Name: Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen, Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität zu aktivieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Lernen Sie die Methode zur Aktivierung von Makrophagen mit cAMP in Neuron-Makrophagen-Ko-Kulturen. Diese Technik fördert die Sekretion von Faktoren, die das Neuritenwachstum in DRG-Neuronen stimulieren und Einblicke in regenerative Prozesse ermöglichen.

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Dieses Protokoll wird unterstützt durch einen Zuschuss NRF-2015R1A2A1A01003410 vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen, Republik Korea.

Alle Experimente mit Tieren stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Ajou University School of Medicine.
(1) Kultur Vorbereitung der dissoziierten Erwachsenen DRG Neuron
<ol><li>Vor dem Einrichten der Kulturkreis, Pre-Mantel eine 6-Well-Platte mit Poly-D-Lysin und Laminin. Über Nacht inkubieren Sie eine 6-Well-Platte mit 0,01 % Poly-D-Lysin bei 37° C für 2 h oder bei 4° C. Waschen Sie die Platte zweimal mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte mit Laminin-Lösung mit einer Konzentration von 3 µg/mL für 2 h bei Raumtemperatur, und dann waschen Sie die Platte zweimal mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Platte bei Raumtemperatur mindestens 1 h.</li>
	<li>Einschläfern Sie eine Maus in einer transparenten CO2 Kammer an einer komprimierten CO2 Gasflasche angeschlossen. Einzuschneiden Sie die Haut über der Wirbelsäule mit einer chirurgischen Klinge und sezieren Sie die paravertebralen Muskeln auf bilateraler Ebene um die vertebralen Knochen freizulegen. Entfernen Sie die vertebralen Knochen sorgfältig mit einer schmalen Spitze chirurgische Rongeur, bis der DRGs voll ausgesetzt sind. Hinweis: Erwachsene DRGs Neuronen stammen von erwachsenen männlichen Mäusen, die C57BL6 im Alter von 8 Wochen, 12 Wochen alt.</li>
	<li>Entfernen Sie die DRGs bilateral von S1 bis hin zu dem Niveau C1 mit Iridektomie Schere und feine Spitzen Pinzette unter dem sezierenden Mikroskop. Versuchen Sie, die Wurzeln vollständig von DRGs ausgeschnitten, um die Kontamination von Schwann-Zellen oder Fibroblasten zu minimieren.</li>
	<li>Speichern Sie seziert DRGs in einer 60 mm Petrischale mit 5 mL der kalten Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) auf Eis bis alle der DRGs gesammelt werden. Hinweis: Es ist wichtig, so schnell wie möglich die DRGs zu zergliedern. Die Sammlung von allen DRGs von einer Maus sollte nicht länger als 30 min. 30 min. nach der Euthanasie, sammeln der DRGs zu stoppen und mit dem nächsten Schritt fortfahren, selbst wenn gibt es nach wie vor DRGs noch.</li>
	<li>Der DRGs auf eine 1, 5 mL Eppendorf-Röhrchen mit einem blauen Pipettenspitze (1000 µL) mit einem Cut-Off Ende übertragen. Entfernen Sie die DMEM, nach einer schnellen Runde für einige Sekunden mit einer Mini-Zentrifuge. Fügen Sie 1 mL DMEM mit 125 U/mL Typ XI Kollagenase und inkubieren Sie das Rohr für 90 min mit einer leichten Drehung (35-40 u/min) mit einem Twister Shaker in einem Inkubator 37 ° C. Das Rohr auf dem Shaker-Boden mit Klebeband zu immobilisieren.</li>
	<li>Verwerfen Sie Kollagenase-haltigen DMEM zu und 1 mL frische DMEM. Warten Sie, bis die schwimmenden DRGs komplett nach unten auf den Boden sinken, und entfernen Sie dann die DMEM mit den Trümmern der Gewebe. Wiederholen Sie dies waschen mindestens sechsmal. Hinweis: Versuchen Sie nicht, den Überstand vollständig zu verwerfen. Achten Sie darauf, dass Sie keine DRGs mit Überstand DMEM entfernen.</li>
	<li>Der DRGs auf eine 15 mL konische Rohr mit einem blauen Pipettenspitze (1000 µL) mit einem Cut-Off Ende übertragen. Dann pipette vorsichtig nach oben und unten mindestens 15 Mal mit einer blauen Spitze (1000 µL) zu einem homogenen Zellsuspension. Verhindern Sie, dass Luftblasen und nicht versuchen Sie, den Boden der konische Rohr mit einer Pipettenspitze berühren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 239 X g für 3 min und entsorgen Sie sorgfältig des Überstands mit Treibgut. Fügen Sie 1 mL Neurobasal Medium ergänzt mit B27 (2,0 % V/V) und Aufschwemmen der Zelle Pellet durch sanft auf und ab 5 bis 10 Mal pipettieren.</li>
	<li>Ein 70 µm Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr überlagert durchlaufen Sie die Zellsuspension. 2 min warten Sie, und gießen Sie dann Neurobasal/B-27 Medium auf das Sieb mit einer Pipette-Controller.</li>
	<li>Alle gesammelten DRG Neuronen (insgesamt ca. 2 x 106 DRG Neuronen aus einer Maus) auf zwei Brunnen von 6-Well-Platte-Platte. DRG-Neuronen aus einer erwachsenen Maus umfassen zwei Brunnen in einem 6-Well-Platte. Dann legen Sie die Platte in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C, bis die Makrophagen Co Kulturen.</li>
</ol>(2) Kokultur P rimary peritonealen Makrophagen auf A Zelle Kultur einfügen
Hinweis: Gründen Sie der Ko-Kulturen 4 h nach der ersten Beschichtung von dissoziierten DRG-Neuronen
<ol><li>Primären peritoneale Makrophagen bereiten wir von erwachsenen männlichen Mäusen, die C57BL6 im Alter von 8 Wochen, 12 Wochen alt. Einschläfern eines Tieres in einer CO-2 -Kammer. Einzuschneiden Sie die Bauchhaut zart, setzen Sie das Peritoneum und vermeiden Sie, schneiden das Bauchfell um ein Austreten von Lavage-Flüssigkeit zu verhindern.</li>
	<li>Punktieren Sie das Bauchfell mit einer Spritze mit einer 22G Nadel und Spritzen Sie 10 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Salin (PBS) in der Bauchhöhle. Massieren Sie das Peritoneum für 1-2 min. Dann, Nadel herausziehen und squeeze-out der PBS durch die Nadel Punktionsstelle und sammeln die Lavage-Flüssigkeit in einem 50 mL konische Röhrchen. Hinweis: Vor dem Gebrauch die Spritze auf Eis die Kälte des öffentlich-rechtlichen Rundfunks zu gelegt.</li>
	<li>Zentrifugieren der Lavage-Flüssigkeit bei 239 X g für 10 min bei 4 ° C zu die zellulären Komponenten Pellets. Aufschwemmen der Pellet mit 3 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Buffer für 3 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wieder bei 239 X g für 10 min bei 4 ° C. Das Pellet mit 3 mL PBS Aufschwemmen und Zentrifugieren der Zellsuspension erneut, um alle verbleibenden RBC Lyse Puffer zu entfernen. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die RBC-Lyse-Puffer vollständig entfernt wird. Sonst möglicherweise verbleibenden RBC Lyse Puffer für den kultivierten Makrophagen toxisch.</li>
	<li>Die gebeizte Zellen in 1 mL Neurobasal/B-27 Medium aufzuwirbeln. Platte die Hälfte aller gesammelten Makrophagen (insgesamt 3 × 106 bis 6 x 106 Zellen) auf einer Zellkultur mit der Nutzfläche von 4,2 cm2, einfügen, die auf den Brunnen der dissoziierten DRG platziert wird. Hinweis: Zur Zeit der Kokultur Makrophagen im Neurobasal/B-27 Neuron Kulturmedium angebaut. Angemessene Überleben von Makrophagen unter dieser Bedingung wurde bestätigt.</li>
</ol>3. Behandlung von Db-Camp und Sammlung von Makrophagen CM
Hinweis: Starten Sie Db-cAMP Behandlung 4 h nach der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen.
<ol><li>Der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen 2 µL 100 µM-Db-Lager-Lösung hinzufügen. Fügen Sie die gleiche Menge an PBS für ein Kontrollexperiment.</li>
	<li>Füllen Sie nach 24 Stunden einen leeren Brunnen mit 1 mL Kulturmedium Makrophagen in den gleichen 6-Well-Platte. Übertragen Sie die Zelle-Kultur-Einlage in der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen auf den leeren Brunnen mit Makrophagen Nährmedium. Halten Sie die Zellen unter der gleichen Bedingung für 72 h ohne Ändern des Mediums. Hinweis: Wir fügen Sie nur 1 mL der Makrophagen Kulturmedium während CM Sammlung zu CM konzentriert. Während der CM-Auflistung hinzugefügt, falls erforderlich wir mehr um die Makrophagen innerhalb der Einsatz vollständig zu bedecken.</li>
	<li>Nach 72 h Zentrifugieren der Makrophagen CM 239 X g für 5 min um den zellulären Komponenten zu entfernen. Durchlaufen Sie den Überstand einen 0,2 µm-Filter, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Speichern Sie die gesammelten CM bei-70 ° C bis zur Verwendung.</li>
</ol>(4) Neurit Auswuchs Assay mit gesammelten CM
<ol><li>Vor dem Einrichten einer separaten Erwachsenen DRG Neuron Kultur, Pre-Mantel eine 8-Well-Kammer-Folie nach dem gleichen Verfahren in 1.1 und 1.2 beschrieben.</li>
	<li>Erhalten dissoziierte Erwachsenen DRG-Neuronen im Neurobasal Medium mit B27 ergänzt mit den gleichen Methoden von 1,3 auf 1.10 beschrieben. Platte 5 x 10-4 -Zellen pro Bohrloch auf der Folie vorbeschichtete 8-Well-Kammer.</li>
	<li>Legen Sie die Kammer-Folie in einem 37 ° C Inkubator für 2 h, so dass die Zellen an der Unterseite befestigen. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit dem aufgetauten CM, die bei 37 ° c vorgewärmt Hinweis: Achten Sie darauf, die unten auf der Folie 8-Well-Kammer zu berühren, wenn das Kulturmedium entfernen und Hinzufügen der gesammelten CM.</li>
	<li>15 h nach der ersten Beschichtung, entfernen Sie das Medium und einmal die Zellen mit PBS waschen. Fügen Sie dann 200 µL des eiskalten 4 % Paraformaldehyd Lösung in die Vertiefungen, und die Zellen mit der Paraformaldehyd-Lösung für 20 min bei 4 ° C inkubieren Hinweis: Die DRG-Neuron-Kultur für Neuriten Auswuchs Assay sollte genau auf 15 h beschränkt. Unter dieser Bedingung gibt es keine nennenswerten Neuriten Auswuchs.</li>
	<li>Dreimal mit eiskaltem PBS waschen und führen Sie dann die Sperrung mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) mit 0,1 % Triton-X für 30 min. inkubieren der fixen Zellen mit primären Antikörper (Anti-Tuj-1) Lösung verdünnt mit 10 % NGS (in einer Konzentration von 1 µg/mL) für 4 h am Zimmer Temperatur oder über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Dreimal mit PBS waschen, und dann die Zellen mit Sekundärantikörper (Ziege-Anti-Maus) Lösung für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann zweimal mit PBS waschen Sie und montieren Sie die Kultur-Folie mit einem Deckgläschen (24 × 50 mm) mit Montage-Lösung.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop Neuriten Auswuchs zu visualisieren.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Erzeugung von diesem Kokulturen-System. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Maus DRG-Neuronen und peritonealen Makrophagen werden frisch zubereitet und gesund. Verminderte Neuriten Auswuchs Aktivität des CM haben wir erlebt, als das Sezieren von der DRGs mehr als 30 min nahmen. Darüber hinaus führte die Kontamination von Blutbestandteilen in peritonealen Makrophagen auch zu einem Rückgang der Neurit Auswuchs Aktivität der CM. Um robuste Neuron-Makrophagen Interaktion von Db-cAMP...

Eine Vielzahl von Studien haben versucht, CNS Axon Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks oder des Gehirns zu verbessern. Entzündliche Reaktionen, zwangsläufig begleitenden Verletzungen des Nervensystems sind traditionell dachte, zur Teilnahme an sekundären pathologischer Prozessen führt zu den schädlichen Ergebnisse1,2. Methylprednisolon, die Entzündungsreaktionen zu unterdrücken, kann nämlich die einzige zugelassene Therapie für akute Rückenmark Verletzungen3. Jedoch haben neuere Studien nachgewiesen, dass Makrophagen, einem repräsentativen entzündliche Zelltyp in der Regeneration oder Reparatur des verletzten Nervensystem4,5,6teilnehmen können. Z. B. infiltrieren Makrophagen nach einem Objektiv Verletzungen produzieren Pro-regenerative Moleküle zu fördern die Regeneration der retinalen Ganglienzellen Neuronen7,8. Darüber hinaus erhöht die transplantierten DRG-Neuronen Axon Wachstum der Region, wo die Makrophagen durch Zymosan9aktiviert wurden. Darüber hinaus können die Makrophagen an der Stelle der Läsion ein Wachstum-freizügigen Milieu für verletzten peripheren Nerven10erstellen.
Unsere Arbeit hat auch starke Beweise, die Makrophagen, die Kapazität der Axon Regeneration im benachbarten Neuronen beitragen können. Wir haben gezeigt, dass die Aktivierung von Makrophagen in den Dorsal Root Ganglien (DRG) wurden wesentlich verbesserte Regenerationsfähigkeit der DRG sensorische Neuronen nach einer Vorkonditionierung peripheren Nerven Verletzung11. Ähnliche Forschungen wurde unabhängig von einem anderen Labor-12berichtet. Wir haben auch gezeigt, dass intraganglionic Injektion von Dibutyryl zyklisches AMP (Db-cAMP), die eine bekannte Molekül, die Kapazitäten der Axon Regeneration13ist, die Aktivierung von Makrophagen induziert. Die Deaktivierung von Makrophagen abgeschafft die Auswirkungen des Db-Camps auf Neuriten Auswuchs Aktivität. Spätere Werke identifiziert Verletzungen-induzierte Expression von CCL2 in Neuronen als Signal zu stimulieren Makrophagen mit einem Pro-regenerative Phänotyp14,15.
Basierend auf den oben genannten experimentellen Ergebnissen, haben wir eine in-vitro- Modell molekularen Ereignisse, die in den DRGs nach ein preconditioning Verletzungen Modell11,14auftreten ähnlich aufgebaut. In diesem Modell wird die Db-cAMP auf der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen entlocken interzelluläre signalisieren, dass das zur Aktivierung von Makrophagen mit einem Pro-regenerative Phänotyp führt angewendet. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle durch die Makrophagen erzeugen kann, die molekulare Faktoren fördern Neuriten Auswuchs (Abbildung 1) absondern. Dieses experimentelle Modell zeigt ein Konzept, dass Makrophagen können angeregt oder veranlasst, Axon Regeneration nach Verletzungen des Nervensystems zu unterstützen. Unser Modell wird auch bei der Untersuchung der Mechanismen bei der interzellulären Signalisierung, die zur Aktivierung des Pro-regenerativen Makrophagen führt nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>Zellkultureinsatz: transparente PET-Membran 0,4&mu; m Porengröße</td><td>Corning,Falcon</td><td>353090</td><td>Transparente PET-Membran mit 0,4-&mu; M Porengröße, für 6-Well-Platte</td></tr><tr><td>70-&mu; m Nylon-Zellsieb</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-Kulturobjektträger</td><td>Biocoat</td><td>354632</td><td>mit einer gleichmäßigen Anwendung von Poly-D-Lysin</td></tr><tr><td>Rotblutkörperchen-Lysepuffer</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Enthält 1 % Glutamax und 1 % Penicilin-Streptomycin</td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serumfreies</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>extrazelluläre Lösung</td></tr><tr>,<td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin Hydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 3', 5'-cyclisches Monophosphat, N6,O2'-dibutyryl-, Natriumsalz</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% normales Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti & Beta; III Tubulin (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur CO2 Inkubator</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Präparierendes Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Twist Shaker</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>Edelstahl, 14cm, gebogen, Eingelenk-Feinschere</td></tr><tr><td>- Wolframkarbid & ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td><td>scharfe, gezackte</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzette</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0,07 x 0,04mm, gebogen</td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>15000-00</td><td>gerade, 3mm schneidig, scharf</td></tr><tr><td>Qualitron DW-41 Mikrozentrifuge</td><td>Artisan Technology Group</td><td>DW-41</td><td>Eingangsspannung: 115VAC</td></tr></tbody></table>

neuron-makrophagen ko-kulturen, makrophagen sezernieren molekulare faktoren mit neuriten auswuchs aktivität zu aktivieren

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Es gibt starke Hinweise, dass Makrophagen in der Regeneration oder Reparatur des verletzten Nervensystems teilnehmen können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, in dem Makrophagen produzieren konditioniert Medium (CM) induziert werden, die Neuriten Auswuchs fördert. Erwachsenen Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen sind akut dissoziiert und vernickelt. Nachdem die Neuronen stabil befestigt sind, sind peritoneale Makrophagen Co kultiviert auf einer Zelle Kultur einfügen überlagert, gleich gut. Dibutyryl, das zyklische AMP (Db-cAMP), um die Ko-Kulturen für 24 h angewendet wird, nach denen die Zellkultur einfügen, enthält der Makrophagen wird zu einem anderen verschoben, CM 72 h zu sammeln. CM von der Ko-Kulturen behandelt mit Db-cAMP, angewandt auf eine separate Erwachsenen DRG Neuron Kultur zeigt robuste Neuriten Auswuchs Aktivität. Die CM gewonnen aus der Db-cAMP-behandelten Kulturen bestehend aus einzelnen Zellentyp allein, DRG-Neuronen oder peritonealen Makrophagen nicht Neuriten Auswuchs Aktivität aufweisen. Dies bedeutet, dass die Interaktion zwischen Neuronen und Makrophagen ist unverzichtbar für die Aktivierung von Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität in CM. So wird unser Kokultur Paradigma studieren interzelluläre signalisieren in der Neuron-Makrophagen Interaktion stimulieren die Makrophagen, mit einem Pro-regenerative Phänotyp ausgestattet werden auch nützlich.

Wir beschreiben eine Protokoll, die Makrophagen in der Lage, die Sekretion von molekularer Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität erzeugen kann. Die Makrophagen CM entnommen der Ko-Kulturen behandelt mit Db-cAMP führte robuste Neuriten Auswuchs bei Anwendung auf eine separate DRG-Neuron-Kultur (Abbildung 2A). Im Vergleich dazu CM aus der PBS-behandelten Ko-Kulturen gewonnen nicht Neuriten Auswuchs in unseren 15-h Kultur-Dauer (Abb. 2 b<...

Das aktuelle Protokoll präsentiert experimentelle Verfahren zur kultivierte Makrophagen, ausgestattet mit einer Kapazität, molekulare Faktoren freizugeben, die Neuriten Auswuchs fördern zu stimulieren. Behandlung des Lagers, das Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen induziert die Makrophagen, konditionierten Medium zu produzieren, die starke Neuriten Auswuchs Aktivität besitzt.

Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen, Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität zu aktivieren

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Makrophagen zu erzeugen, die molekulare Faktoren sezernieren können, die das Wachstum von Neuriten fördern. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, wie Neuronen und Makrophagen miteinander interagieren, um den pro-regenerativen Makrophagenphänotyp zu aktivieren und eine hervorragende Regeneration zu fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir Cyclic AMP verwenden, ein Adenosin-Serummolekül, das viel physiologischere Enzyme ist, die in früheren Studien verwendet wurden, um Makrophagen mit dem pro-regenerativen Phänotyp zu stimulieren.Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir herausfanden, dass die Aktivierung von Makrophagen für die Verbesserung der Axionenwachstumskapazität unerlässlich ist und dass diese nach Vorsichtsmaßnahmen bei dauerhaften Lappenverletzungen hervorragende Neuronen produzieren können. Bevor Sie die Kultur einrichten, kodieren Sie eine Sechs-Well-Platte mit Poly-D-Lycin und Laminin. Inkubieren Sie anschließend die Sechs-Well-Platte mit 0,01 Poly-D-Lycin bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden oder bei vier Grad Celsius über Nacht.Danach den Teller zweimal mit destilliertem Wasser waschen. Dann inkubieren Sie die Platte mit Lamininlösung in einer Konzentration von drei Mikrogramm pro Milliliter für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Teller anschließend zweimal mit destilliertem Wasser und trocknen Sie den Teller mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur.Schneiden Sie nun mit einer chirurgischen Klinge die Haut über der Wirbelsäule einer euthanasierten Maus ein und präparieren Sie das Paar der Wirbelmuskulatur beidseitig, um die Wirbelknochen freizulegen. Entfernen Sie die Wirbelknochen sorgfältig mit einem Operationsrongeur mit schmaler Spitze, bis die DRG vollständig freigelegt sind. Unter einem Präpariermikroskop wird das DRG mit einer Iridektomieschere und einer Pinzette mit feiner Spitze beidseitig von S1 bis zur Ebene C1 entfernt.Übertragen Sie das DRG mit einer blauen Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Entfernen Sie dann DMEM nach einem kurzen Schleudern für einige Sekunden mit einer Minizentrifuge. Fügen Sie einen Milliliter DMEM mit 125 Einheiten kollagenem Typ 11 pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 90 Minuten lang mit einer sanften Drehung mit einem Twister-Shaker bei 37 Grad Celsius.Verwerfen Sie anschließend DMEM-haltige Kollagenase und fügen Sie einen Milliliter frisches DMEM hinzu. Übertragen Sie das DRG mit einer blauen Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie dann mindestens 15 Mal vorsichtig auf und ab, um eine homogene Zellsuspension herzustellen.Das Röhrchen wird drei Minuten lang bei 239 g zentrifugiert und der Überstand mit den Treibgut vorsichtig entsorgt. Fügen Sie einen Milliliter Neurobasilikummedium hinzu, das mit B27 ergänzt ist, und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es fünf- bis zehnmal vorsichtig auf und ab pipettieren. Führen Sie dann die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb, das auf einem konischen 50-Milliliter-Rohr aufgesetzt ist.Plattieren Sie dann alle gesammelten DRG-Neuronen auf zwei Vertiefungen der Sechs-Well-Platte. Um primäre Peritonealmakrophagen von einer erwachsenen Maus zu präparieren, schneiden Sie die Bauchhaut vorsichtig ein, um das Peritoneum freizulegen, und vermeiden Sie es, das Peritoneum zu schneiden, um ein Austreten von Spülflüssigkeit zu verhindern. Als nächstes punktieren Sie das Peritoneum mit einer Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel und injizieren Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS in die Bauchhöhle.Massieren Sie das Bauchfell sanft für ein bis zwei Minuten. Ziehen Sie dann die Nadel heraus und drücken Sie das PBS durch die Einstichstelle der Nadel heraus und sammeln Sie die Spülflüssigkeit in einem konischen 50-Milliliter-Schlauch. Anschließend zentrifugieren Sie die Spülflüssigkeit bei 239 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die zellulären Bestandteile zu pelletieren.Anschließend wird das Pellet drei Minuten lang bei Raumtemperatur mit drei Millilitern des Lysepuffers für rote Blutkörperchen erneut suspendiert. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut bei 239 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Suspendieren Sie die pelletierten Zellen in einem Milliliter Neurobasilikum B27-Medium.Die Hälfte aller gesammelten Makrophagen wird auf einen Zellkultureinsatz mit der effektiven Fläche von 4,2 Zentimetern im Quadrat aufgesetzt, der auf die Vertiefung des dissoziierten DRG gelegt wird. Vier Stunden nachdem die Neuron-Makrophagen co-kultiviert wurden, fügen Sie zwei Mikroliter 100 mikromolare DB cyclic amp-Lösung zu den Neuron-Makrophagen-Co-Kulturen hinzu. Füllen Sie nach 24 Stunden eine leere Vertiefung mit einem Milliliter Makrophagen-Kulturmedium in derselben Platte mit sechs Vertiefungen.Übertragen Sie den Zellkultureinsatz in der Neuronen-Makrophagen-Co-Kultur in die leere Vertiefung mit Makrophagen-Kulturmedium. Nach 72 Stunden zentrifugieren Sie das mit Makrophagen konditionierte Medium fünf Minuten lang bei 239-mal g, um die zellulären Bestandteile zu entfernen. Führen Sie den Überstand durch einen 0,2-Mikrometer-Filter, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen.Bei diesem Verfahren wird ein Objektträger mit acht Vertiefungskammern mit Poly-D-Lycin und Laminin vorbeschichtet. Dann erhalten Sie die dissoziierten adulten DRG-Neuronen und das Neurobasilikum-Medium, ergänzt mit B27 unter Verwendung der gleichen Methoden wie zuvor beschrieben. Fünf mal 10 zu den vier Zellen pro Vertiefung auf einen vorbeschichteten Objektträger mit acht Vertiefungskammern aufschlagen.Legen Sie dann den Objektträger der Kammer für zwei Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sich die Zellen am Boden befestigen können. Ersetzen Sie dann das Kulturmedium durch das aufgetaute, konditionierte Medium, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. 15 Stunden nach dem ersten Plattieren entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, geben Sie dann 200 Mikroliter eiskalte, 4%ige Paraformaldehydlösung in die Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit der Paraformaldehydlösung.Anschließend werden die fixierten Zellen vier Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit einer mit 10 % normalem Ziegenserum verdünnten Primärantikörperlösung inkubiert. Nehmen Sie anschließend Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, um das Wachstum von Neuriten sichtbar zu machen. Das Makrophagen-konditionierte Medium, das aus den Co-Kulturen gewonnen wurde, die mit zyklischem DB-AMP behandelt wurden, führte zu einem robusten Neuritenwachstum, wenn es auf eine separate DRG-Neuronenkultur aufgetragen wurde.Im Vergleich dazu induzierte konditioniertes Medium, das aus den PBS-behandelten Co-Kulturen gewonnen wurde, kein Neuritenwachstum. Wenn zyklisches DB-AMP in der Kultur mit Makrophagen allein behandelt wurde, war das konditionierte Medium nicht wirksam bei der Unterstützung des Neuritenwachstums. Dies deutet darauf hin, dass die Interaktion zwischen Neuronen und Makrophagen unerlässlich ist, um Makrophagen zu stimulieren, die mit einer pro-regenerativen Fähigkeit ausgestattet sind.Wir testeten auch das konditionierte Medium, das aus einer reinen Neuronenkultur von DB cyclic AMP gewonnen wurde, und fanden keinen Neuritenauswuchs. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Neuronen und Mikrotiterplatten frisch und gesund zubereitet werden sollten. Wir erlebten eine verminderte Neuritenauswuchsaktivität des konstanten Mediums, wenn die Dissektion zu lange dauerte oder Peritoneummakrophagen mit Blutbestandteilen kontaminiert waren.In diesem Protokoll wurden die dissoziierten DRG-Neuronen fiskalisch von den Makrophagen auf dem Zellkultureinsatz getrennt. Daher wird unser Co-Kultursystem die Identifizierung von zellulären Faktoren ermöglichen, die für die interzelluläre Signalübertragung verantwortlich sind und die Aktivierung vollständig regenerativer Makrophagen vermitteln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Diese Studie beschreibt die Verfahren für die Einrichtung einer neuartigen neuronalen Axon und (astro) Glia Co-Kultur-Plattform. Auf diese Co-Kultur-System wird Manipulation direkte Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon (und einzigen Gliazelle) durchführbar ist, so dass mechanistischen Analyse des gegenseitigen Neuron zu glialen Signalisierung.

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Dieses Video zeigt die Co-Kultivierung von murinen Spinalganglien-Neuronen und Makrophagen. Neuronen werden auf einer beschichteten Platte ausgesät, während Makrophagen von einer euthanasierten Maus gesammelt, behandelt und dem Kultureinsatz zugesetzt werden. Die Behandlung mit db-cAMP aktiviert Neuronen und veranlasst Makrophagen, einen pro-regenerativen Phänotyp anzunehmen, um das Wachstum der Neuronen zu unterstützen.

Entwicklung einer Neuronen- und Makrophagen-Kokultur in vitro

Dieses Video zeigt einen Assay zur Förderung des Wachstums von Neuronenprojektionen, bekannt als Neuritenwachstum, unter Verwendung des Makrophagen-konditionierten Mediums. Co-Kultur von Neuronen und Makrophagen mit cAMP und Ernte des von Makrophagen abgeleiteten konditionierten Mediums. Das Wachstum der Neuronen mit dem konditionierten Medium fördert das Auswachsen von Neuriten. Diese Auswüchse werden fluoreszenzmarkiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.

Verwendung eines Makrophagen-konditionierten Mediums zur Förderung von Neuronenerweiterungen

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Co-Kultur von humanen induzierten Neuronen (iNs) und induzierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (iOPCs). iNs werden mit iOPCs in einer Co-Kultur gemischt und dann inkubiert, um die Reifung von iNs zu Neuronen und iOPCs zu Oligodendrozyten zu unterstützen. Neuronen bilden synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen und Oligodendrozyten, während Oligodendrozyten Myelinscheiden um die Axone der Neuronen bilden.

Eine Co-Kultur-Methode zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In mehrzelligen Organismen lösen sekretierte lösliche Faktoren Reaktionen von verschiedenen Zelltypen als Ergebnis der parakrinen Signalübertragung aus. Insert-Co-Kultursysteme bieten eine einfache Möglichkeit, die Veränderungen zu beurteilen, die durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt vermittelt werden.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Hier präsentieren wir eine Methode mit durchlässigen Membranstützen, um die Untersuchung der berührungslosen Parakrinsignalisierung zu erleichtern, die von Tumorzellen verwendet wird, um die Immunantwort zu unterdrücken. Das System ist für die Untersuchung der Rolle von tumorsezerseten Faktoren bei der Dämpfung der Makrophagenaktivierung geeignet.

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Wir beschreiben die Isolierung, Dispersion und Beschichtung von Zellstoff (DP) Primärzellen mit trigeminalen (TG) Neuronen, die auf darüber liegenden Transwellfiltern kultiviert sind. Zelluläre Reaktionen von DP-Zellen können mit Immunfluoreszenz oder RNA/Protein-Analyse analysiert werden. Die Immunfluoreszenz neuronaler Marker mit konfokaler Mikroskopie ermöglicht die Analyse von Neuriten-Auswuchsreaktionen.

Eine Co-Kultur-Methode zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchss als Reaktion auf Dental Pulp Paracrine Signale

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Lernen Sie die Methode zur Aktivierung von Makrophagen mit cAMP in Neuron-Makrophagen-Ko-Kulturen. Diese Technik fördert die Sekretion von Faktoren, die das Neuritenwachstum in DRG-Neuronen stimulieren und Einblicke in regenerative Prozesse ermöglichen.

Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen, Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität zu aktivieren

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