Name: Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie, wie ein genomweites RNAi-Screening Host-Faktoren identifiziert, die die onkolytische Virotherapie modulieren. Diese Methode ermöglicht eine umfassende und unvoreingenommene Analyse viraler Replikationsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institut für Krebsforschung, der Kanada-Stiftung für Innovation, die Ottawa Regional Cancer Foundation und der Terry Fox Research Institute unterstützt. K.J.A. wurde durch ein Vanier Canada Graduate Stipendium, ein Canadian Institute for Health Research-Master Award unterstützt und ein Ontario-Graduate-Stipendium.

<ol><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li>
<li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+genomic+screening%3A+elucidating+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li>
<li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).</li>
<li>Friedel, C. C., Haas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomes+and+global+models+of+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells.</a> Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).</li>
<li>Gao, S., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+RNA+interference+high-throughput+screening+technology+in+cancer+biology+and+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology.</a> Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).</li>
<li>Kilcher, S., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+approaches+to+study+virus+entry+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Next generation approaches to study virus entry and infection.</a> Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).</li>
<li>Ramage, H., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+From+unbiased+genetic+screens+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function.</a> Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).</li>
<li>Mercer, J., Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+reveals+proteasome-+and+Cullin3-dependent+stages+in+vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection.</a> Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).</li>
<li>Sivan, G., Martin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+role+for+nuclear+pore+proteins+in+poxvirus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).</li>
<li>Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loss+of+function+analysis+of+host+factors+Influencing+vaccinia+virus+replication+by+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98431(2014).</li>
<li>Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNA+interference+screen+for+human+cell+factors+affecting+myxoma+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication.</a> J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).</li>
<li>Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+lentiviral+shRNA+screen+identifies+serine%2Farginine-rich+splicing+factor+2+as+a+determinant+of+oncolytic+virus+activity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).</li>
<li>Panda, D., Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+reveals+requirement+for+host+cell+secretory+pathway+in+infection+by+diverse+families+of+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).</li>
<li>Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+small+interfering+RNA+screen+identifies+host+factors+required+for+vesicular+stomatitis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection.</a> J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).</li>
<li>Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-tumor+interactome+screen+reveals+ER+stress+response+can+reprogram+resistant+cancers+for+oncolytic+virus-triggered+Caspase-2+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death.</a> Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).</li>
<li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+to+arms%3A+Using+RNAi+screening+to+improve+oncolytic+viral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).</li>
<li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+screening+to+enhance+oncolytic+virotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy.</a> Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).</li>
<li>Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+to+enhance+oncolytic+virus+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncolytic+Virother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy.</a> Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2017%3A+quality-controlled+protein-protein+association+networks%2C+made+broadly+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).</li>
<li>Luc, P. -V., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINdb%3A+a+database+of+nuclear+protein+complexes+from+human+and+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast.</a> Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).</li>
<li>Chung, N., Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+absolute+deviation+to+improve+hit+selection+for+genome-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+Score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+Score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
<li>Zhang, X. D., Lacson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+SSMD-based+false+discovery+and+false+nondiscovery+rates+in+genome-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).</li>
<li>Amberkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNA+interference+screens+integrative+analysis%3A+towards+a+comprehensive+understanding+of+the+virus-host+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Virol%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay.</a> World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).</li>
<li>Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+reproducibility+between+genome-scale+siRNA-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).</li>
<li>Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+specific+edge+effect+correction+method+for+RNA+interference+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings.</a> Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).</li>
<li>Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+off-target+effects+can+be+reduced+at+concentrations+that+match+their+individual+potency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).</li>
<li>Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+detection+and+elimination+of+systematic+error+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening.</a> Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).</li>
<li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies%3A+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).</li>
<li>Savidis, G., McDougall, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Zika+virus+and+dengue+virus+dependency+factors+using+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics.</a> Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).</li>
<li>Ma, H., Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Based+screen+identifies+genes+essential+for+West-Nile-virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death.</a> Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).</li>
<li>Zhang, R., Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+screen+defines+a+signal+peptide+processing+pathway+required+by+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses.</a> Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).</li>
<li>Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Dies wurde erfolgreich getestet mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia Virus, aber wie bereits erwähnt, es angepasst werden kann für die Verwendung mit anderen onkolytische Viren oder andere Viren in der Regel um Host Gene zu identifizieren, die Replikation des Virus zu modulieren. Das Screening Protokoll soll auc...

Hochdurchsatz-genomweiten RNAi Screening erweist sich als ein wertvolles Instrument zur Aufdeckung biologischer Erkenntnisse in den verschiedensten Bereichen des Studiums einschließlich der Virus Biologie. In den vergangenen zehn Jahren haben sich zahlreiche Gruppen verpflichtet zellbasierte groß angelegte RNAi screening ausführlich Host Gene zu identifizieren, die Virusreplikation (bewertet in1,2,3,4 modulieren , 5 , 6 , 7). Interessanterweise wurden eine große Anzahl dieser Bildschirme in Krebszellen und mehrere mit Viren, die aktuellen onkolytische Viren einschließlich Vaccinia Virus8,9,10 kommen durchgeführt , Myxome Virus11, Herpes-Simplex-Virus12, vesikuläre Stomatitis Virus13,14und Maraba Virus15. Während die meisten dieser Studien auf Host Faktoren, die Einfluss auf einige Aspekte der Virusreplikation, zu bestimmen, und nicht auf die Identifizierung von biotherapeutischen Zielen für die Verbesserung der onkolytische Viren Therapie konzentrierte, konnte wertvolle Daten aus diesen Datensätzen in abgebaut werden diesem Zusammenhang. Es ist klar, dass das mächtige Potential Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern nicht voll ausgeschöpft worden.
Eine Fülle von onkolytische Viren Plattformen sind derzeit in präklinischen und klinischen Studien einschließlich Herpes simplex Virus, wirtseigenen und Vaccinia-Virus, die nachweisbaren Erfolge in klinischen Studien hatten getestet. Für die meisten dieser Plattformen haben Anstrengungen gerichtet in Richtung verändern das Virus-Genom, Therapie zu verbessern. Zum Beispiel um Tumor-Spezifität zu erhöhen, wurden bestimmte Viren Gene gelöscht oder mutiert zur Virusreplikation in normalen Zellen, aber nicht in Tumorzellen erheblich einschränken. In einigen Fällen transgene hinzugekommen wie GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor), die Immunantwort zu potenzieren oder NIS (Natrium-Iodid-Symporter) in Vivo Bildgebung und zelluläre Radioiodide Aufnahme aktivieren für therapeutische Zwecke verwendet werden. Allerdings gab es sehr wenig Arbeit konzentrierte sich auf Host/Tumor-Gene zu manipulieren und Untersuchung der Auswirkungen von Host/Tumor-Gene auf die onkolytische Viren Replikation. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Screening-Technologie, es ist nun möglich, Host-Virus Interaktionen im Maßstab des Genoms zu erforschen und zu entschlüsseln, Möglichkeiten zu manipulieren das Wirtsgenom um onkolytische Viren Therapie zu verbessern (überprüft in16, 17,18).
Wir berichteten das erste Studie zeigt Proof-of-Concept für die Verwendung von Hochdurchsatz-genetisches screening um Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden könnte, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Um Host Gene zu entdecken, die modulieren, Maraba Virus Oncolysis, ein onkolytische Rhabdovirus derzeit getestet in Phase I und II-Studien, haben wir durchgeführt genomweiten RNAi-Screens über drei verschiedene Tumorzelllinien in zweifacher Ausfertigung mit einem SiRNA (kurze RNA stören) Bibliothek für 18.120 Gene15. Pathway Analyse der Zugriffe auf den Bildschirmen identifiziert offenbart Bereicherung der Mitglieder des ER (endoplasmatische Retikulum) Stress Reaktion Wege. Wir haben 10 Treffer innerhalb dieser Wege für die sekundäre Validierung mithilfe SiRNA mit verschiedenen targeting Sequenzen von denen auf dem primären Bildschirm. Im Rahmen der tertiären Validierung, führten wir eine Rettungs-Experiment mit IRE1α (Inositol-erfordern Enzym 1 Alpha) zu bestätigen, dass der Hit war. In Vitro und in Vivo Tests mit einem niedermolekularer Inhibitor des IRE1α führte zu dramatisch verbesserte onkolytische Wirksamkeit.
Workenhe Et al. 12 auch durchgeführt einen genomweiten RNAi-Bildschirm mit einer gepoolten Lentivirale ShRNA (kurze Hairpin RNA) Bibliothek targeting 16.056 Gene Ermittlung Host Faktoren beschränken die menschliche Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) mutierte KM100-vermittelten Oncolysis Brust Krebszellen. In den Primärbildschirm identifiziert sie 343 Gene den Zuschlag führen zu verstärkten Zytotoxizität KM100-infizierten Zellen über Mock-infizierten Zellen; 24 dieser Gene für die sekundäre Validierung ausgewählt. Aus den 24 Gene wurden 8 Gene auf dem sekundären Bildschirm mit einem von ihnen bestätigt wird SRSF2 (Serin/Arginin-Rich Spleißen Faktor 2) anschließend mit einer genetischen Rettungs-Experiment während der tertiären Validierung bestätigt wurde. Die Gruppe fuhr fort, um einen DNA-Topoisomerase-Hemmer chemotherapeutischen zu identifizieren, der die Phosphorylierung des SRSF2 reduziert und zeigte, dass die Kombinationsbehandlung von HSV-1 KM100 mit dieser Hemmstoff führen zu längeren Überleben der TUBO Tumor-tragenden Mäusen.
In den genannten Studien folgte ein ähnlicher Workflow. Jeder begann mit einer genomweiten RNAi Primärbildschirm gefolgt von einem sekundären Bildschirm auf eine ausgewählte Anzahl von Treffern in den Primärbildschirm identifiziert. Dies wurde gefolgt von tertiären Validierungsstudien, die bestätigt, dass der Treffer auf Ziel war durch die Durchführung genetischer Experimente in Vitro mit ultimativen Validierung durchgeführt durch die Manipulation der Ziel-gen Produkt in Vivozu retten. In diesem Artikel bieten wir zunächst ein allgemeines Protokoll für die Entwicklung und Validierung eines Hochdurchsatz-SiRNA-Screening-Assays, die umfasst die Bestimmung der optimalen Transfektion Bedingungen, Höhe des Virus und die Länge der Infektion. Wir bieten auch einem detaillierten Protokoll für die Durchführung von einem primären, einem Hochdurchsatz-SiRNA-Bildschirm sowie eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierung.

<table><tbody><tr><td>ConsumablessiRNA-Bibliothek</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 384-Well-Platte</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars siRNA mit Negativkontrolle</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome siRNA-Pool #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HIGH Glukose</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Lösung (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100X-Lösung</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028,02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37 % Massenanteil)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Flaschen</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430282</tr><tr><td>selbstklebende Dichtungsfolie für Mikroplatten</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>abziehbare Heißsiegelfolie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select Spenderkassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalog Anzahl</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select (Flüssigkeitsspender)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120621</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Plattenleser</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera Bildgebungs- und Analysegerät</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>KiNEDx Robotic Arm</td><td>Peak Analysis and Automation (ehemals Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Cytomat 24C Series Automatisierter Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS Automated Workstation</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>Plattenkarussell</td><td>Peak Analysis and Automation (ehemals Peak Robotics)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alps 3000 Plattenversiegeler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

genomweiten rnai-screening, host faktoren zu identifizieren, die onkolytische viren therapie zu modulieren

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Hochdurchsatz-Screening-Technologie genomweiten RNAi (RNA-Interferenz) hat am meisten benutzt, für die Entdeckung von Host-Faktoren, die Replikation des Virus auswirken. Hier präsentieren wir die Anwendung dieser Technologie zur Aufdeckung Host-Ziele, die die Vermehrung des Virus Maraba, onkolytische Rhabdovirus und Vaccinia-Virus mit dem Ziel der Verbesserung der Therapie gezielt modulieren. Während das Protokoll für die Verwendung mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia-Virus getestet wurde, dieser Ansatz gilt für andere onkolytische Viren und kann auch zur Identifizierung von Host-Ziele, die Virusreplikation in Säugetierzellen in modulieren genutzt werden Allgemeine. Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines Assays für Hochdurchsatz-Screening der RNAi in Säugerzellen, wichtige Überlegungen und vorbereitende Schritte für die Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm und eine schrittweise Anleitung für wichtig Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm; Darüber hinaus beschreibt es im großen und ganzen die Methoden für die Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierungsstudien. Der Vorteil von Hochdurchsatz-RNAi-Screening ist, dass es erlaubt, in einer umfangreichen und unvoreingenommene Weise, Host Faktoren zu katalogisieren, die jeden Aspekt der Virusreplikation zu modulieren, wofür man einen in-vitro- Test wie Infektiosität, entwickeln kann, platzen Größe, und Zytotoxizität. Es hat die macht, unvorhergesehene biotherapeutischen Ziele basierend auf aktuellen Erkenntnissen zu entdecken.

Ein Überblick über den Workflow zur Identifizierung von Host-Ziele zur Verbesserung der onkolytische Viren Therapie ist in Abbildung 1dargestellt.
Wie in Abbildung 1dargestellt, ist der entscheidende erste Schritt die Durchführung eines Hochdurchsatz-RNAi Bildschirms Assay-Entwicklung. Abbildung 2A bietet eine Beispielanlage Platte für die ...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Wirtsziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Virustherapie zu verbessern. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der onkolytischen Virustherapie zu beantworten, z. B. welche spezifischen Wirtsfaktoren und zellulären Signalwege die onkolytische Virusreplikation modulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, Wirtsziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Virustherapie umfassend und unvoreingenommen zu verbessern.Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die Virusreplikation im Allgemeinen modulieren. Nachdem Sie einen Hochdurchsatz-Screening-Assay gemäß dem Textprotokoll entwickelt haben, nehmen Sie eine Charge von Mikrotiterplatten aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten lang auftauen. In der Zwischenzeit werden zwei Flaschen mit 70 % Ethanol gefüllt, dann zwei konische 50-ml-Röhrchen mit PBS und eines mit destilliertem Wasser gefüllt.Tauchen Sie den Flüssigkeitsspenderschlauch in eine Flasche mit 70 % Ethanol und legen Sie dann ein Stück Kreppband u

genome-wide-rnai-screening-to-identify-host-factors-that-modulate

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Novel Wirtsfaktoren in Virusinfektion beteiligt durch zell-basierte genomweite Verlust der Funktion RNAi-Screening identifiziert werden.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, Genom-weiten Sammlung von klonierten cDNA verwendet werden, um miRNA-Targets zu identifizieren. Hier zeigen wir, ihre Nutzung und Anwendung.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen, die auf Postintegrationsschritte des HIV-1-Replikationszyklus abzielen, werden beschrieben. Diese Methoden sind nützlich, um neue Moleküle zu screenen und das Format bestehender Moleküle zu optimieren.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Wir präsentieren ein Protokoll, um eine neuartige somatische Gentherapie-Transfer-System unter Verwendung RIP-Tag zu demonstrieren; RIP-tva Maus-Modell für die Funktion von Genen in Metastasen zu untersuchen. Die Vogelgrippe Retroviren liefern wir Intracardiacally um Gentransfer in Pre-maligne, nicht-invasive Läsionen des Pankreas β-Zellen bei Erwachsenen Mäusen zu gewährleisten.

Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Insertionsmutagenese ist ein wesentliches Werkzeug in der Vorwärtsgenetik zur Identifizierung funktioneller genomischer Elemente. Hier beschreiben wir den Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), eine Methode zum Nachweis von Lentivirus-Integrationsstellen innerhalb einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek.

Identifizierung funktionell relevanter Lentivirus-Integrationsstellen in einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek

Erfahren Sie, wie ein genomweites RNAi-Screening Host-Faktoren identifiziert, die die onkolytische Virotherapie modulieren. Diese Methode ermöglicht eine umfassende und unvoreingenommene Analyse viraler Replikationsmechanismen.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Weitere Videos entdecken