Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Wirtsziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Virustherapie zu verbessern. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der onkolytischen Virustherapie zu beantworten, z. B. welche spezifischen Wirtsfaktoren und zellulären Signalwege die onkolytische Virusreplikation modulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, Wirtsziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Virustherapie umfassend und unvoreingenommen zu verbessern.

Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die Virusreplikation im Allgemeinen modulieren. Nachdem Sie einen Hochdurchsatz-Screening-Assay gemäß dem Textprotokoll entwickelt haben, nehmen Sie eine Charge von Mikrotiterplatten aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten lang auftauen. In der Zwischenzeit werden zwei Flaschen mit 70 % Ethanol gefüllt, dann zwei konische 50-ml-Röhrchen mit PBS und eines mit destilliertem Wasser gefüllt.

Tauchen Sie den Flüssigkeitsspenderschlauch in eine Flasche mit 70 % Ethanol und legen Sie dann ein Stück Kreppband um den Schlauch, um den Punkt zu markieren, unterhalb dessen der Schlauch als steril angesehen werden kann. Verwenden Sie ca. 25 ml 70 % Ethanol, um den Schlauch zu grundieren. Gießen Sie zusätzliches Ethanol in die Flasche, um das verlorene Volumen zu ersetzen, und lassen Sie den Schlauch dann mindestens fünf Minuten lang in Ethanol ruhen.

Nach der Vorbereitung der Zellkulturhaube zentrifugieren Sie die versiegelten Platten und härten zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1026 mal G aus. Entfernen Sie anschließend die Dichtungen von den Platten. Pipettieren Sie dann die erforderliche Menge des Transfektionsreagenzes in die konischen Röhrchen, die das vorgewärmte Transfektionsreagenzverdünnungsmittel enthalten.

Beginnen Sie mit der Trypsinisierung der Zellen, indem Sie das Medium aus jeder Platte aspirieren. Verwenden Sie neun ml PBS, um die Zellen zu spülen, und pipettieren Sie dann drei ml Trypsin pro Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Minuten.

Verwenden Sie dann 22 ml Medium, um die Zellen zu resuspendieren, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Kombinieren Sie die Zellsuspension von jeder Gewebekulturplatte in eine sterile Flasche und mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie die Flasche umdrehen. Pipettieren Sie dann einen ml Aliquats in der Zellsuspension in zwei separate Mikrofuge-Röhrchen.

Entnehmen Sie die Probe aus jedem Mikrofugenröhrchen und zählen Sie die Zellen. Berechnen Sie dann das Volumen der Zellsuspension, das für die erforderliche Dichte erforderlich ist, und bereiten Sie genügend verdünnte Zellsuspension vor, um sie auf eine Charge von Platten zu verteilen. Während die Zellen vorbereitet werden, leeren Sie den Schlauch des Flüssigkeitsspenders mit Ethanol.

Verwenden Sie ca. 25 ml PBS, um den Schlauch zu entlüften, und leeren Sie dann den Schlauch. Stellen Sie sicher, dass der Teil des Schlauchs, der in das Transfektionsreagenz und später in die Zellsuspension getaucht wird, steril bleibt. Stellen Sie die Platten auseinander, die sicher mit einem konischen Röhrchen mit Transfektionsreagenzlösung hergestellt werden können.

Pipettieren Sie die Transfektionsreagenzlösungen 10 Mal auf und ab. Verwenden Sie dann die Lösung, um den Schlauch zu grundieren, bevor Sie 5 Mikroliter pro Vertiefung abgeben. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1026 mal G bei Raumtemperatur für eine Minute.

Inkubieren Sie die Platten dann bei Raumtemperatur für die Zeit, die für das verwendete Transfektionsreagenz vorgeschrieben ist. Entleeren Sie während der Inkubation den Schlauch von der Transfektionsreagenzlösung und geben Sie sie in ein vollständiges konisches 50-ml-Röhrchen, das PBS enthält. Verwenden Sie dann ca. 25 ml PBS, um den Schlauch zu spülen, indem Sie ihn grundieren und dann entleeren.

Mischen Sie die Flasche mit der Zellsuspension, legen Sie dann den Schlauch in die Suspension und grundieren Sie den Schlauch so weit, dass jede Spitze richtig abgegeben wird. Geben Sie 30 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung auf alle Platten. Entleeren Sie die Zellsuspension aus dem Schlauch und spülen Sie den Schlauch mit ca. 25 ml PBS, gefolgt von ca. 50 mL destilliertem Wasser.

Lassen Sie die Platten ab dem Zeitpunkt der Zellaussaat 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Inkubieren Sie dann die Platten in einem ungestörten Inkubator für die gewünschte Dauer des Gen-Silencings. Um Zeit zu sparen, pipettieren Sie am Tag vor der Infektion der Zellen genau die Menge an Medium, die zur Infektion jeder Charge von Platten erforderlich ist, in sterile Flaschen, einschließlich des Mediums für nicht infizierte Vertiefungen.

Erwärmen Sie das Medium auf 37 Grad Celsius und füllen Sie dann zwei Flaschen mit 70 % Ethanol, zwei konische 50-ml-Röhrchen mit PBS und eine mit destilliertem Wasser. Sterilisieren Sie den Schlauch mit 70 % Ethanol, wie bereits gezeigt. Während der Schlauch im Ethanol sitzt, wirbeln Sie zuerst das Virus vor und pipettieren Sie dann genau die benötigte Virusmenge in die Flasche mit dem Infektionsmedium.

Spülen Sie dann den Schlauch mit 25 ml PBS zur Grundierung und leeren Sie ihn dann. Nachdem Sie die Platten aus dem Inkubator genommen haben, legen Sie sie in die Gewebekulturhaube. Verwenden Sie Medium, um den Schlauch zu grundieren, und geben Sie dann 40 Mikroliter Medium in die nicht infizierten Kontrollvertiefungen.

Leeren Sie den Schlauch von Medium und verwenden Sie 25 ml PBS, um ihn zu spülen. Nachdem Sie das Virus gemischt haben, legen Sie den Schlauch in die Flasche mit dem Virus und geben Sie 40 Mikroliter Virus über die Platten. Die Platten bei 400 mal G bei Raumtemperatur 30 Minuten zentrifugieren.

Inkubieren Sie die Platten für die zuvor festgelegte Zeitspanne. Bereiten Sie am Tag vor der Fixierung eine Flasche Fixier- und Standlösung mit vier Prozent Formaldehyd und PBS für jede Charge von Platten vor, aber lassen Sie den Hoechst-Fleck weg. Bewahren Sie die Lösung im lichtgeschützten Schrank auf.

Verwenden Sie am nächsten Tag 70 % Ethanol und PBS, um den Schlauch zu spülen, wie bereits gezeigt. Geben Sie 30 Mikroliter der Lösung auf alle Platten und legen Sie die Platten dann für 30 Minuten in den Inkubator. Nach der Inkubation bringen Sie die Dichtungen auf den Platten an und lagern sie bei vier Grad Celsius lichtgeschützt.

Führen Sie Bildgebung und Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. Hier sind 786 O-Zellen zu sehen, die nach einer 72-stündigen Inkubation mit dem Transfektionsreagenz allein mit Hoechst 33342 gefärbt wurden. Transfektionsreagenz und Verdünnungsmittel, siRNA ohne Targeting und mit siRNA, die auf PLK1 abzielt.

Das hier gezeigte Überlebensdiagramm zeigt, dass 22 % der Zellen, die mit PLK1-siRNA transfiziert wurden, überlebten, und 94 % der Zellen, die mit nicht-zielgerichteter siRNA transfiziert wurden. Diese Grafik zeigt die Ergebnisse des Live-Zeitverlaufs von 786 O-Zellen, die mit onkolytischen Vaccinia-Viren infiziert waren und eine erhöhte GFP an verschiedenen MOIs exprimierten. Repräsentative Bilder von Zellen, die bei einem MOI von 0,05 über einen Live-Zeitverlauf infiziert wurden, sind hier zu sehen.

Eine Inkubationszeit von 21 Stunden würde es ermöglichen, Zu- und Abnahmen der Ausbreitung zu erkennen, da der Zeitpunkt innerhalb eines linearen Bereichs liegt. Nach genomweiten RNAi-Screenings über drei Tumorzelllinien hinweg wurden mit der MAD-Methode 1008 Treffer identifiziert, die mindestens zwei von drei Krebszelllinien gemeinsam sind. 10 Treffer innerhalb des UPR- und ERAD-Signalwegs wurden für die sekundäre Validierung mittels siRNA mit unterschiedlichen Targeting-Sequenzen ausgewählt.

Beim Dispensieren von Reagenzien ist es wichtig, dass Sie die richtige Charge von Platten haben, das richtige Volumen für die Abgabe ausgewählt haben und dass der Schlauch mit dem richtigen Reagenz gefüllt wurde und immer vollständig in das Reagenz eingetaucht ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein RNAi-Screening mit hohem Durchsatz durchführen, um Wirtsziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Virustherapie zu verbessern, oder um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die Virusreplikation im Allgemeinen modulieren.