Name: Muttermilch fördert Wachstum der Enteroids: ein Ex-Vivo -Modell der Zellproliferation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Enteroiden aus neonatalem Darmgewebe zur Untersuchung der Wirkung von Muttermilch auf die intestinale Zellproliferation. Diese Methode ermöglicht wertvolle Einblicke in gastrointestinale Erkrankungen.

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MG wird unterstützt durch Zuschüsse, K08DK101608 und R03DK111473 von den National Institutes of Health, März des Dimes Foundation Grant Nr. 5-FY17-79, die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital und dem Department of Pediatrics an der Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL stützt sich auf R01DK104946 (PI: Silverman), die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital.

Alle tierische Verfahren in dieser Studie wurden von entweder der Washington University in St. Louis institutionelle Animal Care und Use Committee (Protokoll 20160187) oder institutionelle Tierbetreuung University of Pittsburgh und Use Committee (Protokoll 14103918) genehmigt. Menschlichen fetalen Dünndarm in weniger als 24 Wochen Schwangerschaft wurde im Einklang mit der University of Pittsburgh Leitlinien für die Auftragsvergabe des anatomischen Gewebe nach Institutional Review Board Genehmigung (Protokoll PRO14100537) von der University of erhalten. Pittsburgh Gesundheit Wissenschaften Gewebebank durch ein ehrlicher Makler-System. Anonymisierte Muttermilch oder pasteurisierte Spender Muttermilch wurde mit einem Verzicht auf der Zustimmung von der University of Pittsburgh Institutional Review Board erhalten.
(1) Krypta Isolation und Gründung der Enteroids von neugeborenen Mäusen oder vorzeitige menschlichen Dünndarm
<ol><li>Medien-Vorbereitung Hinweis: Medien sollten in der Haube am Vortag Krypta Isolierung vorbereitet werden.<ol>
<li>1,11 L Kulturmedien vorbereiten. Beginnen Sie mit 1 L Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin und 110 mL fetalen Bovine Serum (FBS) (Endkonzentration 10 %), 11 mL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %) und 1,1 mL sterile Insulin (final Konzentration von 0,1 %).</li>
		<li>500 mL PBS-Antibiotikum Mischung zubereiten. Beginnen Sie mit 500 mL 1 x Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 10 % FBS und 5 mL Gentamicin (Endkonzentration 1 %), 1 mL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %) und 5 mL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %).</li>
		<li>Bereiten Sie 30 mL Cell Disruption Medien #1. Bereiten Sie zuerst 30 mL Nährmedien. Fügen Sie 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (Endkonzentration 10 mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %).</li>
		<li>Bereiten Sie 30 mL Cell Disruption Medien #2. Bereiten Sie zuerst 30 mL Nährmedien. Fügen Sie 300 µL 0,5 M EDTA (Endkonzentration 5 mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %).</li>
		<li>Bereiten Sie 50 mL Krypta Kulturmedien ohne Wachstumsfaktoren. Messen von 33,4 mL 1 x erweiterte DMEM/F-12 und 10 mL FBS (Endkonzentration 20 %).<ol>
<li>Hinzufügen von 500 µL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %), 500 µL L-Glutamin (Endkonzentration 1 %), 500 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %), 100 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane Sulfonsäure (HEPES) (Endkonzentration 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcystein (Endkonzentration 1 mM), 500 µL 100 x n-2-Beilage, 1 mL 50 x serumfreien Ergänzung (z.B.B-27) abzüglich Vitamin A und 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mL Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren. Bereiten Sie zuerst 1 mL der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren. Fügen Sie 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (Endkonzentration 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL Birne (Endkonzentration 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (Endkonzentration 500 ng/mL) und 0,5 µL 100 µg/mL EGF (Endkonzentration 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Krypta Isolierung
	<ol>
<li>Ort solubilisiert Basalmembran Extrakt (siehe Tabelle der Materialien) auf Eis Auftauen vor Beginn. Hinweis: Halten Sie Basalmembran auf Eis, oder es werden polymerisieren.</li>
		<li>In Übereinstimmung mit den institutionellen Animal Care und Use Committee Protokoll für Mäuse mehr als 14 Tage alt, einschläfern Mäuse mit zwei Methoden der Euthanasie mit der zweiten wird ein physischer Verfahren, um Tod zu gewährleisten. Hinweis: Für Mäuse unter 14 Tage alt, ist Enthauptung das Standardverfahren mit einer Schere.</li>
		<li>Mit Schere und Pinzette, machen Sie einen vertikalen Schnitt auf der Mittellinie des Bauches, durch die Haut und Bauchfell, über die gesamte Länge des Abdomens. Verbrauchsteuern im Dünndarm aus dem Magen, der Blinddarm mit Schere und das Mesenterium mit einer Pinzette entfernen. Hinweis: Zwei Wochen alten männliche und weibliche C57BL/6J Maus Welpen, je 5,5-7 g, dienten zur Krypta Isolierung. Jedem Alter oder Größe Maus kann zur Krypta Isolierung verwendet werden.</li>
		<li>Krypta Isolierung, Lage Darm gerade, frisch geernteten Dünndarm vorzubereiten und den Darm längs entlang seiner gesamten Länge mit einer Schere schneiden. Hinweis: Maus und menschlichen Darm können in ähnlicher Weise zubereitet werden.</li>
		<li>Saubere Hocker aus Darm durch sanft schütteln den Darm hin und her in einer PBS-Antibiotikum-Mischung gefüllt Petrischale mit Pinzette.</li>
		<li>Eine 50 mL konische Rohr 30 mL Cell Disruption Medien #1 hinzufügen. Geschnitten Sie der Darm in 0,5 cm Länge Stücke direkt in das Rohr. Legen Sie das Rohr in einem Eiskübel und sanft schütteln im Shaker mit niedrigster Geschwindigkeit für 15 min.</li>
		<li>Während das Gewebe auf den Shaker, erhalten Sie 24 oder 48-Well Platten um Krypten wachsen, wenn die Enteroids für RNA oder DNA-Protein isoliert verwendet werden. Einsatz 8-Well-Kammer Folien, Krypten zu wachsen, wenn die Enteroids für ganze verwendet werden montieren konfokale Bildgebung.</li>
		<li>Fügen Sie in der Haube 15 µL der Basalmembran am unteren Rand jedes gut von 24 oder 48-Well-Platte hinzu. Wenn Kammer Folien verwenden, fügen Sie unten jeder Kammer 9 µL der Basalmembran. Hinweis: Stellen Sie die Lautstärke der Basalmembran entsprechend der Größe der Platte bei Bedarf.</li>
		<li>Schnell die Basalmembran mit der Pipettenspitze so verteilt, dass die Basalmembran eine dünne Schicht auf der Unterseite des Brunnens bildet. Legen Sie die Platte bei 37 ° C im Brutschrank für 30 min an der Basalmembran zu polymerisieren zu ermöglichen. Hinweis: Wenn die Basalmembran keine dünne Schicht ist oder Basalmembran Luftblasen enthält die Krypten nicht befestigen.</li>
		<li>Nach 15 min auf einen Shaker filtern Sie das Gewebe durch ein 100 µm-Sieb. Die Durchströmung zu verwerfen.</li>
		<li>Eine neue 50 mL konische Rohr 30 mL Cell Disruption Media #2 hinzufügen. Gewebe aus Sieb entfernen und Hinzufügen der Röhre.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr in einem Eiskübel und sanft schütteln im Shaker mit niedrigster Geschwindigkeit für 15 min.</li>
		<li>Nach 15 min auf den Shaker filtern Sie Gewebe durch ein 100 µm-Sieb. Halten Sie Durchströmung bei diesem Schritt für den Fall, dass Ertrag niedrig in späteren Schritten ist. Hinweis: Alle Strömung durch Rohre muss auf Eis gehalten werden.</li>
		<li>Hinzufügen einer neuen 50 mL konische Rohr 15 mL DMEM mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin. Gewebe aus Sieb entfernen und Hinzufügen der Röhre. Kräftig schütteln Sie das Rohr von hand 10 S. Filter durch ein 100 µm-Sieb und sammeln Sie Durchströmung zu. Wiederholen Sie, bis der Durchfluss durch keine Partikel enthält.</li>
		<li>In der Haube filtern Sie die Durchströmung von vorherigen Schritt in ein neues 50 mL konische Röhrchen mit 70 µm Siebe für Maus Gewebe oder 100 µm Siebe für menschliches Gewebe. Hinweis: Haben Sie zusätzliche Siebe im Standby-Modus und gießen Sie langsam wie Siebe mit Ablagerungen verstopfen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 X g für 8 min bei 4 ° C und Platz direkt in einen Eiskübel in der Kapuze. Entfernen Sie den Überstand durch Pipette ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen Sie Pellet mit gewünschten Gesamtbetrag der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren. Hinweis: Die angereicherten Krypten sind die "sandig" Schicht des Pelletofens. Jede erfordert gut 250 µL der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren.</li>
	</ol></li>
	<li>Einrichtung von enteroids
	<ol>
<li>Platte der Krypta Medien Mischung direkt auf der Basalmembran.</li>
		<li>Überprüfen Sie Krypten mit einem Mikroskop um sicherzustellen, dass die Isolierung Prozess erfolgreich war. Hinweis: Zellen und Kugeln der Zellen sind erwünscht. Ca. 100 einzelnen Krypten sind pro Bohrloch beschichtet.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 3 h Krypten zur Einhaltung der Basalmembran ermöglichen. Hinweis: Diese Inkubation ist mit Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren.</li>
		<li>Abnehmen Sie die Medien und überschüssige Krypten, die konnte nicht angehängt werden mit einer Pipette P-200 langsam. Hinweis: Stören Sie die Basalmembran nicht, wie die beigefügten Krypten verdrängt werden können.</li>
		<li>Fügen Sie langsam 250 µL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren in jede Vertiefung. Hinweis: Für 24-48-Well Platten oder Kammer gleitet, 250 µL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren ist ausreichend.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Medien alle 2 Tage mit frischem Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren für 5 Tage vor Behandlungen, um optimale Anhaftung und Wachstum zu ermöglichen.</li>
	</ol></li>
</ol>(2) Maus Brust Milch Kollektion
<ol><li>Ihre Welpen für 6 h vor dem Melken trennen Sie Naturfreibad C57BL/6J stillende postpartale 7-12 Tage.</li>
	<li>Betäuben Sie den stillenden Damm mit Isofluran über eine Nase Kegel zu und verwalten Sie eine subkutane Injektion von Oxytocin bei 0,15 IU/kg Körpergewicht. Warten Sie 3 Minuten vor dem Melken Verfahren.</li>
	<li>Sauger mit 70 % Ethanol vor dem Melken Verfahren reinigen und trocknen lassen.</li>
	<li>Extrahieren Sie Milch aus Zitzen ein zu einem Zeitpunkt mit einer menschlichen elektrische Milchpumpe mit Silikonschlauch in eine 5 mL-Sammelröhrchen Maus Zitzen angepasst. Hinweis: Optimale Milchpumpen haben zwei Einstellungen, eine für Geschwindigkeit und eine für die Absaugung. Es empfiehlt sich, mit den niedrigsten Einstellungen jedes starten und beide langsam erhöhen, bis die Milch gewonnen wird. Im Idealfall werden Gesamtausbeute ~ 500 µL - 1 mL der Maus Muttermilch pro stillende Mutter.</li>
	<li>Sofort aliquoten Muttermilch und Store bei-80 ° C. Hinweis: Vermeiden Sie Frost/Tau-Zyklen.</li>
	<li>Behandlung von Enteroids am 5. Tag mit 50 µL/mL Muttermilch Maus pro mL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren für 24 h bei 37 ° C.</li>
</ol>3. gesamte montieren Sie Färbung des Enteroids
<ol><li>
Vorbereitung der Reagenzien
	<ol>
<li>Bereiten Sie 16 mL 1 X PBS pro 8 Brunnen.</li>
		<li>1 X PBS pro 8 Brunnen 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) vorbereiten.</li>
		<li>Vorbereitung 2 mL 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer pro 8 Brunnen.</li>
		<li>Bereiten Sie 24 mL PBS-Tween (PBST ist 0,1 % Tween 20 in 1 X PBS) pro 8 Brunnen.</li>
		<li>Bereiten Sie 2 mL 10 % normale Esel Serum (NDS) in 0,1 % PBST (10 % NDS/PBST) pro 8 Brunnen.</li>
		<li>Bereiten Sie 4 mL 1 % NDS in 0,1 % PBST (1 % NDS/PBST) pro 8 Brunnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung von Tag 1
	<ol>
<li>Aspirieren von Behandlungen und Enteroids mit PBS waschen. Fügen Sie 250 µL 4 % PFA pro Bohrloch. Legen Sie auf Rotator für 1-2 h bei 4 ° C. Entfernen Sie die 4 % PFA mit Pipette.</li>
		<li>Waschen 4 Mal mit 250 µL/Well 1 x PBS. Setzen Sie auf Rotator für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Hinweis: Es ist möglich, Platte für 1-2 Tage bei 4 ° C zu speichern, wenn nötig.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL/Well 0,1 % Triton x-100. Inkubation für 1 h bei RT. Entfernen Sie 0,1 % Triton x-100 mit Pipette.</li>
		<li>Waschen 4 Mal mit 250 µL/Well 1 x PBS. Legen Sie auf Rotator für 15 min bei RT</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL/Well 10 % NDS/PBST. 45 min bei RT. Entfernen Sie inkubieren 10 % NDS/PBST mit Pipette.</li>
		<li>250 µL/Well Primärantikörper, verdünnt 1/250 in 1 % NDS/PBST hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Die optimale Antikörper Verdünnung variiert je nach Hersteller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung von Tag 2
	<ol>
<li>Mindestens 5 Mal für 4-5 Std. mit 250 µL/Well PBST waschen. Setzen Sie auf Rotator bei 4 ° C zwischen jedem Waschgang.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL/Well Sekundärantikörper, verdünnt 1/1.000 in 1 % NDS/PBST. Die Platte in Folie wickeln und über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung von Tag 3
	<ol>
<li>Fügen Sie 250 µL/Well nuklearen 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 15 min. Fleck. Hinweis: Halten Sie die Platte in der Dunkelheit.</li>
		<li>Waschen Sie 6 Mal mit 250 µL/Well PBST. Setzen Sie auf Rotator für 10 min bei 4 ° C zwischen jedem Waschgang.</li>
		<li>Mount Deckglas auf Kammer schieben mit Montage Medien.</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder mit einem 40 X Objektiv confocal Mikroskop und ebenso Rendern in ein Raster-Grafik-Editor (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben und frei von Interessenkonflikten.

Das Darmepithel besteht aus vielen zellulären Subtypen, die sind verantwortlich für die Bereitstellung von Host-Abwehr von Krankheitserregern, Darm Barriere Integrität, und in der Pathogenese verschiedener Krankheiten durchbrochen werden kann. Während Tiermodelle einige Facetten der Krankheit zusammenfassen können, bietet die ex-Vivo -Modell des Enteroids, abgeleitet aus dem Dünndarm von Mäusen und Menschen eine Plattform, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen zu testen. Die Bedeutung des Enteroid-M...

Nekrotisierende Enterokolitis ist (NEC) die führende Ursache des Todes von Magen-Darm-Erkrankung bei Frühgeborenen, die betreffen fast 1 in 10 Neugeborenen vor 29 Wochen Schwangerschaft1,2,3. Die Hälfte der Säuglinge mit NEC Fortschritte, die schwerste Form, wo überleben befindet sich nur 10-30 %4,5. In den Vereinigten Staaten einem geschätzten 2 Milliarden USD pro Jahr ausgegeben werden, Behandlung von Säuglingen mit NEC6,7, doch weder die Überlebensrate noch Therapie hat in den vergangenen 30 Jahren verändert. Die Pathogenese der NEC zeichnet sich durch intestinale Verletzungen und beeinträchtigt mukosalen Heilung8,9,10,11, jedoch die Signalwege führt zu einer verschärften entzündliche Reaktion und Mechanismen, die Entzündung umzukehren bleiben unvollständig verstanden.
Die Verwaltung der menschlichen Muttermilch hat sich herausgestellt, die nur Schutzstrategie gegen NEC für Frühgeborene zu sein. Wir haben bereits gezeigt, dass Muttermilch gegen NEC Entwicklung durch Hemmung des angeborenen Immunsystems Rezeptor Abgabe-wie Rezeptors 4 (TLR4) in das Darmepithel über den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR schützt) Signalisierung Weg11. Ergänzung der Muttermilch auf eine experimentelle NEC Formel gedämpft, die entzündliche Reaktion in NEC wie durch Hemmung der Enterozyten Apoptose und Wiederherstellung der Enterozyten Verbreitung in einer Weise, die abhängig von epidermalen Wachstum war, gesehen Factor (EGF) und EGFR-11. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass Nitrat, ein weiterer Bestandteil der Muttermilch, trägt zu seiner schützenden Natur durch Modulation der intestinalen Perfusion, im Vergleich zu Säuglingsnahrung, die Nitrat fehlt und kann dazu beitragen, die erhöhte Häufigkeit von NEC in Formel gefüttert Kleinkinder12,13. Andere Verbindungen, die in der Muttermilch, die nachweislich in den Schutz gegen NEC einbezogen sind Muttermilch-Oligosaccharide, L-Arginin, Glutamin und Lactoferrin14,15,16, 17,18,19. Diese positiven Elemente der Muttermilch zeigen die Notwendigkeit, seine Verwendung in der Prävention von NEC, aber auch betonen, wie wichtig es ist, die Mechanismen, Signalisierung, Wege und zelluläre Effekte wie Muttermilch ist den Schutz gegen NEC Vermittlung beteiligt .
In Ordnung, weiter zu studieren die Schutzeigenschaften der Muttermilch in einem Mausmodell der NEC, entwickelten wir eine neuartige, einfach zu bedienende-Technik durch die Maus Muttermilch aus einem narkotisierten Damm mit einer elektrischen Muttermilch Pumpe11,12 extrahiert werden können . Diese Strategie des Erwerbs von Maus-Muttermilch ist vorteilhaft, nicht nur weil Muttermilch Pumpen leicht zugänglich und effizient bei der Beschaffung von Muttermilch, sondern auch weil diese Methode ermöglicht eine artspezifische Brust Milch Analysen. Infolgedessen, wir können die Auswirkungen der Maus Muttermilch mit denen des menschlichen abgepumpte Milch vergleichen sowie pasteurisiert menschlichen Spender Milch von einer Milch-Bank in artspezifische Modelle. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Brust Milchkomponenten in Bezug auf ihren Beitrag zur Prävention von NEC. Andere Forscher haben Brust Milch Extraktionsverfahren entwickelt, aber diese Techniken sind manuell und erfordert in der Regel mehr als ein Labor Mitglied20,21,22. Hier ist eine einfache Technik, die genutzt werden kann, indem Sie ändern eine menschliche elektrische Milchpumpe um Milch von einer Maus zu sammeln vorgestellt. Diese Technik kann auch auf andere Arten angewendet werden.
Um die Signalwege mit NEC angemessen zu verhören, sind Modellsysteme erforderlich, um die verschiedenen Zelltypen im Krankheitsprozess betroffenen bewerten. Hier diskutieren wir ein solches Modell - Enteroids- und deren Etablierung von Mäusen und menschlichen Dünndarm. Menschlichen Darm Enteroids (HIEs) bieten vor allem bedeutende versprechen, denn sie eine innovative, genetisch vielfältigen ex Vivo Menschmodell bieten um die Untersuchung pathophysiologischer Prozesse zu unterstützen, die im Magen-Darm-Trakt stattfinden 23. Enteroids sind gefunden worden, um langfristige kultiviert werden und kann für spätere Verwendung23eingefroren werden, und im Gegensatz zu menschlichen Darm Organellen (Chios), deren Kulturen von induzierbaren pluripotente Stammzellen entwickelt werden, Enteroids entstehen aus Stammzellen innerhalb von isolierten Darm Krypten24. Enteroids erfordern weniger Wartung, kann schnell25infiziert, und kann leicht festgestellt werden, da Darm Krypten als Chios23differenzierter sind. Deshalb bieten HIEs viele Vorteile gegenüber bestehenden Techniken, weil sie entwickelt werden können, um regionsspezifische kompositorischen und funktionellen Eigenschaften des menschlichen Magen-Darm-Epithel23aufweisen. Die Verwendung von Enteroids ist eine hochwirksame Wahl wenn diese ein menschliches Modell des Darmes, mit Einhaltung der Region-spezifische Einschränkungen und Ease of Use. Hier zeigen wir die Technik der Isolierung und Aufrechterhaltung primäre Stammzellen gewonnenen kleinen Darm Enteroids von Mäusen und menschlichen Säuglingen verfrüht.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphat-Buffered Kochsalzlösung ( DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-Ethan Sulfonsäure (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Maus-Wnt3a-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Maus-Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel-Wachstumsfaktor mit reduzierter Basalmembran-Matrix-Corning</td><td></td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Zellkultur-Petrischale</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Zelle Kulturplatte</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M Steriles Zellsieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Steriles Zellsieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normaler Esel Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1,5-Zoll-Nadel</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Menschliche elektrische Doppelmilchpumpe</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Reagenzglas mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Gummistopfen</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 Primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

muttermilch fördert wachstum der enteroids: ein ex-vivo -modell der zellproliferation

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Menschlichen kleinen intestinalen Enteroids ergeben sich aus den Krypten und wenn Sie in einer Stammzellnische angebaut enthalten alle Epithelzelle Typen. Die Fähigkeit, menschliche Enteroid ex Vivo Kultur Systeme einzurichten sind wichtig, Modell Darm Pathophysiologie und studieren die bestimmten zellulären Reaktionen beteiligt. In den letzten Jahren sind Enteroids von Mäusen und Menschen, passagiert und Querneigung Weg für die zukünftige Verwendung in mehreren Labors auf der ganzen Welt kultiviert wird. Diese Enteroid-Plattform kann verwendet werden, testen Sie die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen und Medikamente und welche Auswirkungen auf verschiedene Zelltypen im Darm ausgeübt werden. Hier ein Protokoll für die Gründung der primäre Stammzellen gewonnenen kleinen intestinalen Enteroids abgeleitet von neugeborenen Mäusen und vorzeitige menschlichen Darm wird zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus wurde dieses Enteroid-Kultur-System eingesetzt, um die Auswirkungen der artspezifische Muttermilch zu testen. Maus-Muttermilch erhalten Sie effizient mit einer veränderten menschliche Milchpumpe und ausgedrückt Maus Milch kann dann für weitere Forschung Experimente verwendet werden. Wir zeigen nun die Auswirkungen der zum Ausdruck gebrachten Maus, Mensch, und Spender Muttermilch auf das Wachstum und die Verbreitung von Enteroids von neugeborenen Mäusen oder vorzeitige menschlichen Dünndarm abgeleitet.

Zuerst wollten wir untersuchen, ob die Muttermilch ausgedrückt oder pasteurisierte Spender Muttermilch wirkten sich auf kleinen Darm Enteroids. In der Tat erhöht die Muttermilch und Spender Muttermilch das Wachstum des Neugeborenen Maus (Abbildung 1A) und vorzeitige menschlichen abgeleiteten Enteroids (Abbildung 1 b).
Da die Muttermilch das Wachstum der kleinen intestin...

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid-Kultur-System von Neugeborenen Maus oder vorzeitige menschlichen Darm sowie eine effiziente Methode um Milch von Mäusen zu sammeln.

Muttermilch fördert Wachstum der Enteroids: ein Ex-Vivo -Modell der Zellproliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Miniaturdärme, sogenannte Enteroide, im Labor zu kultivieren. Enteroide werden mit im Labor extrahierter Mausmuttermilch behandelt, um die Auswirkungen der Muttermilch auf die Proliferation in vitro aufzuklären. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zusammenhang mit verschiedenen Magen-Darm-Erkrankungen zu beantworten, wie z. B. der nekrotisierenden Enterokolitis, die Frühgeborene betrifft.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Enteroide wenig Pflege benötigen, schnell etabliert werden können und viele der funktionellen Eigenschaften des gastrointestinalen Epithels aufweisen. Diese Technik zur Etablierung von Enteroiden ist ein hochwirksames Modell des menschlichen Dünndarms. Obwohl diese Methode Einblicke in den Dünndarm geben kann, kann sie auch auf andere Organsysteme in anderen Regionen des Magen-Darm-Trakts angewendet werden.Tauen Sie zunächst den löslichen Basalmembranextrakt auf Eis auf. Verwenden Sie dann eine Schere und eine Pinzette, um einen vertikalen Schnitt entlang der gesamten Bauchmittellinie einer euthanasierten Maus zu machen. Mit einer Pinzette den Dünndarm herausschneiden und das Mesenterium entfernen.Um den Dünndarm auf die Kryptenisolierung und die enteroide Bildung vorzubereiten, positionieren Sie den Darm gerade und schneiden Sie mit einer Schere in Längsrichtung über seine gesamte Länge. Entfernen Sie jeglichen Stuhl, indem Sie den Darm vorsichtig mit einer Pinzette in einer Petrischale, die mit PBS-Antibiotikamischung gefüllt ist, schütteln. Geben Sie dann 30 Milliliter Zellaufschlussmedium Nummer eins in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Legen Sie halbe Zentimeter große Darmsegmente in das Röhrchen und setzen Sie das Röhrchen in einen Eiskübel auf einem Shaker. Geben Sie in einer Haube 9 Mikroliter Basalmembran auf den Boden jeder Vertiefung in einer Kammer mit acht Vertiefungen. Verteilen Sie die Membran schnell mit einer Pipettenspitze und lassen Sie die Basalmembran in einem Inkubator polymerisieren.Es ist wichtig, die Basalmembran schnell so zu verteilen, dass sie eine dünne Schicht auf dem Boden der Vertiefung bildet. Die Krypten haften nicht, wenn Luftblasen vorhanden sind oder wenn die Basalmembran zu dick ist. Nachdem Sie das konische Rohr gerührt haben, verwenden Sie ein 100-Mikrometer-Sieb, um das Membrangewebe zu filtrieren und den Durchfluss zu verwerfen.Geben Sie 30 Milliliter Zellaufschlussmedium Nummer zwei in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und geben Sie dann das Darmgewebe in das Röhrchen. Nachdem Sie das Röhrchen 15 Minuten lang gerührt haben, filtrieren Sie das Gewebe durch ein 100-Mikrometer-Sieb. Behalten Sie den Durchfluss aus diesem Schritt bei.Geben Sie 15 Milliliter TMEM mit 4,5 Gramm Glukose und L-Glutamin pro Liter in ein neues konisches Röhrchen. Entnehmen Sie das Gewebe aus dem 100-Mikrometer-Sieb und geben Sie es in das neue konische Röhrchen. Schütteln Sie dann das Röhrchen manuell 10 Sekunden lang und filtrieren Sie es durch ein 100-Mikrometer-Sieb.In der Haube wird das Gewebe mit einem 70-Mikrometer-Sieb in ein neues konisches Röhrchen gefiltert. Nachdem Sie das Röhrchen 8 Minuten lang zentrifugiert haben, legen Sie es in einen Eiskübel in der Haube. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen, ohne das gebildete Pellet zu stören.Suspendieren Sie das Pellet erneut mit einer angemessenen Menge an Kryptenkulturmedien ohne Wachstumsfaktoren. Nachdem Sie den Kammerobjektträger 30 Minuten lang inkubiert haben, plattieren Sie die Krypten-Medium-Mischung direkt auf die Basalmembran und inkubieren Sie 3 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, während die Krypten haften. Verwenden Sie nach der Inkubationszeit eine P200-Pipette, um vorsichtig alle Medien und nicht angehängten Krypten zu entfernen.Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Medien und überschüssigen Krypten, die sich nicht mit einer P200-Pipette anheften ließen, langsam entfernt werden. Stören Sie die Basalmembran nicht, da sich die daran befestigten Krypten lösen können. Geben Sie langsam 250 Mikroliter Kryptenkulturmedien mit Wachstumsfaktoren in jede Vertiefung.Betäuben Sie eine laktierende Hündin mit Isofluran, das über den Nasenkonus verabreicht wird, und verabreichen Sie die entsprechende Dosis subkutanes Oxytocin. Reinigen Sie die Zitzen mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie trocknen, bevor Sie den Melkvorgang starten. Entnehmen Sie mit einer elektrischen menschlichen Milchpumpe, die mit einem Silikonschlauch ausgestattet ist, der für Mäuse geeignet ist, und einem 5-Milliliter-Schlauch nacheinander Milch aus den Zitzen.Zum Schluss aliquotieren Sie die Milch sofort und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius. Behandeln Sie die Enteroide am fünften Tag mit gelagerter Mausmilch für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie am ersten Tag der Färbung PBS, um experimentelle Behandlungen zu entfernen und die Darmkrebse zu waschen.Geben Sie 250 Mikroliter 4%PFA in jede Vertiefung und legen Sie den Objektträger für 1 bis 2 Stunden bei 4 Grad Celsius auf einen Rotator. Entfernen Sie das PFA mit einer Pipette und waschen Sie dann jede Vertiefung vorsichtig viermal vorsichtig mit 250 Mikrolitern PBS. Stellen Sie den Kammerschieber 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotator.250 Mikroliter 0,1 %Triton X-100 in jede Vertiefung geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie den Triton X-100 nach der Inkubation mit einer Pipette und waschen Sie ihn viermal mit 250 Mikrolitern PBS in jeder Vertiefung. Legen Sie die Folie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotator.250 Mikroliter 10 % NDS/PBST in jede Vertiefung geben und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation das NDS/PBST mit einer Pipette. Zum Schluss geben Sie 250 Mikroliter verdünnten Primärantikörpers in jede Vertiefung und inkubieren über Nacht bei 4 Grad Celsius.Waschen Sie am zweiten Tag der Färbung jede Vertiefung mindestens fünfmal mit 250 Mikrolitern PBST und legen Sie den Objektträger zwischen jedem Waschgang bei 4 Grad Celsius auf einen Rotator. Geben Sie 250 Mikroliter verdünnten Sekundärantikörper in 1 % NDS/PBST in jede Vertiefung. Wickeln Sie die Folie in Folie ein und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.Am letzten Tag der Färbung geben Sie 250 Mikroliter nuklear gefärbtes DAPI in jede Vertiefung und lassen Sie es 15 Minuten lang einwirken. Waschen Sie dann jede Mulde sechsmal mit 250 Mikrolitern PBST. Legen Sie die Folie zwischen jedem Waschgang 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius auf einen Rotator.Bereiten Sie schließlich den Objektträger für die mikroskopische Bildgebung vor, indem Sie einen Deckglas mit Eindeckmedium auf den Kammerobjektträger aufkleben und ihn 24 Stunden trocknen lassen. In dieser Studie wurden Dünndarmenteroide von neugeborenen Mäusen mit Muttermilch behandelt, die von laktierenden Mäusen entnommen wurde. Wie in dieser Abbildung gezeigt, erhöhte die Muttermilch von Mäusen die Proliferation in Enteroiden von Mäusen.Um die speziesspezifischen Effekte von Muttermilch zu untersuchen, wurden auch menschliche Muttermilch und die pasteurisierte Spendermuttermilch auf die enteroiden Mäuse aufgebracht. Wie in dieser Abbildung gezeigt, erhöhte menschliche und pasteurisierte Spendermuttermilch die Proliferation von Mausenteroiden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Krypten während der Isolationsschritte auf Eis zu halten.Führen Sie alle Methoden langsam und schonend durch, nachdem die Darmkörper in Kultur sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Behandlungen mit Immunzellen, Mikrobiota oder verschiedenen Medikamenten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, um das Mikromilieu des Darms besser rekapitulieren zu können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Enteroide kultivieren, behandeln und Immunfluoreszenz durchführen.Darüber hinaus solltest du in der Lage sein, einer stillenden Maus effizient Muttermilch zu entnehmen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe und Körperflüssigkeiten äußerst gefährlich sein kann und bei diesen Eingriffen immer persönliche Schutzausrüstung getragen werden sollte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir beschreiben eine Methode zur Etablierung menschlicher Enteroide aus Dünndarmkrypten und Kolonoide aus Dickdarmkrypten, die sowohl aus chirurgischem Gewebe als auch aus Biopsien entnommen wurden. In diesem methodischen Artikel stellen wir die Kulturmodalitäten vor, die für das erfolgreiche Wachstum und die Erhaltung von humanen Enteroiden und Kolonoiden unerlässlich sind.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

Enteroids entstehen als neuartige Modell in der Studie der menschlichen Krankheit. Das Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid Modell der menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis mit Lipopolysaccharid (LPS) Behandlung von Enteroids generiert aus neonatalen Gewebe zu simulieren. Gesammelte Enteroids zeigen entzündliche Veränderungen, wie Sie die in menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis gesehen.

Neuartige menschlichen epitheliale Enteroid Modellcharakter für die nekrotisierende Enterokolitis

Organoide, die sich aus den Meeressammrissen entwickelten, wurden bestrahlt und charakterisiert, um epitheliale Merkmale und Wechselwirkungen mit Immunzellen zu beurteilen. Bestrahlte Organoide können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit Zellen besser zu bewerten, die zu der Rekrutierung von Tumorzellen in bestrahltem normalem Gewebe führen können.

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Das vorgestellte Protokoll verwendet Diedurchflusszytometrie, um die Anzahl der sich ausbreitenden und abgestorbenen Zellen in kultivierten Mausenteroiden zu quantifizieren. Diese Methode ist hilfreich, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Organoidproliferation und das Überleben zu bewerten.

Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Dieses Protokoll bietet experimentelle In-vitro-Werkzeuge zur Bewertung der Transformation menschlicher Brustzellen. Detaillierte Schritte zur Nachverfolgung der Zellproliferationsrate, der verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität und der Verteilung von Zelllinien in 3D-Kulturen mit Kellermembranmatrix werden beschrieben.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Crosstalk zwischen Brustepithelzellen und Endothelzellen trägt wesentlich zum Fortschreiten von Brustkrebs, Tumorwachstum und Metastasierung bei. In dieser Studie wurden Sphäroide aus Brustkrebszellen zusammen mit vaskulären und/oder lymphatischen Endothelzellen hergestellt und demonstrieren ihre Anwendbarkeit als In-vitro-System für die Brustkrebsforschung.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Dieses Protokoll beschreibt ein apikal-out-nekrotisierendes Enterokolitis-Modell (NEC)-in-a-dish, das Dünndarmenteroide mit umgekehrter Polarität verwendet und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Wir bieten ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zum Nachweis von NEC-bedingten Epithelstörungen und eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von apikalen Enteroiden, die dem NEC-in-a-dish-Protokoll unterliegen.

In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung von Enteroiden, einem dreidimensionalen Darmmodell, aus fetalem Darmgewebe. Immunfluoreszierende Bildgebung von epithelialen Biomarkern wurde zur Modellcharakterisierung verwendet. Die apikale Exposition von Lipopolysacchariden, einem bakteriellen Endotoxin, induzierte die epitheliale Permeabilität in einer dosisabhängigen Weise, gemessen durch das Austreten von fluoreszierendem Dextran.

Testen der Epithelpermeabilität in fetalen Gewebe-abgeleiteten Enteroiden

Enteroide entwickeln sich zu einem neuen Modell für die Untersuchung der Gewebephysiologie und Pathophysiologie, der Arzneimittelentwicklung und der regenerativen Medizin. Hier beschreiben wir ein bovines primäres 2D-enteroides Kultursystem, das eine Co-Kultivierung mit relevanten Gewebezelltypen ermöglicht. Dieses Modell bietet einen translationalen Vorteil für die gastrointestinale Forschungsmodellierung.

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

Die vorliegende Studie berichtet über ein einfacheres, zeitsparendes und wirtschaftliches Protokoll zur effizienten Isolierung und Züchtung von primären humanen Brustepithelzellen (HMECs) aus kleinen Mengen von Brustgewebe. Dieses Protokoll eignet sich für die schnelle Herstellung von primären HMECs sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen.

Isolierung und Kultivierung primärer humaner Brustepithelzellen

Erfahren Sie die Kultivierung von Enteroiden aus neonatalem Darmgewebe zur Untersuchung der Wirkung von Muttermilch auf die intestinale Zellproliferation. Diese Methode ermöglicht wertvolle Einblicke in gastrointestinale Erkrankungen.

Muttermilch fördert Wachstum der Enteroids: ein Ex-Vivo -Modell der Zellproliferation

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