Name: Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Erfahren Sie die hochauflösende Volumenbildgebung von Neuronen mit der Fluoreszenz-Ausschluss-Methode und mikrofluidischen PDMS-Chips. Diese Technik ermöglicht präzise Analysen von Neuriten und neuronalen Wachstumsprozessen.

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Die Autoren ChiLab, Materialien und Microsystems Labor - Politecnico di Torino - DISAT, in der Person von Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza und Dr. S L Marasso, bestätigen möchten für ihre wertvolle Unterstützung bei der Prozessentwicklung und Gerät Herstellung. Wir danken Victor Racine von Quantacell für Diskussion und Unterstützung in der Bildverarbeitung. Wir sind dankbar, Isabelle Grandjean und Manon Chartier von Animal Facility des Institut Curie für ihre Unterstützung für Mäuse, und Pablo Vargas und Ana-Maria Lennon (Institut Curie) für die Bereitstellung von uns mit der GFP LifeAct Mäusen. Wir sind dankbar, Olivier Thouvenin vom Institut Langevin und Clotilde Cadart, Larisa Venkova und Matthieu Piel vom Institut Curie - UMR 144, für ihre Hilfe für das Verständnis der Fluoreszenz unter Ausschluss Methode. Zu guter Letzt danken wir die technologische Plattform der Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) für ihre Unterstützung in Microfabrication. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der europäischen Forschung Rat Advanced Grant Nr. 321107 "CellO" PSL Université (SwithNeuroTrails Projekt), ANR Investissement Avenir und IPGG Labex und Equipex.

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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Volumen-Bildgebung von Neuronen stellt eine Herausforderung für die FXm-Technik durch die langen und dünnen Erweiterungen dieser Zellen. Dieses Protokoll beschreibt Varianten des gleichen Typs von mikrofluidischen Gerät Neuron Bildgebung gewidmet.
Neben den Aspekten von mikrofluidischen Design die Wahl des Ziels ist von grundlegender Bedeutung für die Fluoreszenz Ausgrenzung Bildgebung und impliziert einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und die Bildschärfe. Es hat 13 gezeigt, dass eine hohe NA führt zu einer Tiefenschärfe kleiner als die Höhe der Kammer war nicht nachteilig für die Präzision der Volumenmessung, wenn Bildgebung mit Schwerpunkt durchgeführt wurde und wenn ein ausreichender Spielraum zwischen die Kontur des Objekts der ich gelassen wird Geschäftsgelegenheiten und die Grenzen der Integration Oberfläche. Allerdings beeinträchtigt die Verwendung einer Kammer deutlich höher als die Schärfentiefe der Bildschärfe durch Photon Diffusion, welche glättet die Kanten der Objekte von Interesse. Die Herstellung einer hohen Kammer mit 3 µm reduziert das seitliche Weichzeichnen und lieferte außergewöhnlich gut definierten fluoreszierende Ausgrenzung Bilder auch mit hohen NA (0,8) 40 X Ziele neuronale Verzweigungen mit hoher Ortsauflösung zu visualisieren.
Chip-Montage ist ein entscheidender Schritt, insbesondere bei 3 µm hohen Kammern, aber vorsichtig Manipulation wie unter 4.1.2 vermeidet den Zusammenbruch des Daches. Die hohe Fläche zum Volumenverhältnis, diese dünnen Kammern zugeordnet Frage auch die der Stabilität der Dextran Konzentration im Laufe der Zeit. Wir haben überprüft, ob die Oberflächenabsorption der Dextran nach einer Nacht der Inkubation unbedeutend war: nach Dextran durch PBS ersetzt, der Unterschied der Intensität zwischen der Säule und der Hintergrund war etwa 1 pro 1000 der Anfangsintensität Kontrast zwischen Diese beiden Regionen in Anwesenheit von Dextran. Beachten Sie, dass Neuronen auf der Unterseite Deckglas und auf dem Dach des PDMS halten können. Dieser Effekt verschwindet, wenn mit gemusterten Deckgläsern (d. h. wenn wir nicht anhaftende Moleküle innerhalb der PDMS-Kammer inkubieren), wie die Beschichtung auf der Unterseite der Kammer daher streng lokalisiert.
Abgesehen von ihrer anspruchsvollen Morphologie Neuronen eignen sich eher für FXm aufgrund der Tatsache, dass eine erhebliche Einschränkung der Methode, d. h. Dextran Endozytose, sehr begrenzt ist in diesen Zellen. Wir wählen eine 10 kDa Formulierung langfristig unterdrücken reichen (in Stunden) sichtbaren Endozytose Phänomene.
Zusammenfassend ist die konzeptionelle Einfachheit der FXm durch eine Reihe von experimentellen Probleme ausgeglichen, die durch dieses Protokoll, z. B. nanometrischen PDMS Rauheit und mikrometrische Kammer Höhe oder Untergrundkorrektur für die Unebenheiten korrigieren gelöst wurden die PDMS Decke zwischen Säulen. Die Verwendung einer engen mikrofluidischen Kammer zu beschränken, das fluoreszierende Medium führt jedoch ein paar spezifische Einschränkungen wie die Notwendigkeit der Unterstützung Säulen, die die wirksame Oberfläche für Zelladhäsion oder die Notwendigkeit der zentralen Soma ausschließen senkt Kammer, neuronale Erweiterungen mit der höchsten Klarheit zu beobachten, die Regionen der Zelle für hochauflösende Beobachtung zugänglich einschränkt. Eine mögliche Weiterentwicklung dieser Methode wäre get rid of dieser physischen Entbindung durch eine optische ersetzt werden. Die Neuentwicklung des Lichtblattmikroskopie könnte in Zukunft vorteilhaft mit FXm kombiniert werden.

Die genaue Kenntnis der zellulären Volumen hat erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, angetrieben von der Frage der Zelle Größe Homöostase in einzelnen-celled Mikroorganismen 1 und ganz allgemein in der mitotischen Zellen 2. Allerdings ist die Frage des Zellvolumens relevant auch für Post-mitotischen Zellen, für die Neuronen ein Paradebeispiel dar.
Volumen ist in der Tat eine wichtige Unterschrift der physiologischen und pathologischen Veranstaltungen auf verschiedenen Skalen und Zeitpunkten im neuronalen Leben von transienten axonalen Verformung elektrische Aktivität (Millisekunden Skala) 3 , die irreversible zugeordnet neuronale Schwellung auftreten während der asymptomatischen Phase der neurodegenerativen Erkrankungen (über Jahre beim Menschen) 4. Allerdings tritt die größte Volumenänderung in Zwischenzeit Maßstab von Tagen oder Wochen (abhängig von der betrachteten Organismus) während des neuronalen Wachstums. Die ausgedehnte und komplexe Morphologie der Neuronen wirft Fragen auf ein Vielfaches, unter denen die Regulierung der Zellengröße. Axonalen Länge und Durchmesser sind in der Tat streng regulierten in Vivo, mit Werten spezifisch für jedes neuronaler Typ 5,6.
Diese Fragen, komplex, um in Vivo, Adresse können auch in vereinfachter Form angesprochen werden in-vitro-. In diesem Ziel eine Methode gewidmet Volumenmessung schnell genug Wachstumsdynamik (d. h. in einer Zeitskala von Minuten) und kompatibel mit Beobachtung über Stunden oder Tage zu folgen ist erforderlich. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu einer direkten oder indirekten Zugriff auf zelluläre Volumen in Vitroentwickelt. Zelle Rekonstruktion von confocal Imaging ist einer von ihnen, aber diese Methode impliziert Etikettierung und wiederholten Expositionen gegenüber Licht und zeigt eine begrenzte axiale Auflösung von ca. 500 nm 7. Beachten Sie, dass diese zwei letzten Nachteile durch eine anspruchsvolle und aktuelle Methode namens Gitter Licht-Blatt Mikroskopie 8teilweise überwunden werden. Atomic Force Microscopy hat gebrauchte 9 aber diese Scan-Methode ist durch Wesen langsam und mühsam. Darüber hinaus kann der Körperkontakt, die, den es mit der Zelle erfordert, die Messung, wenn man bedenkt die extreme Weichheit der Neuronen 10beeinträchtigen. Indirekte Methode mittels Impedanz oder Resonanz haben für verschiedene Zelltypen 11, aber sind nicht ausreichend für erweitert anhaftende Zellen wie Neuronen eingesetzt.
Eine der vielversprechendsten Methoden basiert auf das Maß der ausgeschlossenen Volumen von Zellen in einer engen Kammer gefüllt mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Die Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) ist einfach in seinem Prinzip, da es erfordert keine Kennzeichnung und eignet sich für schnelle, langfristige optische Bildgebung der Zell-Populationen mit einer potenziell Sub optische axiale Auflösung. Genauer gesagt, hängt die Auflösung in z die maximale Fluoreszenzintensität in der Kultur-Kammer (d. h. in Region frei von Zellen) geteilt durch den Dynamikbereich der Kamera, obwohl mehrere Schallquellen dieser ultimative Auflösung begrenzen. Diese Methode ist sehr mächtig, das Volumen der Migration von adhärenten Zellen 12 folgen oder Volumenänderung während der Mitose von Säugerzellen, wie gründlich in 13beschrieben zu studieren gewesen. Neuronen bilden jedoch eine methodische Herausforderung für FXm unter Berücksichtigung ihrer umfangreichen Verzweigung in Sub mikrometrische Prozesse.
Wir stellen Ihnen hier eine Methode führt zur Herstellung von glatten FXm Kammern zugänglich mit hoher Präzision die Lautstärke und Höhe des neuronalen Verzweigungen und dynamische Strukturen neuronale Wachstum wie Wachstum Kegel beteiligt.
Kammern müssen ähnliche Höhen als das Objekt zu messen, um axiale Auflösung optimieren. Daher haben wir verschiedene FXm-Geräte zeichnen sich durch zentrale Messung Kammern mit drei verschiedenen Höhen entwickelt. Die dünnste (3 µm in der Höhe) widmet sich der Neurit Messung: dieser niedrigen Höhe schließt Soma, die bleiben in der in der Nähe von 15 µm hohen Zwischenkammer. Dickere zentrale Kammern (10 und 12 µm) sind hoch genug, um die ganze Zelle Wachstum folgen. Das Gerät beinhaltet auch zwei Reservoirs befindet sich auf beiden Seiten der zentralen Kammer. Vier Löcher in Injektion (IH) sind so umgesetzt und werden wie folgt bezeichnet: den Einlass und Auslass einzuführen die zellulären Suspensionen in den Chip dienen, während die beiden anderen Stauseen ernähren.
Wir haben erste fabrizierten Kalibrierung Deckgläsern für Höhenmessungen mit Fotolack Strukturen der bekannter Geometrie. Wir haben dann frei wachsenden Neuronen, sondern auch morphologisch abhängigen Neuronen in Micropatterns der Adhäsion abgebildet.

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Zur Durchführung von DRIE</td></tr><tr><td>MJB4 Mask Aligner</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 Photolithographie</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Mask Aligner</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Photolithographie in Verbindung mit DRIE</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturhaube</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 37 > C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Inkubator</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Ofen zwischen 65 und 80 > C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mechanisches Profilometer</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Profilometer</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Durchmesser 200 mm</td></tr><tr><td>Ultraschallbad-Ultraschall-Ultraschallbad-Ultraschallgerät</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>Volumen des Bads: 0,8 Liter</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Masken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Zusatzdaten</td></tr><tr><td>Su8 Maske 1</td><td></td><td></td><td>Zusatzdaten</td></tr><tr><td>Su8 Maske 2</td><td></td><td></td><td>Zusatzdaten</td></tr><tr><td>Su8 Maske 3</td><td></td><td></td><td>Zusatzdaten</td></tr><tr><td>S1805 Kalibrierung </td><td></td><td></td> Streifen <td>Ergänzende Daten</td></tr><tr><td><stark>Kleine Laborgeräte</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm Locher</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (US-Referenz)</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell oder Rasierklinge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9" Edelstahl Flachspatel mit Löffel</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>Zum Entformen PDMS</td></tr><tr><td>Top Lip Wafer Handling</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>FST</td><td>Dumont #7 Pinzette - Standard / Dumoxel</td><td>Zur Manipulation von Glasdeckgläsern</td></tr><tr><td><stark>Substraten</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliziumwafer</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm Glasdeckgläser</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>Photolacke und Entwicklungs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 positiver Photoresist</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Vor dem DRIE-Prozess Dicken 1,8 & Mikro; m</td></tr><tr><td>AZ 351B Entwickler</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Entwicklung des positiven Fotolacks AZ 1518</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA Entwickler</td><td>Technic</td><td></td><td>Entwicklung des SU-8 Negativ-Fotolacks</td></tr><tr><td>Microposit S1805 Resist</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Positiver Fotolack wird verwendet, um 0,5 & Mikro zu erhalten; m hohe Strukturen</td></tr><tr><td>MF 26A Entwickler</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Zur Entwicklung von positivem S1805 Photoresist</td></tr><tr><td>Laborverbrauchsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einwegpipette aus Kunststoff 3 mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 Petrischalen</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Spritze</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Transparentes Klebeband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadratische Tücher</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Kunststoff-Paraffinfolie</td></tr><tr><td><stark>Chemikalien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorsilan</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS und Härter Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Polyornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99,8</td></tr><tr><td>%3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML(</td><td>C4H5O2)-(CH2)3-Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>essigsäure</td><td>Sigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10kW konjugiert mit Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absorption bei 488 nm</td></tr><tr><td>Dextran 10kW konjugiert mit Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absorption bei 647 nm</td></tr><tr><td>Culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal ohne Phenolrot</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine in Matlab zur Hintergrundnormalisierung</td><td>Quantacell</td><td>Kontaktieren Sie Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Um einen spezifischen ROI auszuwählen für Bildanalyse</td></tr><tr><td>Routine</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Ergänzende Daten</td></tr><tr><td>Routine</td><td>Matlab</td><td></td><td>Ergänzende Daten</td></tr></tbody></table>

hochauflösende volume imaging von neuronen durch den einsatz von fluoreszenz-ausschluss methode und mikrofluidischen geräten gewidmet

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen auf unterschiedlichen Zeitskalen. Neuronen sind ziemlich einzigartig Zellen über ihre erweiterte verzweigten Morphologien und erhöhen folglich mehrere methodische Herausforderungen für Volumen-Messung. Im besonderen Fall von in-vitro- neuronale Wachstum sollte die gewählte Methodik Sub mikrometrische axiale Auflösung, kombiniert mit Vollfeld Beobachtung auf Zeitskalen von Minuten, Stunden oder Tage umfassen. Im Gegensatz zu anderen Methoden wie Zelle Form Wiederaufbau mit konfokale Bildgebung, elektrisch-basierten Messungen oder Atomic Force Microscopy hat die neu entwickelte Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) das Potenzial, diese Herausforderungen zu erfüllen. Obwohl es einfach in seinem Prinzip, erfordert jedoch Umsetzung einer hochauflösenden FXm für Neuronen, mehrere Anpassungen und eine spezielle Methodik. Wir stellen Ihnen hier eine Methode basiert auf der Kombination von Fluoreszenz Ausgrenzung, niedrig-Rauhigkeit Multi-Fächer mikrofluidischen Geräten und schließlich Micropatterning, in-vitro- Messung der lokalen neuronalen Volumen zu erreichen. Die hohe Auflösung zur Verfügung gestellt vom Gerät konnten wir messen das lokale Laufwerk von neuronalen Prozessen (Neuriten) und die Lautstärke etwas spezifischer Strukturen neuronale Wachstum, wie Wachstum Kegel (GCs) beteiligt.

Das Ergebnis des Prozesses der Herstellung in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben wird anhand der Bilder der Figur 1A-1 b und die Kurve der Abbildung 1. Die Tabelle der Abb. 1 zeigt die Rauheitskennwerte von zwei verschiedenen repräsentativen Bereichen der PDMS-Chip, d. h. in den Mittel-und 20 µm hoch nächste Zwischenkammer. Eine Abnahme der Rauheit um einen Faktor von etwa 7 eingeholt wurde mit geätzten Si-Wafer statt SU-8 Fotolack. FXm wurde dann zuerst auf ein Photoresist Streifen aus bekannter Geometrie (Abbildung 2A) innerhalb einer 10 µm hohe Kammer angewendet. Nach der Bildverarbeitung und Intensität zur Höhe Umkehr (siehe das Diagramm der Abbildung 2 b), FXm Profile durchgeführt auf Querschnitte entlang dieser Streifen (Abbildung 2) bieten die gewünschte Höhenprofile (Abb. 2D). Abb. 2D zeigt den Vergleich zwischen den Profilen mit mechanischen Profilometry und FXm Methoden erzielt. Diese Profile, einschließlich Rand und Plateau, sind sehr ähnlich, Validierung der Methode. Beachten Sie, dass die Streuung der FXm Daten nicht repräsentativ für die ultimative Auflösung der Methode, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4, beurteilt, sondern ergibt sich aus der geringen Intensität eingesetzt, um eine mögliche Wirkung von dem sehr schwachen zu vermeiden Auto-Fluoreszenz von Photolack in der GFP-Kanal.
Dann beobachteten wir Neuriten in 3 µm und 10 µm hohen Kammern (Abbildung 3). Die Standardabweichung der Hintergrundgeräusche ist etwa 18 nm nach Intensität, Höhe-Konvertierung und Hintergrund-Korrektur. Dieser Wert ist etwas höher als der physische Rauheit des PDMS Flächen gegossen auf Silizium-Oberflächen (12 nm, siehe Abbildung 1) aber viel niedriger als die Rauheit auf PDMS gemessen von SU-8 Formen erhalten. Diese Ergebnisse zeigen den Mehrwert der Bohren von Brunnen in Silizium-Wafer, anstatt Löcher in SU-8 Photoresist Säulen werfen zu öffnen. Ein niedriger Wert erlaubt ein high-Signal zu Rauschverhältnis und sehr klare Bilder in Volumen wie die in Abbildung 3Aangezeigt. Als ein Beispiel für die Daten, die aus solchen Bildern abgerufen werden können, berechnet das Volumen von 1,6 µm (d.h. 10 Pixel) breite Neuriten (siehe das Diagramm der Abbildung 3 b) in Scheiben schneiden. Verwendung in erster Näherung eine lineare Anpassung dieser Daten bietet einen mittlere Neuriten Höhenwert von etwa 400 nm, verglichen mit z.B. der axonale Durchmesser 500 nm in 10 Tage alten Welpen innerhalb der Corpus Callosum- 5 gefunden. Wir haben auch FXm mit Micropatterns Adhäsion bestehend aus seriell verschweißten 2 µm und 6 µm breite Streifen von 30 µm Länge kombiniert. Unser Ziel war die Untersuchung des Einflusses der Neurit Breite auf die 3D-Form. Abbildung 3 zeigt eine 3D Darstellung in der falschen Farbe eine ganze Neuron Bild in einer großen Kammer 10 µm. Neuriten verbreiten auf 2 µm und 6 µm breite Streifen, während die Soma auf die Extremität der größte Streifen befindet. Höhenprofile wurden in drei verschiedenen Querschnitten gezogen. In Übereinstimmung mit der Grafik in Abbildung 3Aangezeigt die Oberfläche über die Erhöhung der Querschnitte mit der Neurit Breite (Abbildung 3D) integriert.
Wir weiters Wachstum Kegel (GC) 3D-Strukturen. Abbildung 4 A-B zeigt zwei verschiedene GC Profile erhalten in einer 3 µm hohe Kammer, die ihre verzweigten Unterkonstruktion hervorheben. Darüber hinaus führten wir Zeitraffer Experimente durchführen, um die Dynamik des Volumens der GCs in einer 12 µm hohe Kammer zu folgen. Abbildung 4 zeigt einen Zyklus der schrumpfenden und Reaktivierung einer bestimmten GC innerhalb einer Zeitskala von ein paar Dutzend Minuten. Durch den Einsatz von GFP-Lifeact Mäusen waren Wachstum Kegel in der GFP Emissionswellenlänge lokalisiert (510 nm) von ihrer hohen Aktin-Konzentration. Die Oberfläche bei der Wellenlänge identifiziert wurde verwendet, um über die Dextran Emissionswellenlänge bei 647 integrieren nm um GC Volumen zu berechnen. Abbildung 4 zeigt die Verteilung der GC Volumen an Ort zu verschiedenen Zeitpunkten schließlich auf drei verschiedene Neuronen, zentriert auf einen Wert von ca. 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Abbildung 1: FXm PDMS Kammern. (A) Regelungen der vier verschiedenen wichtigsten Schritte der Mikrofabrikation führt in die endgültige Form. Die Lage der Einlass, Auslass und Stauseen sind angegeben. Skalieren Sie Bars: 1 mm. (B) Bild der PDMS FXm Kammer unter Verwendung einer optische Profilometer. Dieses Bild zeigt die zentrale Kammer mit 3 Reihen von 10 µm hohen Säulen und die Mittelstufen Kammern von 20, 50 und 90 µm in der Höhe. Maßstabsleiste: 500 µm. (C) Querschnittsansicht des Chips an die beiden gestrichelten Linien gezeichnet (B). Gelb/Gold: Querschnitt entlang Säulen, blau: Querschnitt zwischen den Säulen. (D) bedeuten die PDMS Rauheit Messwerte auf 50 × 50 µm-2 -Gebieten auf Silizium und auf 20 µm hohen SU-8 Zwischenkammer geformt (siehe Pfeile für den Standort dieser Bereiche). Mittelwerte wurden aus den Messungen von drei verschiedenen Bereichen erhalten. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Abbildung 2: Kalibrierung der FXm-Methode mit einem Fotolack Streifen als das Objekt des Interesses. (A) GLP-Fluoreszenz-Aufnahme in einer 10 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm bei 1 mg/mL. (B: Hintergrund, P: Säule). Beobachtung mit einem trockenen 40 X NA 0,8 Ziel. Maßstabsleiste: 50 µm. (B) lineare Kalibrierung Recht entnommen die mittlere Intensität der beiden farbigen Rechtecke dargestellt in A. (C) Fluoreszenz Intensität Profil bezogen auf der Ebene der blau gestrichelten Linie dargestellt (A), überqueren den Fotolack Streifen (0,45 µm hohen positiven Photoresist). (D) Vergleich der gewonnenen mechanischen Profilometer (schwarze Punkte) und FXm nach Intensität, Höhe Konvertierung der Daten (b) (blaue Punkte) Profile. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Abbildung 3: Neurit Volume Imaging. (A) Neurit erstreckt sich in die zentrale 3 µm hohe Kammer von Soma befindet sich in den nächsten 15 µm Zwischenkammer. Bildgebung durchgeführt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm und 40 X, NA 0,8 trocknen Ziel. Der Inset erhalten nach dem Gebrauch den Hintergrund Reduktion Routine Highlights die beiden Neuriten und gewählt, um das Diagramm auf der rechten Seite zu plotten. Skalieren Sie Bars: 30 µm. (B) Neurit Slice Volumen als Funktion der Neurit breite gewonnenen 22 Profile (Durchschnitt auf 10 Pixel, d. h. auf einem 1,6 µm "Neurit Slice") in (A) gezeigt. Die durchgezogene Linie stellt eine lineare Anpassung der Neigung 0,4 µm durch den Ursprung. (C) Falschfarbenbild eines gemusterten Neurons auf einen selbstklebenden Streifen hergestellt aus aufeinanderfolgenden 2 µm und 6 µm breite Stümpfe (in weiß dargestellt). Messungen wurden in einer 10 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 647 nm und mit einer 40 X NA 0,8 trocknen Ziel. (D) Höhenprofilen entsprechend farbige Striche angezeigt (c), halten die gleiche Farbcode. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Abbildung 4: statische und dynamische Wachstum Kegel Bildgebung. (A-B) Wachstum Kegel Höhenprofile erhalten in einer großen Kammer 3 µm nach Intensität zur Umkehr Höhe entlang der gelben Linien im zugehörigen Bilder angezeigt. Beobachtung durchgeführt, mit einer Füllung mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm und 40 X, NA 0,8 trocknen Ziel. (C) ganze Neuron Bildgebung in einer 12 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 647 nm. Beobachtungen wurden in zwei fluoreszierende Kanäle: GFP für Wachstum Kegel Lokalisierung (gelb gestrichelt) und CY5 um GC Volumen von Fluoreszenz Ausgrenzung zu berechnen. Die Oberfläche enthalten gelb gestrichelt wurde zur GC Volumen zu berechnen. Die Grafik zeigt die Variation des GC Volumen über Zeit und damit verbundenen Morphologien in GLP und CY5 Kanäle zu zwei repräsentative unterschiedlichen Zeitpunkten. Alle Daten wurden übernommen, mit einer 40 X NA 0,8 trocknen Ziel alle 3 min. Maßstabsleisten: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>1:8 µm Schicht Maske</td>
			<td>Maske 02:30 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 u/min</td>
			<td>30 s @ 3050 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition-Energie</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer 12 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 20, 50 und 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Maske 01:10 µm Schicht</td>
			<td>Maske 02:30 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 u/min</td>
			<td>30 s @ 3050 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition-Energie</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer von 10 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 20, 50 und 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Maske 01:12 µm Schicht</td>
			<td>Maske 02:32 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
			<td>30 s @ 2500 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Belichtungszeit</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer 3 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 18, 50 und 90 µm.
Ergänzende Daten 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematische Darstellung der Masken verwendet, um das PDMS-Gerät (DRIE Maske und Masken 1-3) zu fabrizieren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 2: Datei "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektronische Dateien ermöglicht, um die DRIE Maske und Masken 1-3 zu fabrizieren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektronische Dateien ermöglicht, um die Maske für die Fotolithografie Photoresist Streifen zu fabrizieren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 4: conversion_mattotiff.m-Datei <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Daten 5: importfilevol.m-Datei <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Zellen. Wir beschreiben eine fluoreszierende Ausschluss-Methode, flächenhafte Messung von in-vitro- neuronale Volumen mit Sub mikrometrische axiale Auflösung benötigt für die Analyse von Neuriten und dynamische Strukturen in neuronale Wachstum impliziert.

Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Vollfeldmessung des neuronalen Volumens in vitro mit submikrometrischer axialer Auflösung zu ermöglichen, die für die Analyse von Neuriten in dynamischen Strukturen erforderlich ist, die am neuronalen Wachstum beteiligt sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der zellulären Neurowissenschaften bezüglich der Dynamik von Volumenänderungen auf der subsididalen Skala während der Nichtwachstums- oder Axondegeneration zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine submikrometrische axiale Auflösung in Kombination mit einer vollständigen Anpassungsbeobachtung und einer Zeitskala auf Stunden oder Tage bietet.Um den Vorgang zu starten, entformen Sie den PDMS-Block unter einer chemischen Haube, indem Sie Isopropanol darauf gießen. Stellen Sie es anschließend auf die Edelstahlbank der Dunstabzugshaube. Schneiden Sie um den Silikonwafer herum und entformen Sie die PDMS-Replik.Schneiden Sie dann um den Chip herum und lassen Sie mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge einen Rand von zwei Millimetern. Stanzen Sie den Einlauf, indem Sie den Locher mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern fest andrücken und betätigen, um das Loch des Einlaufs zu schneiden und zu schnitzen. Machen Sie dasselbe an den vier dedizierten Zonen des Chips, in die die Flüssigkeit eingespritzt wird.Reinigen Sie anschließend den Chip, indem Sie das Klebeband auf der mikrostrukturierten Seite aufkleben und abziehen. Isopropanol auf beide Seiten streuen. Anschließend wird der Span mit einer Druckluftpistole mit unter Druck stehendem Stickstoff getrocknet.Bei diesem Verfahren legen Sie jedes Deckglas auf einen Schleuderlacker, der sich in einer Reinraumumgebung befindet. Tragen Sie einen Tropfen des positiven Fotolacks auf, um etwa 75 % des Deckglases zu bedecken, und schleudern Sie ihn 30 Sekunden lang bei 4000 U/min, um eine endgültige Dicke von 0,45 Mikrometer zu erreichen. Legen Sie die Deckgläser für eine Minute auf eine Herdplatte mit einer Oberflächentemperatur von 115 Grad Celsius.Belichten Sie jedes Deckglas mit einem Masken-Aligner bei einer Wellenlänge von 435 Nanometern durch die entsprechende Maske entsprechend den Herstellungsparametern. Bereiten Sie dann zwei Kristallisationsschalen aus Glas vor, von denen eine den Entwickler ohne Verdünnung und die andere deionisiertes Wasser enthält. Tauchen Sie die Deckgläser nacheinander eine Minute lang in den Entwickler, während Sie die Kristallisationsform kontinuierlich und vorsichtig umrühren.Tauchen Sie dann den Wafer etwa fünf Sekunden lang in entionisiertes Wasser. Übertragen Sie den Wafer auf ein saugfähiges Papier und trocknen Sie ihn mit unter Druck stehendem Stickstoff mit einer Druckluftpistole. Platzieren Sie sowohl den PDMS-Chip als auch die Glasschale, auf der er geklebt werden soll, zur Oberflächenaktivierung in der Plasmakammer.Geben Sie anschließend einen Tropfen Wasser auf einen rechteckigen dicken Objektträger aus Mikroskopglas und kleben Sie das Deckglas durch Kapillarität auf den Objektträger. Markieren Sie unter einem Mikroskop die Position der Fotolackstreifen auf der Rückseite des Objektträgers. Legen Sie das gemusterte Glasdeckglas auf den Maskenhalter des Masken-Aligners.Verlassen Sie sich auf die Markierung, um die Fotolack-Referenzobjekte zu zentrieren. Um den optischen Kontrast zu erhöhen, platzieren Sie einen Siliziumwafer unter dem PDMS-Chip. Der Siliziumwafer sollte während des Ausrichtungsprozesses fest am Chuck befestigt bleiben.Platzieren Sie dann den PDMS-Chip auf dem mobilen Substrathalter des Masken-Aligners. Heben Sie anschließend das Spannfutter so weit an, dass sowohl der Chip als auch das Array der Fotolackstreifen auf dem Deckglas sichtbar werden, während Sie hinter dem mechanischen Kontakt bleiben. Führen Sie eine Ausrichtung durch und stellen Sie einen mechanischen Kontakt zwischen dem Chip und dem Deckglas her, indem Sie das Spannfutter anheben, bis die Oberfläche der PDMS-Säulen das Glasdeckglas berührt.Danach das Spannfutter absenken. Entfernen Sie das mit dem Chip verklebte Deckglas vom Maskenhalter. Legen Sie das Gerät dann in eine 35-Millimeter-Petrischale und geben Sie alles für fünf bis zehn Minuten in den Ofen, um die Haftfestigkeit zu erhöhen.Dreißig Minuten nach dem Verkleben platzieren Sie eine mit PLO-Lösung gefüllte Pipettenspitze mit zehn Mikrolitern am Einlass. Füllen Sie dann die Flüssigkeit ein, bis sich ein Tropfen bildet. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang am Auslass und an den Behältern.Anschließend PBS in die Petrischale rund um den Chip geben. Verschließen Sie die Petrischale mit einem Paraffinfilm und inkubieren Sie sie mindestens fünf Stunden lang bei Raumtemperatur. Drücken Sie dann einen Kegel mit einer Zehn-Mikroliter-Spitze leicht in jedes Injektionsloch und saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit auf.Ersetzen Sie als Nächstes PLO sowie das PBS, das den Chip umgibt, durch das Kulturmedium. Legen Sie den Chip anschließend in den Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid reguliert ist, bis die Neuronen mit einer Inkubationszeit von mindestens fünf Stunden ausgesät sind. Bei diesem Verfahren wird das Nährmedium aus dem Chip entnommen.Sammeln Sie zwei bis drei Mikroliter der frisch resuspendierten Zelllösung und injizieren Sie sie am Einlass. Wiederholen Sie sofort den gleichen Vorgang an der Steckdose. Injizieren Sie etwa das gleiche Volumen des Kulturmediums in jedes Reservoir.Beobachten Sie den Chip schnell unter dem Mikroskop, um die Dichte der Zellen zu überprüfen. Die Größenordnung der optimalen Zelldichte entspricht etwa fünf bis zehn Zellen innerhalb der quadratischen Fläche, die durch vier Säulen begrenzt ist. Wiederholen Sie das Verfahren der Injektion von 0,5 bis 1 Mikroliter Zellsuspension, um die angestrebte Zelldichte zu erreichen.Ersetzen Sie für die Bildgebung das Kulturmedium durch das Bildgebungsmedium. Legen Sie dann den Chip unter ein Epifluoreszenzmikroskop. Erfassen Sie Bilder von Zellen von einzelnen bis zu mehreren aufeinanderfolgenden Bildern im Falle von Zeitraffer-Experimenten.Hier sind die repräsentativen Beobachtungen eines Kalibrierungs-Fotolackstreifens und von Neuronen dargestellt. Bilder mit höherer Vergrößerung und Querschnitte dieser Objekte werden auf der rechten Seite angezeigt. Dargestellt sind hier die repräsentativen Neuriten und eine drei Mikrometer hohe Zentralkammer.Das Volumen der Neuritenscheibe kann als Funktion der Neuritenbreite berechnet werden. Und hier sind die repräsentativen Wachstumskegel und eine drei Mikrometer hohe zentrale Kammer. Ihre Substrukturen treten deutlich aus einem optischen Hintergrundrauschen von etwa 20 Nanometern hervor.Zeitrafferbeobachtungen von Neuronen aus dem Zeitraffer, die in eine 12 Mikrometer hohe Kammer ausgesät wurden, um den Zyklus des Schrumpfens und der Reaktivierung des Wachstumskegels innerhalb einer Zeitskala von wenigen Dutzend Minuten zu verfolgen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Zugang zu einer Tiefionenätzanlage zu haben, um den Siliziumschlamm herzustellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Deckglas aus strukturiertem Glas mit einem PDMS-Chip ausrichten.Einmal gemeistert, kann diese Technik reproduzierbar auf die Quantifizierung der Neurologie in 3D angewendet werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Pharmakologie den Weg, um die Wirkung verschiedener Medikamente mit tatsächlichem Kaliber zu erforschen, alle in geschlossener Kegelform. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primären Neuronen viel Sorgfalt erfordert, um Kontaminationen und Zertrümmerungen zu vermeiden.Seien Sie beim Medienwechsel immer vorsichtig und schnell, um die Zeit, die sie außerhalb des Inkubators verbringen, zu begrenzen.

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.

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Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.

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Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen.

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Hier präsentieren wir eine Mikroskopie-basiertes Protokoll für hochauflösende Bildgebung und eine dreidimensionale Rekonstruktion der Maus neurovaskuläre Einheit und Blut - Hirn-Schranke mit Gehirn frei schwebenden Abschnitten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung, Analyse und Quantifizierung der intrazellulären Organellen an der BBB.

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Plastik-Chips zu Kultur und primäre murine Neuronen in Schubladen. Diese Chips sind vormontiert, benutzerfreundlich und kompatibel mit hoher Auflösung, live und Fluoreszenz-Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt die Platte Ratte hippocampal Neuronen innerhalb dieser Chips und strömungstechnische Isolation, Axotomie und Immunostaining durchführen.

Einsatz von vormontierten Kunststoff mikrofluidischen Chips für Abschottung primäre Murine Neuronen

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.

Langzeitbildgebung identifizierter neuronaler Populationen mit Mikroprismen bei frei beweglichen und kopffixierten Tieren

Erfahren Sie die hochauflösende Volumenbildgebung von Neuronen mit der Fluoreszenz-Ausschluss-Methode und mikrofluidischen PDMS-Chips. Diese Technik ermöglicht präzise Analysen von Neuriten und neuronalen Wachstumsprozessen.

Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet (Video) | JoVE Journal

Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet

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