Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine ratiometrische Kalziumbildgebung der Auswirkungen der hermaphroditenspezifischen Neuronenaktivität oder HSN-Aktivität auf das Verhalten von Caenorhabditis elegans durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Verhaltensneurowissenschaften zu beantworten, wie die Aktivität von Neuroschaltkreisen Veränderungen im Verhalten von Tieren hervorruft, wenn Tiere zwischen Verhaltenszuständen wechseln. Diese Technik ermöglicht es, Veränderungen der intrazellulären Kalziumaktivität mit dem hohen Signal-Rausch-Verhältnis aufzuzeichnen und gleichzeitig das Verhalten und die Fortbewegung der Tiere zu verfolgen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die neuronale Aktivität von C.elegans geben kann, kann sie auch auf andere transparente Modellsysteme wie Drosophila-Larven und Zebrafische angewendet werden. Mit mir werden die Studenten von Collin's Labs das Verfahren vorführen: Richard Kopcock, Pravat Dhakal und Layla Nassar. Um die Tiere zu montieren, tragen Sie zunächst OP50-Bakterienfutter von einer ausgesäten Nematoden-Wachstumsmedium-Agarplatte auf den Boden eines Platin-Wurmpickels auf und übertragen Sie mit dem Pickel etwa 20 späte L vier L-X 2.000 für Tiere, die den empfindlichen Kalziumreporter GCaMP5 und mCherry in HSN exprimieren, vom N-L drei P-Promotor auf eine ausgesäte Nematodenwachstumsmediumplatte.

Bestätigen Sie das Vorhandensein der sich entwickelnden Vulva unter einem Stereomikroskop als klarer dunkler Fleck, der von einer weißen Sichel umgeben ist, und inkubieren Sie die Würmer 24-40 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation tragen Sie OP50 auf eine neue Pickel auf und übertragen Sie drei Würmer auf eine nicht gesäte Nematodenwachstumsmediumplatte, wobei ein kleiner Teil des Futters auf der neuen Platte verbleibt, damit sich die Würmer während der Bildgebung ernähren können. Schneiden Sie dann mit einem flachen, abgerundeten Spachtel ein 20 x 20 Millimeter großes Stück aus der nicht gesäten Platte ab und legen Sie das Stück mit der Wurmseite nach unten auf eine Kante eines sauberen 24 x 60 Millimeter großen Deckglases mit der Nummer 1,5.

Schieben Sie dann das Agarstück vorsichtig in die Mitte des Deckglases und legen Sie ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas Nummer eins auf das Agarstück, um das Anhaften und Verdampfen zu reduzieren. Um den Imager einzurichten, platzieren Sie die Würmer auf dem Tisch eines inversen Mikroskops und wählen Sie das 20-fache subjektive Licht. Wählen Sie mit den binokularen Okularen einen Wurm für die Abbildung aus, schieben Sie den Infrarotfilter und platzieren Sie ihn über dem Kondensor.

Öffnen Sie ein geeignetes Videoanalyseprogramm und führen Sie das Skript für die endgültige Kommunikation der seriellen Stufe XY aus. Klicken Sie auf CsvWriter und wählen Sie einen Ordner zum Speichern der aufgezeichneten X- und Y-Bühneninformationen aus. Klicken Sie dann auf den grünen Pfeil, um das digitale Akquisitionsgerät zu initialisieren.

Wählen Sie in der Aufnahmesoftware für Infrarotkameras unter Einstellungen die Option Kamerasteuerungsdialog umschalten. Wählen Sie dann das Menü Benutzerdefinierte Videomodi und wählen Sie Modus 1 und Pixel Format Raw acht. Stellen Sie unter Trigger Stroke die Trigger Input Line auf drei, die Polarität auf high und den Modus auf 14 ein.

Schalten Sie "Aktivieren" um, um die Frame-Aufnahme zu stoppen, bis das Spannungsauslösesignal von der Fluoreszenzkamera empfangen wird. Klicken Sie bei geöffnetem Bildbetrachtungsfenster auf Aufzeichnen und wählen Sie den Ordner zum Speichern der Bildsequenzen aus. Wählen Sie den gepufferten Aufnahmemodus und speichern Sie die Bilder im JPEG-Format.

Klicken Sie dann auf Aufzeichnung starten, um die Erfassung zu initialisieren. Öffnen Sie als Nächstes den Capture-Tab in der Florescence Acquisition Software und stellen Sie die Belichtungszeit auf 10 Millisekunden, das Binning auf vier X und die Bildtiefe auf 16 Bit ein. Wählen Sie ein zentriertes Kamera-Sub-Array mit einer Breite von 512 Pixeln und einer Höhe von 256 Pixeln aus.

Das Programm teilt das breite Bild automatisch in zwei Hälften, um die separaten Floreszenzkanäle zu erzeugen. Klicken Sie auf Ausgabe-Trigger-Optionen anzeigen, und setzen Sie alle Trigger auf positiv. Vergewissern Sie sich, dass Auslöser eins und Auslöser zwei auf Belichtung und Auslöser drei auf Programmierbar mit einem Zeitraum von 25 Millisekunden eingestellt sind.

Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Sequenz" die Option "Zeitraffer" unter "Scan-Einstellungen" auf "Halbbildverzögerung" auf 50 Millisekunden ein, um Bilder mit 20 Hertz aufzunehmen. Wählen Sie In temporärem Puffer speichern aus. Klicken Sie für die ratiometrische Kalziumbildgebung auf der Registerkarte Sequenz auf Start, um die Aufzeichnung zu starten und den Wurm mit dem Joystick zu verfolgen, wobei die Zellen und Synapsen des Interesses in der Mitte des Sichtfelds fokussiert bleiben.

In dem Moment, in dem die Fluoreszenzaufzeichnung gestartet wird, werden Trigger an die wartende Hellfeldkamera und den Stage-Controller gesendet, die mit der Erfassung synchronisierter Bilder und der Bühnenposition beginnen. Klicken Sie im Fenster "Histogramm" auf die Schaltfläche "Statistiken", um die Pixelstatistiken für jeden Kanal anzuzeigen. Passen Sie die LED-Leistung so an, dass eine maximale Einzelpixel-Fluoreszenz von mCherry am präsynaptischen Ende von mindestens 8.000 Zählungen im roten Kanal erreicht wird, was einen Dynamikbereich von etwa 12 Bit über dem Hintergrund ergibt.

Die Calcium-Reporter-Signale am präsynaptischen Terminus während des Ruhezustands oder eines niedrigen Kalziumspiegels sollten etwa 2.500 Zählungen im grünen Kanal betragen. Zeichnen Sie das Verhalten auf, bis ein aktiver Zustand der Eiablage erreicht ist. Speichern Sie dann eine 10-minütige Teilmenge mit 6.000 Frames vor und 6.001 Frames nach dem ersten Eiablageereignis.

Achten Sie darauf, dass die gleiche Teilmenge von Hellfeldbildern des Wurmverhaltens und der Zeitpunkte der X-Y-Tischposition beibehalten wird, da sonst die präzise Synchronisation der Datenströme verloren geht. Importieren Sie für die Bildsegmentierung die Bildsequenzen in ein geeignetes ratiometrisches Quantisierungssoftwareprogramm und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitreihe auf der Registerkarte "Sequenz", um die Zeitreihe auf 20 Bilder pro Sekunde und 1,25 Mikrometer pro Pixel einzustellen. Wählen Sie im Menü Extras die Option Verhältnis, wählen Sie dann mCherry für Kanal A und GCaMP5 für Kanal B aus und klicken Sie auf Berechnen, um den Hintergrund von jeder Bildsequenz zu subtrahieren.

Wählen Sie "Regenbogen-Lookup-Tabelle auf den Verhältniskanal anwenden" aus, und verwenden Sie den mCherry-Kanal, um einen intensitätsmodulierten Verhältniskanal zu generieren, um die Verhältnisfarbe auf die Helligkeit des mCherry-Kanals abzubilden. Klicken Sie auf Verhältnis, um die beiden Kanäle zu generieren. Um ein Objektsuchprotokoll zu erstellen, ziehen Sie das Werkzeug Objekte anhand der Intensität suchen unter der Registerkarte Messungen in den Protokollbereich und klicken Sie auf das Zahnrad, um das Fenster mit den mCherry-Intensitätswerten festzulegen und Objekte zu suchen.

Wählen Sie Intensitätswerte größer oder gleich zwei Standardabweichungen über dem Hintergrund und achten Sie darauf, dass der Zellkörper und der präsynaptische Endpunkt erkannt werden. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Filter hinzu, die auf den mCherry-Kanal abzielen, um unerwünschte Objekte wie Kopf, Schwanz oder Darmfloreszenz auszuschließen. Öffnen Sie dann das Menü "Messungen" und wählen Sie "Messelement erstellen" und wählen Sie "Alle Zeitpunkte" aus, um das Bildquantisierungsanalyseprotokoll auszuführen.

Die gleichzeitige Erfassung von GCaMP5- und mCherry-Fluoreszenzsignalen wird verwendet, um einen Pixel-für-Pixel-Verhältniskanal zu erzeugen, der Änderungen der Tierbewegung und des Fokus kompensiert. Für jedes Tier können Veränderungen des präsynaptischen intrazellulären HSN-Kalziums mit Verhaltensweisen korreliert werden, die in der Hellfeldbildgebung offensichtlich sind, einschließlich der Freisetzung von Eiern und Veränderungen der Fortbewegung. In der Tat können signifikante Unterschiede in der Wurmgeschwindigkeit vor, während und nach der Eiablage beobachtet werden.

Wenn man sich ein Eiablageereignis genauer ansieht, zeigt sich eine robuste Veränderung der GCaMP5-Blütenpracht vor dem Eiablageereignis. Während die mCherry-Blüte relativ unverändert bleibt. Darüber hinaus zeigen gemessene Veränderungen des GCaMP5:mCherry-Verhältnisses deutlich eine HSN-Kalziumtransiente etwa 4 Sekunden vor der Eifreisetzung.

Der Fortgang der Kontraktion der Vulvamuskulatur zeigt sich in einer deutlichen Verlangsamung der Fortbewegung des Wurms, die mit der Freisetzung der Eizellen endet. Darüber hinaus ermöglicht die Bildgebung und Verfolgung der Würmer, wie gerade demonstriert, die Visualisierung der räumlichen Organisation des Eiablageverhaltens von der Nahrungssuche, vorübergehenden HSM-Kalziumveränderungen und der HSN-Aktivität, die vor der Fortbewegung zum Eiablageort in ein Burst-Feuer übergeht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein oder zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich während der Bildgebungsschritte auf die interessierenden Zellen und ihre präsynaptischen Endverschlüsse zu konzentrieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die optogenetische Aktivierung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie das HSN auf präsynaptische Stimulation reagiert. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg geebnet, die Funktion des Eiablage-Schaltkreises bei C. elegans zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine ratiometrische Kalziumbildgebung von HSN bei aktiven Caenorhabditis elegans durchführt.