Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Vollfeldmessung des neuronalen Volumens in vitro mit submikrometrischer axialer Auflösung zu ermöglichen, die für die Analyse von Neuriten in dynamischen Strukturen erforderlich ist, die am neuronalen Wachstum beteiligt sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der zellulären Neurowissenschaften bezüglich der Dynamik von Volumenänderungen auf der subsididalen Skala während der Nichtwachstums- oder Axondegeneration zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine submikrometrische axiale Auflösung in Kombination mit einer vollständigen Anpassungsbeobachtung und einer Zeitskala auf Stunden oder Tage bietet.

Um den Vorgang zu starten, entformen Sie den PDMS-Block unter einer chemischen Haube, indem Sie Isopropanol darauf gießen. Stellen Sie es anschließend auf die Edelstahlbank der Dunstabzugshaube. Schneiden Sie um den Silikonwafer herum und entformen Sie die PDMS-Replik.

Schneiden Sie dann um den Chip herum und lassen Sie mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge einen Rand von zwei Millimetern. Stanzen Sie den Einlauf, indem Sie den Locher mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern fest andrücken und betätigen, um das Loch des Einlaufs zu schneiden und zu schnitzen. Machen Sie dasselbe an den vier dedizierten Zonen des Chips, in die die Flüssigkeit eingespritzt wird.

Reinigen Sie anschließend den Chip, indem Sie das Klebeband auf der mikrostrukturierten Seite aufkleben und abziehen. Isopropanol auf beide Seiten streuen. Anschließend wird der Span mit einer Druckluftpistole mit unter Druck stehendem Stickstoff getrocknet.

Bei diesem Verfahren legen Sie jedes Deckglas auf einen Schleuderlacker, der sich in einer Reinraumumgebung befindet. Tragen Sie einen Tropfen des positiven Fotolacks auf, um etwa 75 % des Deckglases zu bedecken, und schleudern Sie ihn 30 Sekunden lang bei 4000 U/min, um eine endgültige Dicke von 0,45 Mikrometer zu erreichen. Legen Sie die Deckgläser für eine Minute auf eine Herdplatte mit einer Oberflächentemperatur von 115 Grad Celsius.

Belichten Sie jedes Deckglas mit einem Masken-Aligner bei einer Wellenlänge von 435 Nanometern durch die entsprechende Maske entsprechend den Herstellungsparametern. Bereiten Sie dann zwei Kristallisationsschalen aus Glas vor, von denen eine den Entwickler ohne Verdünnung und die andere deionisiertes Wasser enthält. Tauchen Sie die Deckgläser nacheinander eine Minute lang in den Entwickler, während Sie die Kristallisationsform kontinuierlich und vorsichtig umrühren.

Tauchen Sie dann den Wafer etwa fünf Sekunden lang in entionisiertes Wasser. Übertragen Sie den Wafer auf ein saugfähiges Papier und trocknen Sie ihn mit unter Druck stehendem Stickstoff mit einer Druckluftpistole. Platzieren Sie sowohl den PDMS-Chip als auch die Glasschale, auf der er geklebt werden soll, zur Oberflächenaktivierung in der Plasmakammer.

Geben Sie anschließend einen Tropfen Wasser auf einen rechteckigen dicken Objektträger aus Mikroskopglas und kleben Sie das Deckglas durch Kapillarität auf den Objektträger. Markieren Sie unter einem Mikroskop die Position der Fotolackstreifen auf der Rückseite des Objektträgers. Legen Sie das gemusterte Glasdeckglas auf den Maskenhalter des Masken-Aligners.

Verlassen Sie sich auf die Markierung, um die Fotolack-Referenzobjekte zu zentrieren. Um den optischen Kontrast zu erhöhen, platzieren Sie einen Siliziumwafer unter dem PDMS-Chip. Der Siliziumwafer sollte während des Ausrichtungsprozesses fest am Chuck befestigt bleiben.

Platzieren Sie dann den PDMS-Chip auf dem mobilen Substrathalter des Masken-Aligners. Heben Sie anschließend das Spannfutter so weit an, dass sowohl der Chip als auch das Array der Fotolackstreifen auf dem Deckglas sichtbar werden, während Sie hinter dem mechanischen Kontakt bleiben. Führen Sie eine Ausrichtung durch und stellen Sie einen mechanischen Kontakt zwischen dem Chip und dem Deckglas her, indem Sie das Spannfutter anheben, bis die Oberfläche der PDMS-Säulen das Glasdeckglas berührt.

Danach das Spannfutter absenken. Entfernen Sie das mit dem Chip verklebte Deckglas vom Maskenhalter. Legen Sie das Gerät dann in eine 35-Millimeter-Petrischale und geben Sie alles für fünf bis zehn Minuten in den Ofen, um die Haftfestigkeit zu erhöhen.

Dreißig Minuten nach dem Verkleben platzieren Sie eine mit PLO-Lösung gefüllte Pipettenspitze mit zehn Mikrolitern am Einlass. Füllen Sie dann die Flüssigkeit ein, bis sich ein Tropfen bildet. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang am Auslass und an den Behältern.

Anschließend PBS in die Petrischale rund um den Chip geben. Verschließen Sie die Petrischale mit einem Paraffinfilm und inkubieren Sie sie mindestens fünf Stunden lang bei Raumtemperatur. Drücken Sie dann einen Kegel mit einer Zehn-Mikroliter-Spitze leicht in jedes Injektionsloch und saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit auf.

Ersetzen Sie als Nächstes PLO sowie das PBS, das den Chip umgibt, durch das Kulturmedium. Legen Sie den Chip anschließend in den Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid reguliert ist, bis die Neuronen mit einer Inkubationszeit von mindestens fünf Stunden ausgesät sind. Bei diesem Verfahren wird das Nährmedium aus dem Chip entnommen.

Sammeln Sie zwei bis drei Mikroliter der frisch resuspendierten Zelllösung und injizieren Sie sie am Einlass. Wiederholen Sie sofort den gleichen Vorgang an der Steckdose. Injizieren Sie etwa das gleiche Volumen des Kulturmediums in jedes Reservoir.

Beobachten Sie den Chip schnell unter dem Mikroskop, um die Dichte der Zellen zu überprüfen. Die Größenordnung der optimalen Zelldichte entspricht etwa fünf bis zehn Zellen innerhalb der quadratischen Fläche, die durch vier Säulen begrenzt ist. Wiederholen Sie das Verfahren der Injektion von 0,5 bis 1 Mikroliter Zellsuspension, um die angestrebte Zelldichte zu erreichen.

Ersetzen Sie für die Bildgebung das Kulturmedium durch das Bildgebungsmedium. Legen Sie dann den Chip unter ein Epifluoreszenzmikroskop. Erfassen Sie Bilder von Zellen von einzelnen bis zu mehreren aufeinanderfolgenden Bildern im Falle von Zeitraffer-Experimenten.

Hier sind die repräsentativen Beobachtungen eines Kalibrierungs-Fotolackstreifens und von Neuronen dargestellt. Bilder mit höherer Vergrößerung und Querschnitte dieser Objekte werden auf der rechten Seite angezeigt. Dargestellt sind hier die repräsentativen Neuriten und eine drei Mikrometer hohe Zentralkammer.

Das Volumen der Neuritenscheibe kann als Funktion der Neuritenbreite berechnet werden. Und hier sind die repräsentativen Wachstumskegel und eine drei Mikrometer hohe zentrale Kammer. Ihre Substrukturen treten deutlich aus einem optischen Hintergrundrauschen von etwa 20 Nanometern hervor.

Zeitrafferbeobachtungen von Neuronen aus dem Zeitraffer, die in eine 12 Mikrometer hohe Kammer ausgesät wurden, um den Zyklus des Schrumpfens und der Reaktivierung des Wachstumskegels innerhalb einer Zeitskala von wenigen Dutzend Minuten zu verfolgen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Zugang zu einer Tiefionenätzanlage zu haben, um den Siliziumschlamm herzustellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Deckglas aus strukturiertem Glas mit einem PDMS-Chip ausrichten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik reproduzierbar auf die Quantifizierung der Neurologie in 3D angewendet werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Pharmakologie den Weg, um die Wirkung verschiedener Medikamente mit tatsächlichem Kaliber zu erforschen, alle in geschlossener Kegelform. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primären Neuronen viel Sorgfalt erfordert, um Kontaminationen und Zertrümmerungen zu vermeiden.

Seien Sie beim Medienwechsel immer vorsichtig und schnell, um die Zeit, die sie außerhalb des Inkubators verbringen, zu begrenzen.