Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Synthese und Reinigung von chiralen Aminoalkoholen, bei denen es sich um Verbindungen mit einem breiten Anwendungsspektrum handelt, von chiralen Hilfsstoffen für die organische Synthese bis hin zur pharmazeutischen Therapie. Dies ist ein ergiebiges Messgerät, um Zugang zu chiralem Aminoalkohol zu erhalten, der aus der natürlichen Aminosäure Lysin in zwei oder drei enzymatischen Schritten in einem einteiligen Verfahren gewonnen wird. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind die Einfachheit des Protokolls und die Effizienz der Reinigungsschritte.

Verfahren wird von Aurelie Fossey-Jouenne, der Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Um das dihydroxilierte Lysinderivat zu synthetisieren, geben Sie Hepespuffer, L-Lysin, Alpaquita-Glutarsäure, Natriumascorbat und mehr Salz in einen 250-ml-Erlenmyer-Kolben. Fügen Sie dann Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 ml hinzu, wobei Sie das Volumen der hinzuzufügenden Enzymlösung berücksichtigen.

Die Deoxygenase KD-01 wird in eine Endkonzentration von 0,075 mg pro ml gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur bei 300 U/min für die entsprechende Dauer geschüttelt. Nach dem Mischen werden 10mcl des Reaktionsgemisches in ein 1,5 ml Ependorf-Röhrchen überführt.

Fügen Sie dann Aquias-Natriumbicarbonatlösung, Ethanol und 2,5 mg DNFB-Lösung pro ml in Ethanol hinzu. Schließen Sie das Mikroröhrchen und schütteln Sie die Lösung 1 Stunde lang bei 1000 U/min und 65 Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie eine Minizentrifuge, um die Lösung abzusetzen.

Das Reaktionsgemisch mit 10mcl 1M Hydrochlroinsäure abschrecken. Wirbeln Sie die Lösung vor und verwenden Sie dann eine Minizentrifuge, um sie abzusetzen. Filtrieren Sie die Mischung mit einer 1-ml-Köderspritze über einen unsterilen Spritzenvorsatzfilter mit einem Durchmesser von 4 mm und einer hydrophilen Polyvinyliden-Fluoridmembran mit einer Größe von 0,22 mcm.

Legen Sie anschließend die abgeleitete Reaktionsgemischprobe in ein HPLC-Gerät. Injizieren Sie 10mcl in die C-18-Säule Verwenden Sie eine UV-Detektion bei 400 Nanometern, um das Produkt zu analysieren. Wenn die Reaktionsüberwachung eine abgeschlossene Reaktion anzeigt, geben Sie Alphaquita-Glutarsäure, Natriumascorbat und mehr Salz in den Kolben.

Die Deoxygenase KD-02 wird in eine Apporoximat-Endkonzentration von 0,5 mg pro ml gegeben. Berechnet unter Verwendung des anfänglichen Reaktionsvolumens. Schütteln Sie das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur bei 300 U/min 18 Stunden lang.

Wenn die Reaktionsüberwachung eine abgeschlossene Reaktion anzeigt, fügen Sie dem Reaktionsgemisch 100 mcl 100 Millimolar DTT hinzu. Plus 100mcl von 100 Millimolar PLP. Geben Sie gereinigte Decarboxylase Dccpin in einer ungefähren Endkonzentration von 0,5 mg pro ml zu.

Berechnet unter Verwendung des anfänglichen Reaktionsvolumens. Schütteln Sie dann das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur bei 300 U/min für 18 Stunden. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, kühlen Sie die Mischung ab, indem Sie den Kolben in ein Eisbad stellen.

Fügen Sie vorsichtig 0,25 ml 6 molare HCL hinzu und schütteln Sie die kalte Reaktionsmischung während der Zugabe vorsichtig. Übertragen Sie nun die acdic-Mischung mit einer Weidepipette aus Glas in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit konischem Boden. Zentrifugieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 1.680-facher Schwerkraft und 4 Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand in einen 250-ml-Rundkolben überführt. Geben Sie anschließend 10 ml entionisiertes Wasser in das Zentrifugenröhrchen mit dem Pellet. Vortex, um das Pellet wieder aufzuwirbeln.

Nach dem Zentrifugieren der Probe wird der Überstand in den Rundkolben überführt, der den ersten Überstand enthält. Die gesammelten Überstände werden eingefroren, indem der Kolben unter ständigem Schwenken von Hand in flüssigen Stickstoff austritt. Bringen Sie den Kolben sofort in einen Tisch-Gefriertrockner, um ein Auftauen des Materials zu verhindern.

Nach Abschluss des Gefriertrocknungsprozesses wird der Kolben aus dem Gefriertrockner genommen und die Reinigungsschritte durchgeführt. Bei der biokatalytischen Decarboxilierung von Monohydroxyl-L-Lysinen zeigte das DC aus S Rhumerentium Aktivität gegenüber allen Monohydroxylysinen. Wo die beste Umwandlung für die drei und fünf Ableitungen der entsprechenden chiralen Hydroxydiamine beobachtet wurde.

Erwartungsgemäß erwies sich Dccpin als am besten geeignet für die Decarboxylierung von 4R-Hydroxy-L-Lysin 2. Unter Standardreaktionsbedingungen war die Umwandlung von 3S-Hydroxy-L-lysin 1 in sein decarboxyliertes Gegenstück 5 mit DCcpin gering. Und es wurde keine Aktivität gegenüber 5R-Hydroxy-L-Lysin beobachtet.

Für die biokatalytische Decarboxylierung von Dehydroxy-L-Lysinen wurden unter den Standardreaktionsbedingungen nur 3R, 4R, Dihydroxy-L-Lysin 3 quantativ in das entsprechende Dihydroxydiamin 7 umgewandelt. Die Umwandlung von 45-Dihydroxy-L-lysin 8 war moderat, wurde aber durch Erhöhung der Enzymbeladung verbessert. Keines der beiden PLP-DC war gegenüber 35-Dihydroxy-L-Lysin 9 aktiv.

Die enzymatischen Kaskadenreaktionen, die eine quantitative Umwandlung aufweisen, wie sie durch HPLC-Monitoring bestimmt wurde, wurden erfolgreich hochskaliert. Die Aminoalkohole wurden aus komplexen enzymatischen Reaktionsgemischen und ausgezeichneten Yeilds gereinigt und mittels NMR charakterisiert. Sobald diese enzymatische Kaskade und die anschließende Reinigung gemeistert sind, kann sie in 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass eine gute Oxygenierung des Reaktionshauptes für die dioxygenierten Reaktionen unerlässlich ist. Sowie eine sorgfältige Überwachung, um sicherzustellen, dass das gesamte Lysin verbraucht wird, bevor die Dicarboxidase hinzugefügt wird. Der Hauptnachteil dieses Protokolls sind begrenzte subventionierte Bereiche des Dioxygenase- und Decarboxylase-Enzyms.

Nichtsdestotrotz kann die biochatalitische Synthese verschiedener Aminoalkohole aus Aminosäuren mit Hilfe eines anderen Satzes von Enzymen erforscht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine enzymatische Kaskadenreaktion durchführt und wie man Aminoalkohole aus komplexen Reaktionsgemischen reinigt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DNFB gefährlich sein kann und ansonsten Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und das Durchführen der Reaktion in einem Abzug getroffen werden sollten.