Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Immunfluoreszenzfärbung mit der DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf einem 3D-funktionalisierten Draht zu kombinieren und Immunphänotyp- und FISH-Signale auf dem Träger mit einem herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der sezernierenden Charakterisierung von Tumorzellen zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung therapiebezogener Ziele auf zirkulierenden nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es die gleichzeitige Identifizierung von phänotypischen Parametern wie EpCAM-Positivität und zytosomatischen Veränderungen wie dem ARC-Genstatus ermöglicht, um mutmaßliche CTCs zu erkennen.

Obwohl diese Methode speziell entwickelt wurde, um in situ CTC-Merkmale von Insulinkrebs bereitzustellen, kann sie auch auf die Untersuchung anderer Krebsarten wie Brustkrebs angewendet werden. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, während wir mit dem Draht für die direkte Immunphänotypisierung und den CTC-Nachweis gearbeitet haben. Um mehr Daten zu erhalten, haben wir ein Immunphänotypisierungsprotokoll mit einem DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokoll verknüpft.

Die Handhabung des Drahtes ist nicht einfach, vor allem, weil die funktionalisierte Spitze zerbrechlich ist. Bei einer visuellen Demonstration werden die Leser die Schritte nachvollziehen. Zu Beginn des Experiments wird der gesamte Inhalt eines T75-Kolbens, der in einem Fünf-Milliliter-Fläschchen zu 80 % zusammenfließt, mit vier Millilitern vollständigem Medium resuspendiert.

Entfernen Sie als Nächstes den Draht aus der Glasverpackung. Tauchen Sie den funktionalisierten Goldteil des Drahtes in das Fläschchen und stellen Sie sicher, dass der Drahtstopfen wasserdicht für ein Fünf-Milliliter-Fläschchen passt. Versiegeln Sie den Draht mit Laborfolie.

Inkubieren Sie den Draht dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Rohrrotator. Spülen Sie den Draht nach der Drehung dreimal in einer einfachen PBS-Lösung mit drei verschiedenen sauberen Fläschchen und warten Sie, bis der Draht getrocknet ist. Nachdem Sie den Draht 10 Minuten lang in einer Haube an der Luft getrocknet haben, fixieren Sie die Zellen, indem Sie den Draht 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 100%ige Acetonlösung in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen tauchen.

Stellen Sie sicher, dass sich keine Spuren von Aceton auf der funktionalisierten Spitze befinden. Trocknen Sie den Draht fünf Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Waschen Sie den Draht anschließend in einer Fünf-Milliliter-Tube zweimal in einem Falten-PBS.

Inkubieren Sie den Draht in Antikörperverdünnungspuffer. Bereiten Sie 150 Mikroliter Antikörpermischung mit einer Verdünnung aus monoklonalem Primärantikörper, konjugiert mit Fluorochrom, und Antikörperverdünnungspuffer vor, die im Datenblatt angegeben sind. Verwenden Sie dann eine P200-Spitze, um den Draht aus dem Drahtstopper zu ziehen, und führen Sie den Draht vorsichtig durch das größere Loch der Spitze ein.

Führe zuerst das unfunktionalisierte Ende ein und ziehe den Draht langsam durch das kleinere Loch, bis der Goldteil knapp hinter dem größeren Loch ist. Geben Sie vorsichtig 150 Mikroliter des Antikörpermixes in die Spitze. Um die Gefahr der Blasenbildung zu vermeiden, drehen Sie den Draht vorsichtig, bis das funktionalisierte Ende vollständig eingetaucht ist.

Verschließen Sie das Loch der Spitze und wickeln Sie Laborfolie um das Loch. Inkubieren Sie den Draht vertikal über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Blockieren Sie am zweiten Tag die Antikörperinkubation, indem Sie den Draht zweimal in einfachem PBS waschen.

Stecken Sie den Draht wieder in den Drahtstopper. Drei Stunden vor dem DNA-FISH-Protokoll stellen Sie den Hybridisierungsofen auf 75 Grad Celsius und den Trockenhitzeschrank auf 37 Grad Celsius ein. Kühlen Sie die 0,4-fache SSC-Lösung auf vier Grad Celsius ab.

Waschen Sie den Draht dreimal in eiskalter 0,4-facher SSC-Lösung. Trocknen Sie den Draht 10 Minuten lang im Dunkeln unter dem Abzugsschrank. Nach 10 Minuten die Sonde fünf Sekunden lang wirbeln und drehen.

Lassen Sie 10 Mikroliter der Sonde in Mikroröhrchen aus Glas fallen und decken Sie diese dann mit Laborfolie ab. Wickeln Sie die Mikroröhrchen in trockenes, saugfähiges Papier ein. In eine 50 Milliliter Tube geben und kurz schleudern.

Legen Sie den getrockneten Draht vorsichtig in das Mikroröhrchen und setzen Sie den Drahtstopfen ein. Versiegeln Sie dann den Drahtstopper mit Gummizement. Legen Sie den Draht für acht Minuten bei 75 Grad Celsius in eine dunkle, feuchte Kammer im Hybridisierungsofen, um eine vollständige DNA-Denaturierung zu erhalten.

Nach acht Minuten stellen Sie die Feuchtkammer über Nacht in einen trockenen Backofen bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie den Objektträger-Färbebehälter mit der 0,4-fachen SSC-Lösung in ein auf 72 Grad Celsius eingestelltes Wasserbad. Überprüfen Sie die Temperatur der 0,4-fachen SSC-Lösung, bis sie 72 plus oder minus ein Grad Celsius erreicht.

Bereiten Sie als Nächstes zwei Bechergläser vor. Eine mit zweifachem SSC plus 0,05%iger Tween-Lösung und die zweite mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie die Feuchtkammer für den Ofen mit trockener Hitze.

Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig den Gummizement vom Drahtstopper und ziehen Sie das unbeschichtete Ende des Drahtes durch den Endstopper, wobei Sie darauf achten müssen, die funktionalisierte Spitze nicht zu beschädigen. Tauchen Sie den Draht zwei Minuten lang bei 72 Grad Celsius in die 0,4-fache SSC-Lösung. Waschen Sie den Draht in zweifachem SSC plus 0,05%iger Tween-Lösung für 30 Sekunden bei Raumtemperatur.

Waschen Sie dann den Draht in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Trocknen Sie den Draht unter dem Abzug 10 Minuten lang im Dunkeln. Inkubieren Sie die funktionalisierte Spitze des Drahtes mit zuvor vorbereiteter DAPI-Lösung in einem Zwei-Milliliter-Fläschchen.

Spülen Sie den Draht zweimal in einem Falt-PBS ab und trocknen Sie den Draht an der Luft. Positionieren Sie den Draht in der Drahthalterung und führen Sie die funktionalisierte Spitze vorsichtig durch den Eintrittspunkt der speziellen Halterung ein, bis die Spitze mit dem Kupplungspunkt übereinstimmt. Setzen Sie die spezielle Halterung auf den Mikroskoptisch.

Stellen Sie den Fokus des Mikroskops mit einer 20-fach-Linse ein. Fokussieren Sie sich zunächst grob auf die spezielle Unterstützung und passen Sie dann fein an Zellen an, die im DAPI-Kanal hell erscheinen. Fokussieren Sie nur die Küvetten mittig des Objektivs und nehmen Sie Bilder mit einer 12-Bit-Digitalkamera in 20x- und 40x-Objektiven mit entsprechenden Filtern für rote, grüne und blaue Sonden auf.

Bereiten Sie schließlich den Draht für die Langzeitlagerung vor, indem Sie den Draht neben die funktionalisierte Spitze packen und den Draht vorsichtig in ein Glasröhrchen einführen. Lagern Sie den Draht vertikal oder horizontal bei minus 20 Grad Celsius. Die Immunfluoreszenzfärbung beeinflusste die DNA-FISH-Signale nicht.

Als der Immun-DNA-FISH-Assay auf dem 3D-Träger-funktionalisierten Draht durchgeführt wurde, war die EpCam-Färbung deutlich sichtbar. Die ALK-Sonde deckte die Gendeletion auf. Die NCI-H3122-Zelllinie zeigte einen aberranten LAK-Genstatus im Gegensatz zu NCI-H1975 mit einem Wildtyp-ALKG.

Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in insgesamt neun Arbeitsstunden über drei Tage durchgeführt werden. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, den funktionalisierten Teil des Drahtes nicht zu berühren, um Schäden zu vermeiden. Nach diesem Protokoll können verschiedene Antikörper und FISH-Sonden verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Zellen mit anderen phänotypischen Markern und anderen zytogenetischen Veränderungen wie NAT- oder HAR2-Genamplifikation.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie gleichzeitig mutmaßliche CTCs anhand phänotypischer Parameter wie EpCAM-Positivität identifizieren und zytogenetische Veränderungen wie den ARC-Genstatus nachweisen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Aceton und Ofen äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie der Griff mit Aceton in der Kapuze und das Tragen von Schutzhandschuhen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.