Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Das übergeordnete Ziel dieses Aggregationsassays ist es, die Bindung des Notch-Rezeptors an trans-Liganden und seine Hemmung durch cis-Liganden zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage zu beantworten: Wie beeinflusst ein genetischer oder pharmakologischer Faktor die Bindung des Notch-Rezeptors an seinen Liganden und verändert die Signalübertragung? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die trans- und cis-Bindung des Notch-Rezeptors mit seinem Liganden zu bewerten.

Interessanterweise, ohne den überlappenden Effekt des endogenen Liganden einzubeziehen. Beginnen Sie die Bewertung, indem Sie die Signalempfangszellen herunterdrehen und in Schneiders Medium resuspendieren. Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämazytometer.

Platte fünfmal 10 bis zur fünften S2 und stabile S2-Notch-Zellen in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, in einem Milliliter pro Vertiefung Schneider's Medium. Geben Sie anschließend 7,5 Mikrogramm doppelsträngige RNA in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Fügen Sie 0,7 Millimolar Kupfersulfat hinzu, um die Expression von Notch zu induzieren, und inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 25 Grad Celsius.

Zählen Sie nach der Inkubation die signalsendenden Zellen manuell mit einem Hämazytometer. Und platte fünfmal 10 bis die sechste stabile Zellen in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, in einem Milliliter pro Vertiefung ergänztem Schneider's Medium. Fügen Sie dann 0,7 Millimolar Kupfersulfat hinzu, um die Expression von Liganden zu induzieren, und inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei 25 Grad Celsius.

Ernten Sie die doppelsträngigen RNA-behandelten S2-Kontroll- und S2-Notch-Zellen durch schonendes Pipettieren. Und plättieren Sie 2,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte. Geben Sie fünfmal 10 zu den fünften stabilen S2-Delta- oder S2-Serat-Tomatenzellen zu einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern supplementiertem Schneider's Medium.

Stellen Sie die Platte bei 150 U/min auf einen Orbitalschüttler. Mischen Sie nach einer Minute den Inhalt jeder Vertiefung und nehmen Sie 20 Mikroliter heraus, um die Anzahl der Aggregate zu zählen. Nehmen Sie gleichzeitig ein repräsentatives Bild unter einem inversen Verbundmikroskop mit 10-facher Vergrößerung auf.

Um die Zellen zu visualisieren, stellen Sie die Kamera auf das Mikroskop ein und stellen Sie eine Verbindung mit der Software her, um das Bild aufzunehmen. Zählen Sie die Aggregate manuell mit einem Hämazytometer. Stellen Sie die Platte auf den Shaker.

Wiederholen Sie die Bildaufnahme und das Zählen nach fünf Minuten und 15 Minuten Aggregation. Führen Sie eine Trans-Bindungsquantifizierung durch, indem Sie die Anzahl der Aggregate pro Milliliter zwischen S2-Zellen und S2-Delta- oder S2-Serat-Tomatenzellen als Hintergrundkontrolle und die Anzahl der Aggregate pro Milliliter zwischen S2-Notch- und S2-Delta- oder S2-Serrat-Tomatenzellen berechnen. Bereiten Sie die signalempfangenden Zellen vor, indem Sie fünfmal 10 bis fünfte S2-Zellen in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte in einem Milliliter pro Vertiefung mit supplementiertem Schneider's Medium plattieren.

Geben Sie 7,5 Mikrogramm doppelsträngige RNA in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Nach der Inkubation cotransfizieren Sie die doppelsträngigen RNA-behandelten Zellen für eine Gesamt-DNA-Konzentration von zwei Mikrogramm pro Vertiefung unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagenzes. Inkubieren Sie die transient transfizierten S2-Zellen 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius.

Am nächsten Tag fügen Sie 0,7 millimolare Kupfersulfate hinzu, um die Expression von Notch und den Liganden zu induzieren, und inkubieren Sie drei Tage lang bei 25 Grad Celsius. Bereiten Sie signalsendende Zellen vor, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Führen Sie schließlich die Aggregation zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen durch, wie zuvor beschrieben.

Ein starker Anstieg der Anzahl der Aggregate wurde zwischen einer und fünf Minuten beobachtet. Dann stieg die Anzahl der Aggregate bis zu 30 Minuten weiter an, und zwar langsamer. Bilder, die die Aggregation zu drei Zeitpunkten zeigen, zeigen, dass die EGFP-doppelsträngigen RNA-behandelten S2-Notch-Zellen Aggregate mit S2-Delta-Zellen bildeten, deren Anzahl mit der Zeit zunimmt.

Im Gegensatz dazu bildeten Shams und doppelsträngige RNA-behandelte S2-Notch-Zellen schneller Aggregate, und die Aggregate waren immer größer in der Anzahl. Dies deutet darauf hin, dass abnehmende Scheinspiegel die Trans-Bindung von Notch mit Delta verstärkten. Die Transfektion gleicher Mengen an Notch- und Delta-Expressionskonstrukten in S2-Zellen verringert die Anzahl der zwischen diesen Zellen und S2-Delta-Zellen gebildeten Aggregate drastisch.

Darüber hinaus führt eine Verringerung der Menge an cis-Delta zu einer Erhöhung der Anzahl der Aggregate. Dies deutet darauf hin, dass cis-Delta in dem Bereich der in diesen Assays verwendeten Notch/cis-Delta-Verhältnisse die Bindung zwischen Notch und trans-Delta dosisabhängig hemmen kann. Die Quantifizierung der relativen Aggregation zeigte eine vergleichbare Hemmung der Aggregation unter EGFP und Scheinbehandlung mit doppelsträngiger RNA.

Sobald alle Reagenzien vorbereitet sind, ist dieser Assay unkompliziert und kann in wenigen Stunden durchgeführt werden.