Eine präklinische Mausmodell der Osteosarkom, die extrazelluläre Vesikel-vermittelter Kommunikation zwischen Tumor und mesenchymalen Stammzellen zu definieren

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, ein präklinisches Mausmodell zu entwickeln, um die Rolle der extrazellulären vesikelvermittelten Kommunikation zwischen Tumor- und mesenchymalen Stammzellen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, mehrere Schlüsselfragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, nämlich wie Tumor- und mesenchymale Stammzellen mittels extrazellulärer Vesikel kommunizieren und ob dies das Fortschreiten der Krebserkrankung unterstützt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die Rolle der mesenchymalen Stammzellanpassung durch Krebs-EVs auf das Fortschreiten und die Metastasenbildung in vivo zu untersuchen.

Die Implikation dieses Verfahrens erstreckt sich auch auf unsere Krebstherapie, da wir GSA verwenden können, um die EV-Kommunikation und die Androgensignalisierung zu stören und das Fortschreiten der Krebserkrankung zu hemmen. Neben Einblicken in die EV-vermittelte Kommunikation beim Osteosarkom kann diese Methode auch auf viele andere Krebsarten angewendet werden. Tatsächlich wird Knochenmark, das aus den mesenchymalen Stammzellen gewonnen wird, leicht an mehr Stellen rekrutiert, wo es sich zu krebsunterstützenden Zellen differenzieren kann.

Beginnen Sie mit der Aussaat von acht 175-Quadratzentimeter-Kolben mit jeweils 3 Millionen 143B-Zellen. Kultivieren Sie die Zellen 36 bis 48 Stunden lang mit EV-abgereichertem Medium. Wenn die Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind, sammeln Sie die Überstände aus den acht Kolben für die EV-Isolierung.

Verwenden Sie anschließend eine Differenzzentrifugation, um alle Zellen und Zelltrümmer aus dem Überstand zu entfernen. Diese besteht aus wiederholten Zentrifugationen bei vier Grad Celsius mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung. Nach jedem Zentrifugationsschritt wird der Überstand aufgefangen und ein Milliliter des Überstands im Zentrifugationsröhrchen zurückgelassen.

Laden Sie nun einen vorgeklärten Überstand mit 38,5 Millilitern pro Röhrchen in Ultrazentrifugenröhrchen. Isolieren Sie dann die Elektrofahrzeuge mit einer Ultrazentrifuge bei 70.000 g für eine Stunde, mit einer langsamen Pause und bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Ultrazentrifugation vorsichtig den Überstand, so dass etwa ein Milliliter zurückbleibt.

Suspendieren Sie dann die EV-haltigen Pellets im verbleibenden Volumen. Bündeln Sie alle Suspensionen. Und waschen Sie die gepoolten Suspensionen mit PBS.

Füllen Sie die Tube auf 38,5 Milliliter. Wiederholen Sie dann den Ultrazentrifugationszyklus, aber verwenden Sie keine Pause. Der Rotor sollte nach etwa einer Stunde aufhören zu drehen.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und lassen Sie 100 bis 200 Mikroliter Lösung übrig. Zum Schluss resuspendieren Sie das EV-Pellet und stellen Sie das endgültige Volumen mit PBS auf 200 Mikroliter ein. Die EVs können dann durch TEM charakterisiert, mit Farbstoffen für Aufnahmeexperimente markiert oder zur Ausbildung mesenchymaler Stammzellen für In-vivo-Experimente verwendet werden.

Es ist entscheidend, dass die primären MSCs die richtige Zelldichte haben, bevor sie Krebs-EVs ausgesetzt werden. Die Zelle sollte zu etwa 70 % konfluent sein, um ein optimales EV-Verhältnis der Zellen zu erreichen und auch ein Überwachsen während der Bildungszeiten zu verhindern. Dieses Experiment verwendet akklimatisierte adulte Athymic Nude-Foxn1nu Mäuse.

Einen Tag vor dem chirurgischen Eingriff Paracetamol über das Trinkwasser verabreichen. Bereiten Sie am Tag der Operation 143B-Zellen mit 200.000 pro Mikroliter PBS vor. 20 Minuten vor der Operation das Tier mit Buprenorfin versorgen.

Befüllen Sie kurz vor der Anästhesie eine 10-Mikroliter-Spritze mit den konzentrierten 143B-Zellen. Nachdem Sie die richtige Anästhesie bestätigt und Augensalbe aufgetragen haben, positionieren Sie das Tier auf dem Rücken mit den Hinterbeinen in Richtung des Bedieners. Befestigen Sie als Nächstes eine Anästhesiemaske am Tier.

Beugen Sie dann das linke Knie und wischen Sie die Haut mit drei abwechselnden Peelings aus 70 % Ethanol und Povidon-Jod ab und tragen Sie dann 2 % Lidocain als lokales Analgetikum auf. Machen Sie nun einen kleinen Schnitt in die Haut direkt unterhalb des Knies, um das Schienbein freizulegen. Machen Sie dann mit einem 0,8-Millimeter-Mikrotwist-Bohrer ein Nadelloch in das Schienbein, etwa 2 Millimeter unterhalb des Knies.

Vermeiden Sie es, durch beide Tibiarinde zu bohren. Fahren Sie fort, indem Sie langsam einen Mikroliter Zellen über einen Zeitraum von etwa fünf Sekunden in das Loch injizieren. Verschließen Sie dann das Loch mit einem Tropfen Gewebekleber, um einen Rückfluss der Suspension zu verhindern.

Schließen Sie die Operation ab, indem Sie die Haut mit Nähten und einem Tropfen Gewebekleber verschließen. Lassen Sie das Tier sich durch Erhitzen erholen und behandeln Sie es 24 Stunden lang mit Paracetamol. Verwenden Sie zwei Tage später eine 0,5-Millimeter-Insulinspritze, um die MSCs in die Schwanzvene zu injizieren.

Die korrekte Verabreichung während einer Schwanzveneninjektion kann visuell bestätigt werden. Wenn ein weißer Bereich auftritt oder Sie auf einen Widerstand stoßen, injizieren Sie bitte erneut an einem Bereich oberhalb der vorherigen Injektionsstelle. Verfolgen Sie dann zweimal pro Woche das Tumorwachstum mittels Biolumineszenz.

Injizieren Sie den Mäusen D-Luciferin über eine Insulinspritze und messen Sie 10 Minuten später den von den Tumorzellen erzeugten Photonenfluss mit einem bildgebenden System. Wenn der Tumordurchmesser eines Tieres größer als 15 Millimeter wird oder sein Gewichtsverlust 15 % übersteigt, schläfern Sie das Tier ein und sammeln Sie alle relevanten Gewebe. 10 Minuten vor der Einschläferung D-Luciferin injizieren, wie es vor der Bildgebung geschehen ist.

Nach der Euthanasie entnehmen Sie Lunge, Leber, Milz und Nieren mit einer sterilisierten Schere und Pinzette. Waschen Sie das Blut aus den Organen mit PBS und ordnen Sie sie für die Bildgebung auf einer Petrischale an. Dokumentieren Sie mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem beide Seiten der Organe.

Sobald die Bilder aufgenommen wurden, fixieren Sie die Organe sofort für die zukünftige histologische Analyse. Um die Fotodokumente zu verarbeiten, wenden Sie einfach einen manuellen Schwellenwert an und zählen Sie die Anzahl der Knötchen in jedem Foto. Achten Sie darauf, für jedes Foto den gleichen Schwellenwert zu verwenden und das Gewebe aus allen Richtungen zu dokumentieren, insbesondere die Lunge.

Nach der Entkalkung des Schienbeins der Maus fahren Sie mit der Dehydrierung und der Paraffineinbettung fort. Verwenden Sie dann ein Mikrotom, um Sechs-Mikron-Paraffinschnitte vorzubereiten, und sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern. Sobald die Objektträger getrocknet sind, lagern Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur.

Führen Sie am nächsten Tag eine wärmevermittelte Antigen-Entnahme mit Citratpuffer durch. Färben Sie dann das Gewebe mit Anti-GFP-Antikörpern bei eins bis 900 und anschließend mit einer DAPI-Gegenfärbung. Dokumentieren Sie abschließend die gefärbten Gewebeschnitte mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Die Reinheit der isolierten EVs wurde durch Elektronenmikroskopie bestätigt. Die Präparate enthielten Vesikel mit einem Durchmesser zwischen 40 und 100 Nanometern. Um zu beurteilen, ob Krebs-EVs mit MSCs interagieren, wurden die EVs mit einem grün fluoreszierenden lipophilen Linkerfarbstoff markiert und über Nacht mit MSCs inkubiert.

Die effiziente Einführung von Elektrofahrzeugen durch MSCs wurde damit bestätigt. Eine immunmodulatorische Eigenschaft von EVs auf MSCs wurde mit Hilfe eines Multiplex-B-basierten Zytokin-Immunoassays bestätigt. Tumor-EVs verursachten eine erhöhte IL-8- und IL-6-Produktion in MSCs im Vergleich zu humanen Fibroblasten-Kontroll-EVs.

Als nächstes wurde in einem orthotopen Xenotransplantat-Mausmodell des Osteosarkoms gezeigt, dass Mäuse, die mit EV-gebildeten MSCs behandelt wurden, das Tumorwachstum beschleunigten. Vier Tage nach der systemischen Injektion von GFP-exprimierenden MSCs wurden GFP-exprimierende Zellen im Knochenmark und im Tumorgewebe nachgewiesen, was ein MSC-Homing zur Tumorstelle zeigt. Ex-vivo-Bildgebungen verschiedener Organe zeigten die Bildung von Lungenknoten.

Letztendlich wiesen Mäuse, die EV-gebildete MSCs erhielten, mehr Lungenmetastasen auf. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Stromazellen ex vivo mit Krebs-EVs aufklärt und die Auswirkungen von gebildeten Stromazellen in vivo anhand präklinischer Mausmodelle untersucht. Sobald dieses Verfahren gemeistert ist, kann es innerhalb von vier Wochen durchgeführt werden, vorausgesetzt, es stehen genügend Krebs-EVs zur Verfügung.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, vorausschauend zu planen und eine reproduzierbare Reinigung der extrazellulären Vesikel des Krebses zu erreichen, sowie proliferierende mesenchymale Stammzellen mit geringer Passage zu verwenden.