Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Herstellung und potenziellen Anwendungen optimierter, integrase-defizienter lentiviraler Vektoren zu beschreiben, die in der Lage sind, CRISPR/Cas9-Transgene in vivo und in vitro in Zellen zu übertragen, um eine schnelle und effiziente Genomeditierung zu ermöglichen. CRISPR/Cas stellt eine äußerst effiziente Plattform für die Genomeditierung und -manipulation dar. Im Folgenden wird ein Protokollablauf zur Herstellung hochkonzentrierter, optimierter, integrase-defizienter lentiviraler Vektoren zur effizienten Übertragung von CRISPR/Cas-Genomeditierungswerkzeugen vorgestellt.

Die Technik hat sich in kultivierten Zellen und postmitotischen Neuronen als sehr effizient erwiesen. Säen Sie die HEK-293T-Zellen einen Tag vor der Transfektion aus, sodass die Konfluenz am nächsten Tag zwischen 70 und 80 % liegt. Aspirieren Sie vor der Transfektion das alte Medium von den Kulturschalen und geben Sie frisch zubereitetes, serumfreies Medium hinzu.

In einem 15-Milliliter-Konischgefäß alle vier Plasmide hinzufügen, um ein Plasmidgemisch zur Transfektion einer 15-Zentimeter-Schale vorzubereiten. Anschließend 312,5 Mikroliter einer einmolarigen Calciumchloridlösung zum Plasmidgemisch geben und das Volumen mit steriler, doppelt destillierter Wasser auf 1,25 Milliliter auffüllen. Unter ständigem Vortexen nach und nach Tropfen einer 2X BES-pufferierten Lösung hinzufügen.

Anschießend die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2,5 Milliliter der Plasmidmischung tropfenweise zu jeder der 15-Zentimeter-Platten hinzufügen. Dann die Platten vorsichtig schwenken und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für zwei bis drei Stunden inkubieren.

Nach drei Stunden 2,5 Milliliter 10 % Serum zu jeder Platte hinzufügen und die Übernacht-Inkubation fortsetzen. Mit einer 10-Milliliter-Zellkulturpipette vorsichtig den Überstand von den transfizierten Zellen, die auf jeder Kulturschale ausgesät wurden, abpipettieren. Anschließend den gesamten Überstand in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen sammeln.

Stellen Sie das Röhrchen in eine Tischzentrifuge und beginnen Sie die Zentrifugation. Danach filtrieren Sie das Überstand durch eine Vakuumfiltereinheit mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometern. Füllen Sie die kegelförmigen Ultrazentrifugenröhrchen mit unterschiedlichen Saccharosekonzentrationen, um Schichten mit einem Saccharosegradienten zu bilden.

Fügen Sie das Virus enthaltende Überstandsmaterial vorsichtig der Saccharose-Dichte-Gradientenlösung hinzu. Um das gesamte 100-Milliliter-Volumen des viralen Überstandes aufzuarbeiten, verwenden Sie sechs Ultrazentrifugenröhrchen pro Zentrifugationsdurchgang. Danach balancieren Sie die Ultrazentrifugenröhrchen mit 1X PBS-Puffer aus und zentrifugieren die Proben bei 70.000 g zwei Stunden lang bei 17 Grad Celsius.

In saubere Röhrchen sammeln Sie die 30 % und 60 % Saccharose-Fraktionen und geben kalte 1X PBS-Pufferlösung hinzu, um das Volumen auf 100 Milliliter einzustellen. Mischen Sie die Proben durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie anschließend 20 bis 25 Milliliter der viralen Lösung auf vier Milliliter 20 % Saccharose in 1X PBS-Lösung, um das Saccharose-Kissen herzustellen.

Pipettieren Sie steriles 1X PBS-Puffer nach, falls die Röhrchen weniger als zu drei Vierteln gefüllt sind, und bringen Sie sie ins Gleichgewicht. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend zwei Stunden lang bei 17 Grad Celsius. Gießen Sie danach das Überstandsvolumen ab und lassen Sie die restliche Flüssigkeit abtropfen, indem Sie die Röhrchen auf Papiertüchern umgedreht abstellen.

Nachdem die letzten verbleibenden Tröpfchen abgesaugt wurden, ist ein Pellet, das das Virus enthält, gerade noch als durchscheinender Fleck sichtbar. Resuspendieren Sie das Pellet anschließend in 70 Mikrolitern 1X PBS, indem Sie die Suspension gründlich auf- und abpipettieren. Überführen Sie die Suspension danach in ein anderes Röhrchen und mischen Sie sie gründlich, um das Pellet vollständig aufzulösen.

Anschließend das Gefäß mit weiteren 50 Mikrolitern kalter 1×-PBS-Pufferlösung spülen und mischen. Die Proben auf einer Tischmikrozentrifuge belassen und bei 10.000 × g für 30 Sekunden zentrifugieren. Nach der Zentrifugation 10-Mikroliter-Aliquote des Überstandes in jeweils neue Mikrogefäße geben und bei −80 °C lagern.

Coaten Sie eine Hochbindungs-96-Well-Platte mit 100 Mikroliter monoklonalem Anti-p24-Antikörper in einer Verdünnung von 1:1.500 gemäß dem NIH AIDS-Impfstoffprogramm für das HIV-1 p24-Antigen-Capture-Assay-Kit. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Platte dreimal mit jeweils 200 Mikroliter 0,05 %igem TWEEN-20 in kaltem PBS.

Um unspezifische Bindungen zu vermeiden, blockieren Sie die Platte mit 200 µL 1 % Rinderserumalbumin eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Platte dreimal mit jeweils 200 µL 0,05 % TWEEN-20 in kaltem PBS. Danach stellen Sie die konzentrierten und nicht konzentrierten Vektorproben durch Verdünnung des Vektors mit zweifach destilliertem Wasser und Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 10 % her.

Bereiten Sie anschließend die HIV-1-Standards durch zweifache serielle Verdünnung beginnend bei fünf Nanogramm pro Milliliter vor. Nachdem die konzentrierten und nicht konzentrierten Vektorproben verdünnt wurden, pipettieren Sie diese tripelweise auf die Platte und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Platte, geben danach je 100 Mikroliter polyklonaler Kaninchen-Anti-p24-Antikörper auf jede Platte und inkubieren vier Stunden bei 37 Grad Celsius.

Nach sechs Waschungen die Platte mit einem mit Peroxidase aus Pferderadish konjugierten Ziegen-Anti-Kanin-Antikörper bei 37 Grad Celsius eine Stunde lang inkubieren. Nach mehrfachem Waschen die Platte mit TMB-Peroxidase-Substrat bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubieren. Eine normale Salzsäure hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Und die Extinktion bei 450 Nanometern mit einem Extinktionsplattenreader messen.

Säen Sie die Zellen in einer Sechswellplatte aus. Am nächsten Tag, wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, infizieren Sie sie mit gereinigtem Virus bei einer vorbestimmten Multiplizität der Infektion im Bereich von eins bis 10.

Anschießend inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Überwachen Sie die Platten, um in regelmäßigen Abständen über einen Zeitraum von ein bis sieben Tagen Unterschiede in den GFP-Signalen zu dokumentieren. Suchen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem GFP-Filterset mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von jeweils 470 und 525 Nanometern ausgestattet ist, nach GFP-positiven Zellen.

Um zwischen der Population von GFP-positiven und negativen Zellen zu unterscheiden, verwenden Sie nicht-transduzierte Zellen. Ein repräsentativer Agarosegel, der den positiven, mutierten Integrations-Klon zeigt. Der doppelt geschnittene Klon mit den Restriktionsenzymen EcoRV und SPH1 im rot gestrichelten Kasten stellt den mutierten Integrations-Klon dar.

Der Klon wurde weiter sequenziert, um die Mutation der Asparaginsäure an Position 64 zu Glutaminsäure zu überprüfen. Ein repräsentatives Balkendiagramm für den p24-ELISA-Assay wurde gezeigt, das die viralen Titer für den SP1-Integrase-defizienten lentiviralen Vektor CRISPR/Cas9, dargestellt im schwarzen Balken, und die SP1-Integrationskompetenten lentiviralen Vektoren CRISPR/Cas9, dargestellt im weißen Balken, abbildet. Das Balkendiagramm zeigt die viralen Titer von integrasedefizienten und -kompetenten Viren im Bereich von eins mal zehn hoch. Die Balkendiagramme stellen die Kopienzahl der Viruspartikel pro Milliliter dar.

Vertretende fluoreszierende Bilder, die die mittlere Fluoreszenzintensität von GFP-positiven Zellen unter viraler Behandlung zeigen. Die Zellen wurden mit integrationsfähigen lentiviralen Vektoren CRISPR oder mit integrase-defizienten lentiviralen Vektor CRISPR-Viruskomponenten transduziert.

Eine starke Abnahme des GFP-Signals wurde bei einer Multiplizität der Infektion von eins bzw. fünf nach der Transduktion der integrasekompetenten oder -defizienten lentiviralen Komponenten im Vergleich zu den nicht-transduzierten Kontrollzellen beobachtet. Der Hauptvorteil dieser Technik ergibt sich aus der Fähigkeit integrasedefizienter lentiviraler Vektoren, ein Genom-Editier-Werkzeug vorübergehend zu übertragen, was dessen Spezifität und Sicherheit erheblich verbessert. Bei korrekter Durchführung sollten die Protokolle eine Woche zur Fertigstellung benötigen.

Bei Durchführung dieses Protokolls sollte man erwarten, hochkonzentrierte lentivirale Vektoren im Bereich von 10 hoch 9 bis 10 hoch 10 virale Genome pro mL zu erzeugen.