelle und schonende Lieferung von Membranproteinen in das Ziel fragile Bilayer in hohem Grade im Feld gesucht.
Eine Alternative ist Waschmittel-freie Protein Übermittlungsmethode Vesikel Fusion, wo interagierenden Vesikel Membranen in den intakten postfusion Bilayer vereinen, während ihre intravesicular wässrige Inhalt durcheinander geraten, ohne in den externen freigesetzt, Umgebung. Vesicle Fusion ist aktiviert und gesteuert entweder durch Konformationsänderungen Umstellungen innerhalb von komplementären Fusogenic Agenten (einige Proteine11,12 und Peptide13 oder speziell modifizierte DNA-14) befindet sich in der Kontaktaufnahme Bilayer oder Coulomb Wechselwirkungen zwischen Lipid Bilayer komplementär geladenen anionischen und kationischen Lipide15,16, gebildet oder kationischen Bilayer und negativ geladenen Proteine17.
Der ehemalige Ansatz erfordert die Anwesenheit von Fusogenic Agenten in den interagierenden Membranen vor der Fusion, ist relativ langsam (~ 30 min bis halb-maximal Fusion12,18), sondern können auch auf natürliche und künstliche Membranen.
Ein Vorteil des Ansatzes mit Fusogenic Lipide (Abbildung 1) ist, dass es viel schneller Membranfusion (~ 1 min, Hälfte-Maximum und ca. 5-10 min zu beenden die Reaktion zu erreichen) ermöglicht. Darüber hinaus kann das Ausmaß der Fusion i) ein einfach zu formulieren, relative Inhalt der geladenen Lipide in Fusogenic Bilayer und (Ii) ionische und im Allgemeinen, osmotische Kraft des reaktionsmediums (Salze in über 50 mM und z. B. Saccharose15 gesteuert werden werden angezeigt, Fusion zu stoppen), oder eine Kombination aus beidem. Um die Fusion zu starten sind entgegengesetzt geladenen Fusogenic Vesikel in einem niedrig (in der Regel 10-20 mM Salz) Ionenstärke Medium für 5-10 Minuten gemischt. Ein relative Nachteil der Methode ist, dass die kationischen Lipide können wirkt sich negativ auf die Funktionalität von Membranproteinen in kationischen Proteoliposomes vor der Fusion, vor allem in niedrigen Ionenstärke ausüben, aber dieser Effekt ist reversibel und mildere durch eine natürliche lipidzusammensetzung der Post-fusion Membran und seine Rückkehr zum normalen Ionenstärke Medium.

<table><tbody><tr><td>DOPC neutrales Lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>POPA anionisches Lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>E-PC kationisches Lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td><td>Thermofisher</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50, Super Fine</td><td>Sigma</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400, Typ 400-DL</td><td>Sigma</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>Sigma</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>Sigma</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Sigma</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase</td><td>Sigma/Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biotechnology</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamin 101</td><td>Sigma</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>Extrusionssystem</td><td>Avanti Extruder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einrohr-Luminometer, Modell Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Filter, D19 mm</td><td>Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes</td><td>WHA800309, WHA800284</td><td>100 oder 200 nm zur Bildung von SUV und 400 oder 800 nm für LUV</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Puffer für Papier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puffer A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Puffer B</td><td></td><td></td><td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4, 0,1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Puffer C</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4</td></tr><tr><td>Puffer D</td><td></td><td></td><td>1 mM MOPS pH 7,4 Verschiedene Konzentrationen von KCl</td></tr></tbody></table>

waschmittel-freie ultraschnelle rekonstitution von membranproteinen in lipid bilayer mit fusogenic ergänzende rechnung proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Reinigungsmittel sind unverzichtbar für die Lieferung von Membranproteinen in 30-100 nm kleine Unilamellar Vesikel, während komplexere und größere Modell Lipid Bilayer mit Waschmittel weniger kompatibel sind.
Hier beschreiben wir eine Strategie für die Umgehung dieses grundlegende Beschränkung mit Fusogenic entgegengesetzt geladenen Liposomen, die mit einer Membranprotein des Interesses. Fusion zwischen solchen Vesikel erfolgt innerhalb von 5 min in einem Puffer geringer Ionenstärke. Positiv geladenen Fusogenic Liposomen können als einfache Shuttle-Vektoren für Waschmittel-freie Lieferung von Membranproteinen in biomimetischen Ziel Lipid Bilayer, verwendet werden, die negativ geladen sind. Wir zeigen auch, wie Membranproteine in Fusogenic Proteoliposomes mit einem schnell 30-min-Protokoll zu rekonstruieren.
Die Kombination dieser beiden Ansätze, wir zeigen eine schnelle Montage einer Elektronentransport-Kette, bestehend aus zwei Membranproteine aus E. Coli, eine primäre Proton Pumpe Bo3-Oxidase und F1Fo ATP Synthase in Membranen der Vesikel verschiedene Größen von 0,1 bis > 10 µm sowie ATP-Produktion von dieser Kette.

Die Verwendung von Fusogenic ergänzende aufgeladenen Proteoliposomes für schnell Reinigungsmittel-freie Lieferung von Membranproteinen ins Ziel Bilayer Membranen umfasst drei Schritte (Abbildung 1): A, Bildung von Fusogenic SUV von Lipid-Mischungen mit hohem Inhalt der geladenen Lipide; Diese SUV kann optional eine intravesicular Last zu tragen; B, Umrechnung von Fusogenic SUV mit unserem schnellen Membrane Protein Rekonstitution PL; C, Verschmelzung von Fusogenic PL mit Ziel Bilayer in einem Niedrig-Salz-Medium, gefolgt von hohen Salzzusatz, die Fusionsreaktion zu stoppen. Im Falle einer großen Bläschen (D), ist eine vorzuziehene Strategie, Membranprotein in den anionischen Ziel Bilayer zu liefern, die eine bessere Lipid-Umgebung für Aktivität von Membranproteinen bietet (diskutiert weiter im Text).
Das GUV-Bildung-Protokoll mit invertierten Emulsion Methode wird ausführlich in Abbildung 2hervorgehoben. Wir bevorzugen Hexadecan in der Lipid-Ölmischung aufgrund seiner relativ hohen Gefriertemperatur (18 ° C), die einfache Entfernung des erstarrten Öl nach GUV ermöglicht Pelletierung.
Abbildung 3 zeigt die Fusion der Vesikel mit Kobalt-Calcein-EDTA-Methode. Fusion gilt nur, wenn ergänzende geladenen Vesikel in niedrigen Salz Puffern, während höhere Salzkonzentrationen verwendet werden (&gt; 50 mM14) oder die Verwendung von nicht-Fusogenic Vesikeln zeigen keine Fusion.
Dieses schnelle Protokoll der Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic SUV ist in Abbildung 4Adargestellt. Unter Verwendung dieses Protokolls, demonstrieren wir schnelle Wiederherstellung des primären Proton Pumpe Bo3-Oxidase und F1Fo ATP-Synthase in PL und Bewertung ihrer spezifischen Tätigkeit in diesen Membranen. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Ausbeute an Protein Rekonstitution nicht von der Ladung eines Lipid verwendet15 hängt und etwa 50-75 ist %25,12, und dass nach der Rekonstitution in PL, das Protein mindestens drei gespeichert werden kann Tage, sogar bei Raumtemperatur ohne offensichtlichen Verlust der proteinaktivität. Diese Prozedur liefert auch unidirektional Ausrichtung der ATP-Synthase, wo mehr als 95 % davon seine hydrophile Glyko-F1 orientierte nach außen15,26 hat.
Abbildung 5 zeigt, dass das Proton Pumpen Aktivität der F1Fo (zentrale A) und Bo3-Oxidase (Gruppe B) in kationischen Lipide ist reduziert und empfindlich auf niedrige Ionenstärke, verglichen mit anionischen und neutral Lipid-Umgebung, aber Dieser Effekt wird in postfusion Membranen nach Verschmelzung PL+ mit anionischen LUV–gemildert.
Abbildung 6 zeigt die Lieferung von F-1F-o -ATP-Synthase in Membranen der große Vesikel. In diesem Experiment, PL+ und 800 nm LUV– wurden in 20 mM KCl für 5 min und das Reaktionsprodukt verschmolzen war entfernen fusionierter PL+oelletiert, Nukleinsäuretablette und für das Pumpen von Proton untersucht. Control-Experimente zeigten keine Protonen-Pumpen, wenn LUV0 stattdessen Luv– verwendet wurden in Fusionsreaktion (schwarze Spur), oder leere LUV– allein waren vermutlich (blaue Spur).
Schnelle Montage einer funktionierenden Elektronentransport-Kette in Membranen der große Vesikel durch Fusogenic PL ist in Abbildung 7dargestellt. Wir verwendeten F1Fo SUV+ und Bo3 SUV+ für Fusion mit 800 nm LUV-, und demonstrierte ATP-Produktion von dieser Kette in der postfusion Vesikel indem sequenziell Coenzym Q1 und DVB-t zur Energetisierung Membranen und dann hinzufügen Phosphat ATP-Synthese von F1Foauslösen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> Abbildung 1: Konzeption der ultraschnellen Waschmittel-freie Lieferung von Membranproteinen ins Ziel Lipid Bilayer über Fusion von Vesikeln Unilamellar gebildet von ergänzenden geladenen Lipiden. (A) Bildung von anionischen und kationischen Fusogenic kleine Unilamellar Vesikel (+SUV, SUV-–) optional mit intravesicular Ladungen geladen. (B) Umwandlung von Fusogenic SUV in Fusogenic Proteoliposomes (PL) nach Rekonstitution von Membranproteinen. (C) Waschmittel-freie Lieferung von Membranproteinen in postfusion Membranen mit Fusogenic PL. (D) vorzuziehen Strategie für die Lieferung von Membranproteinen in Membranen von großen Vesikeln, illustriert durch die Fusion zwischen 100 nm PL+ und 800 nm LUV–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> Abbildung 2: GUV-Bildung-Protokoll mit einer invertierten Emulsion. (A) Bildung von einem Lipid Monolage auf der Grenze zwischen Wasser und Öl-Lipid-Mischung. (B) Bildung einer invertierten Emulsion (Wasser-in-Öl). (C) GUV-Bildung durch die Übergabe der Emulsion durch die Öl-Wasser-Grenze mittels Zentrifugation. (D) Kühlung des Rohres unten &lt; 18 ° C zu festigen und das Öl zu entfernen. (E) ein Fluoreszenz-Mikroskopie Bild einer GUV mit fluoreszierenden Lipid (1 % Gewicht Bruchteil Cholesteryl-Bodipy-FL12) in seine Membran (grün) und eine polare Fluorophor (1 mM Sulforhodamine 101) in die Vesikel Lumen (rot). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> Abbildung 3: Lipid Vesicles Fusion mit der Kobalt-Calcein-EDTA-Methode untersucht. (A) schematische Darstellung der Methode, wo freie Calcein aus einem nicht-fluoreszierende Kobalt-Calcein-Komplex von EDTA freigegeben wird. (B) Fusion der SUV in verschiedenen KCl-Konzentration. (C) Freisetzung von intravesicular Calcein durch Zugabe von EDTA und Triton x-100 Reinigungsmittel zu postfusion Vesikel in B gezeigt, wie im Text beschrieben. Fusion-Umfang (%) für rote Spur errechnet sich durch Division der maximalen Hintergrund korrigiert Fusion-Signal (1-2) durch das Hintergrund-korrigierte maximale Signal nach der Veröffentlichung des gekapselten Calcein (3-2) und mit 100 multipliziert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> Abbildung 4: Ultraschnelle Rekonstitution von Bo3-Oxidase und F1Fo in Fusogenic Proteoliposomes und Protein Aktivität Messungen in solchen Proteoliposomes. (A) schematische Darstellung der Rekonstitution Protokoll. (B) Coenzym Q1 Oxidation getrieben Proton Pumpen von Bo3-Oxidase in PL gemessen mit ACMA abschrecken (Erklärung im Text). (C) ATP Hydrolyse angetriebenen Proton Pumpen von F1Fo in PL gemessen mit ACMA abschrecken (Erklärung im Text). (D) ATP Hydrolyse durch F1Fo in PL mit ATP-Regeneration-System (Erklärung im Text) und seine Stimulation durch die Entkuppler gemessen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> Abbildung 5: Einfluss der Lipid-Umwelt und der Ionenstärke auf die Aktivität von Membranproteinen. Protonen-Pumpen von F1Fo (A) und Bo3-Oxidase (B) im kationischen PL (rote Spur), anionische PL (blaue Spur), neutrale PL (schwarze Spur) und kationischen PL verschmolzen mit anionischen LUV (grüne Spur) in 20 bis 100 mM KCl. Control Spur ( Gray) zeigt keine Veränderung der Proton Pumpen von F1Fo PL– beim Mischen mit SUV–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> Abbildung 6: Lieferung von F1Fo ATP-Synthase in Membranen von 800 nm LUV– über Fusion mit PL+. (A) schematische Darstellung des Experiments: PL+ und 800 nm LUV– in 1 mM MOPS (pH-Wert 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl für 5 min, um zu entfernen pelleted verschmolzen wurden fusionierter PL und Nukleinsäuretablette in den gleichen Puffer. (B) Proton Pumpen von postfusion LUV (rote Spur). Control-Experimente zeigten keine ACMA abschrecken, wenn PL0 wurden mit LUV– (schwarze Spur), gemischt oder leere LUV– allein waren vermutlich (blaue Spur). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> Abbildung 7: 5-min Waschmittel-freie Montage einer Elektronentransport-Kette in den Membranen von 800 nm LUV– über Fusion mit PL+. (A) schematische Darstellung des Experiments: 100 nm F1Fo PL+ und 100 nm Bo3-Oxidase PL+ wurden fusioniert mit LUV-, wie in Abbildung 6beschrieben. Fusion wurde durch Hinzufügen von KCl und MOPS zu 100 und 50 mM bzw. gestoppt. Die Membranen wurden mit ADP-Luciferin-Luciferase Cocktail vermischt und unter Spannung durch Zugabe von DVB-t und Q1, wie im Text beschrieben. ATP-Produktion wurde durch Zugabe von 1 mM Phosphat (Pich) und überwachten Echtzeit mit Luciferase-Luciferin-System wie im Text beschrieben eingeleitet. (B) ATP Synthese durch postfusion Vesikel (rote Spur). Experimente zeigten keine ATP-Produktion, wenn PL+ mischte mit LUV– in hohen Salz (grau) oder PL0 wurden mit LUV– (schwarz) gemischt. ATP-Synthese-Rate wurde berechnet, wie im Text (Schritte 8,8 8,9) erläutert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Das übergeordnete Ziel unseres einfach zu implementierenden Verfahrens ist es, eine schnelle waschmittelfreie Abgabe von Membranproteinen in Lipiddoppelschichten unterschiedlicher Größe durch Fusion zwischen Lipiddoppelschichten, die aus entgegengesetzt geladenen Lipiden gebildet sind, zu demonstrieren. Unsere Methodik kann in der Biochemie und Biophysik für den einstufigen Zusammenbau von biomermetrischen Mehrkomponenten-Lipid-Doppelschichtsystemen aus einzelnen Schichtkomponenten verwendet werden. Es ist wichtig zu erwähnen, dass der Vorteil unseres Ansatzes in dieser schnellen Funktionalisierung, d.h. der komplexen Modell-Lipidbilase, mit Proteinen, Lipiden und anderen Molekülen von Interesse liegt.Diese Methodik kann auch verwendet werden, um Membrantransportprozesse zu untersuchen, die eine Energetisierung der Lipidmembran erfordern. Zum Beispiel können Primärpumpen verwendet werden, um den Sekundärtransport anzutreiben, der durch andere Membranproteine ermöglicht wird. Unsere Methode kann auch bei den Bedürfnissen der synthetischen Biologie eingesetzt werden.Zum Beispiel, um Membranvesikel mit verschiedenen Programmfunktionalitäten zu erstellen. In Zukunft könnte das Einfangen solcher kleinen Vesikel in ähnlich größeren Vesikeln ein Schritt zum Bau einer künstlichen Zelle sein. Um die Lipid-Öl-Lösung zu bilden, mischen Sie Chloroform-Stamm mit einem Milliliter Hexadecan in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Um das Chloroform zu verdampfen, mischen und erhitzen Sie die Mischung 30 Minuten lang in einem horizontalen Shaker bei 80 Grad Celsius, indem Sie das Röhrchen offen lassen. Nach dem Verdampfen das Röhrchen verschließen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Als nächstes, um die Lipid-Monoschicht zu bilden, nehmen Sie an der Grenzfläche zwischen Lipid und wässrigem Puffer ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und übertragen Sie 200 Mikroliter Lipid in Öllösung auf 0,5 Milliliter Puffer B. Warten Sie dann 30-60 Minuten bei Raumtemperatur, bis sich die Phasentrennungsgrenze abflacht, was auf die Bildung der Lipidmonoschicht hinweist.Die konvexe Form der Phasentrennungsgrenze ist auf eine Fehlanpassung der Oberflächenspannung zwischen dem Öl und dem wässrigen Puffer zurückzuführen. Als nächstes mischen Sie zur Herstellung der Wasser-Öl-Emulsion eine Lösung aus nichtionischem Polysaccharid in Puffer B mit einer Dichte, die höher ist als die von Wasser. Übertragen Sie dann 0,5 Mikroliter der Mischung in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 100 Mikroliter Lipid in Öllösung enthält.Dann beschallen Sie das Gemisch bei 44 Kilohertz und 14 Watt für 30 Sekunden in einem Ultraschall-Wasserbad. Nach der Beschallung 45 Minuten lang kräftig vortexen, um die Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden. Um die Wasser-in-Öl-Emulsion in anionisches GUV umzuwandeln, übertragen Sie die Emulsion vorsichtig auf die wässrige Grenzfläche zwischen Lipid und Öl.In der Emulsion ist jedes Tröpfchen mit einer Lipid-Monoschicht überzogen. Die richtige Syndizierung der Wasser-in-Öl-Emulsion bestimmt den Erfolg der GUV-Bildung. Wenn es nicht richtig gebildet wird, koalesziert das Emulsionströpfchen wiederum, wodurch die Ausbeute an GUV-Bildung verringert wird.Um das GUV-Pellet zu erhalten, zentrifugieren Sie die Probe schnell bei 1000 mal G für zwei Minuten. Lege einen gebogenen Metalldraht so in das Rohr, dass er im Öl sitzt. Lassen Sie die Tube dann auf Eis, um das Lipid-Öl-Gemisch zu verfestigen.Entfernen Sie vorsichtig das gefrorene Öl und fangen Sie die wässrige Phase auf. Als nächstes suspendieren Sie das GUV-Pellet wieder in 50 Mikrolitern frischem Puffer B und geben Sie es in ein neues Röhrchen. Untersuchen Sie das GUV unter einem 100-fachen Öletauchobjektiv eines Fluoreszenzmikroskops.Verwenden Sie Gelfiltrationsharz, um eine Schwerkraft-Durchflusssäule vorzubereiten, und äquivalieren Sie mit Puffer A, der bei Raumtemperatur gehalten wird. Anschließend verdünnen Sie das gereinigte Membranprotein mit dem Extraktionspuffer auf eine Endkonzentration von 0,7 Milligramm pro Milliliter. Mischen Sie dann das Protein mit vorgeformtem kationischem SUV im Verhältnis eins zu 30 zusammen mit Kollat, das Puffer A enthält, bis zu einem endgültigen Volumen von 660 Mikrolitern.Stellen Sie dann das Probenröhrchen auf eine Wippe und schütteln Sie die Mischung vorsichtig 15 Minuten lang. Als nächstes wird die Mischung durch das Gelfiltrationsharz geleitet, die trüben Proteoliposomenfraktionen gesammelt und 15 Minuten lang bei 4.000 G zentrifugiert. Verwerfen Sie dann den nicht rekonstituierten Proteinüberstand und lösen Sie das Pellet in einem Milliliter frischem Puffer A.In einer Fluorometerküvette auf, fügen Sie 20 Mikroliter Proteoliposom mit B03-Oxidase zusammen mit zwei Millilitern Puffer A in Gegenwart von 0,5 Mikromolar ACMA hinzu und warten Sie auf ein stabiles Signal bei 430 Nanometern Anregung und 515 Nanometern Emission.Geben Sie dann 40 Mikromolare Coenzym Q1 in die Küvette. Fügen Sie als Nächstes zwei millimolare DTT zum Proteoliposom hinzu, um das Protonenpumpen zu starten, und dissipieren Sie dann den gebildeten Delta-pH-Wert. Geben Sie in einer separaten Küvette 40 Mikroliter Proteoliposomen mit F1-F0 zu 2 Millilitern Puffer A in Gegenwart von 0,5 mikromolaren ACMA und lösen Sie das Protonenpumpen aus, indem Sie dem Proteoliposom 0,2 millimolares ATP zusetzen und dann den gebildeten Delta-pH-Wert abbauen.50 Mikroliter PL+ mit 50 Mikrolitern 800 Nanometern LUV-in einem Milliliter Puffer D, ergänzt mit einem Millimolar Magnesiumchlorid und 20 Millimolar Kaliumchlorid für fünf Minuten, fusionieren. Dann zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 6.000 Mal G, um das LUV nach der Fusion zu pelletieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand, der aus nicht umgesetztem PL besteht, verworfen + dann das in einem Milliliter Puffer D gebildete Pellet resuspendiert, ergänzt mit einem Millimolar Magnesiumchlorid und 100 Millimolar Kaliumchlorid.Führen Sie erneut den ACM Quenching Assay durch. Mischen Sie zuerst drei Mikroliter B03-Oxidase PL+ und fünf Mikroliter F1F0 PL+, dann schmelzen Sie das Gemisch mit drei Mikrolitern LUV oder GUV in 800 Mikrolitern in Puffer D, ergänzt mit 20 Millimolar Kaliumchlorid und einem Millimolar Magnesiumchlorid für fünf Minuten. Als nächstes fügen Sie Kaliumchlorid und Mopppuffer in einer Endkonzentration von 150 Millimolar zur geschmolzenen Membranmischung hinzu.Mischen Sie 400 mikromolare ADP, 50 mikromolare Luciferin und 2,5 Mikroliter Luciferase in 200 Mikrolitern Puffer A, um einen Luciferin-Luciferase-ADP-Cocktail zuzubereiten. Geben Sie dann den Cocktail zur geschmolzenen Membranmischung. Für eine korrekte ADP-Synthesemessung ist es wichtig, vor der Zugabe von Q1 und DTT ein stabiles Luziferase-Signal zu haben, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden.Fügen Sie dann 40 mikromolare oxidierte Coenzyme Q1 hinzu und fügen Sie dann zwei millimolare DTT hinzu, um die Energetisierung der fusionierten Membran zu initiieren. Fügen Sie nach einer Minute eine fünf millimolare Kaliumphosphatlösung zu den energetisierten Vesikeln hinzu, um die ATP-Synthese zu starten. Um das resuspendierte GUV bei der Entfernung des gefrorenen Hexadecan aus dem Lipid-Öl-Gemisch zu untersuchen, wurde die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt.Die erhaltenen Bilder des GUV zeigen das Vorhandensein des fluoreszierenden Cholesterinbiopots FL12 auf seiner Membran und des Selbsterodimins 101, eines polaren Fluorophors im Lumen. Um die Fusion von SUV in der zunehmenden Konzentration von Kaliumchlorid zu quantifizieren, wurde ein Diagramm gezeichnet. Die Grafik erklärt, dass mit zunehmender Kaliumchloridkonzentration über 50 Millimolar die Fusion der SUV-Lipidvesikel abnimmt.Bei einer niedrigen Kaliumchloridkonzentration zwischen einem und 20 Millimolar verschmelzen jedoch die komplementär geladenen Vesikel. Als nächstes wurde zur Messung der BO3-Oxidase meditierten Protonenpumpantriebsoxidation des Coenzym Q1-Substrats ein Diagramm basierend auf dem ACMA Quenching Assay erstellt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Hinzufügen eines Entkopplers das ACMA-Fluoreszenzsignal erhöht, das entlang der Y-Achse des Diagramms dargestellt wird.Dann wurde auch das ATP-Hydrolyse-abhängige Protonenpumpen durch F1F0 basierend auf dem ACMA Quenching Assay gemessen. In der Grafik zeigt sich, dass das Hinzufügen eines Entkopplers das AMCA-Fluoreszenzsignal erhöht. Darüber hinaus wurde das Luciferin-Luziferase-System verwendet, um die ATP-Synthese in fusionierten Vesikeln zu überwachen.Die sequentielle Zugabe von Coenzym Q1 DTT, gefolgt von der Phosphatzugabe, zeigt eine erfolgreiche ATP-Produktion durch die fusionierten Vesikel. Einmal gemeistert, kann die erste Technik, die Bildung eines fusogentischen Proteoliposoms aus Detergenzien, symbolisierten Membranproteinen und Vereinigungsmyomedizinern, in nur 30 Minuten durchgeführt werden. Die zweite Technik, die physikalische Fusion, kann innerhalb von nur zehn Minuten noch schneller durchgeführt werden.Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mehrkomponenten-Membransysteme konstruieren kann, indem man verschiedene einzelne Bausteine kombiniert, die durch funktionalisierte Lipidvesikel dargestellt werden. Wir erwarten solche modularen Systeme, bei denen die wichtigsten Eigenschaften und Funktionen, die mit einem Schritt unmöglich sind, die Rekonstitution von Membranproteinen erfordern. Im Allgemeinen bieten unsere Verfahren einen einfachen Rahmen für den Aufbau komplexer kompartimentierter biochemischer Systeme, aus einfacheren, sogenannten Bio-Ziegeln.

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

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Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes. (Video) | JoVE Journal

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